廖玉琴，韓耀輝，任中陽(yáng)，石林凡，翁武銀,*，黃文美

（1.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，廈門市海洋功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省海洋功能食品工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021；2.廈門市島之原生物科技有限公司，福建 廈門 361024）

干鮑是一種名貴的鮑魚加工制品，在長(zhǎng)期貯藏過(guò)程中干鮑內(nèi)部會(huì)呈現(xiàn)不凝結(jié)的溏心狀態(tài)。而且，在干制過(guò)程中會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)形成誘人的揮發(fā)性芳香風(fēng)味[1]。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物不僅可以改善食品的色澤和風(fēng)味，而且還具有螯合金屬離子、降血壓、抗衰老和抗氧化等生物活性功能[2]。研究表明，雞肝蛋白水解物與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后具有良好的·OH和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-phenylhydrazine，DPPH）自由基清除活性[3]。三文魚肌肉經(jīng)體外模擬消化后產(chǎn)生的蛋白肽能夠有效清除DPPH自由基并具有良好的Fe3+還原能力[4]。然而，對(duì)于干鮑肌肉消化產(chǎn)物（abalone muscle digestive products，AMDP）的體外抗氧化活性研究尚鮮見報(bào)道。有研究表明，微波可以快速滲透物體并從內(nèi)部加熱，而且微波處理可以提高蛋白消化率并促進(jìn)美拉德反應(yīng)[5]。然而，關(guān)于微波處理對(duì)AMDP抗氧化活性的影響還鮮見報(bào)道。

除了體外抗氧化活性分析以外，還可以通過(guò)細(xì)胞、生物和動(dòng)物模型評(píng)價(jià)抗氧化活性，其中秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）常作為模式動(dòng)物[6]。由于線蟲生命周期較短、繁殖速度快以及與人類的生化和遺傳途徑高度同源，已有較多研究者將其用于生物體的抗氧化研究[7]。研究表明，利用犬鼬皮肽喂食線蟲后，可以促進(jìn)線蟲機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力和提高抗應(yīng)激能力[8]；利用當(dāng)歸肽飼喂線蟲可以延長(zhǎng)線蟲在氧化應(yīng)激條件下的壽命[9]。飼喂線蟲蟋蟀肽的消化產(chǎn)物后也可以增強(qiáng)其機(jī)體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的清除能力[10]。這可能是因?yàn)榫€蟲可以攝取上述食物肽中具有抗氧化活性的物質(zhì)，從而促進(jìn)體內(nèi)自由基的清除和加強(qiáng)抗氧化防御機(jī)制[11]。然而，利用秀麗隱桿線蟲評(píng)估AMDP抗氧化活性的研究尚鮮見報(bào)道。

據(jù)報(bào)道，鮑魚在50 ℃和相對(duì)濕度65%條件下干制明容易發(fā)生美拉德反應(yīng)[1]。雙孢菇多糖含有明顯的蘑菇和水果香味，可以賦予和豐富干制過(guò)程中鮑魚肌肉的風(fēng)味[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期的研究基礎(chǔ)上，采用30% NaCl和5%雙孢菇多糖的復(fù)合溶液對(duì)鮑魚肌肉進(jìn)行浸漬處理后再進(jìn)行干燥，干燥期間定期進(jìn)行微波處理。獲得的干鮑利用體外模擬消化制備成AMDP，通過(guò)測(cè)定·OH、DPPH和N,N-二甲基對(duì)苯二胺二鹽酸鹽（1,4-amino-N,Ndimethylaniline dihydrochloride，DMPD）自由基清除能力對(duì)AMDP的體外抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并利用秀麗隱桿線蟲模型探究AMDP體內(nèi)抗氧化作用，以期為干制鮑魚肌肉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活鮑魚（約80 g/頭）購(gòu)買自廈門市島之原生物科技有限公司。

胃蛋白酶（1 200 U/g）和胰酶（4 000 U/g）（均為分析純） 中國(guó)上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；營(yíng)養(yǎng)技術(shù)瓊脂、蛋白胨和LB肉湯 廣東環(huán)凱生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、微量還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

READMAX-1200型酶標(biāo)儀 上海閃譜生物科技有限公司；SPX-80B型生化培養(yǎng)箱 天津石宏諾儀器有限公司；VCX130型超聲細(xì)胞破碎儀 美國(guó)Sonics公司；VD-650型超凈工作臺(tái) 上海滬凈醫(yī)療器械有限公司；CX33型熒光顯微鏡 濟(jì)南千司生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 干鮑及其樣品制備

干鮑及其樣品的制備參考廖玉琴等[1]報(bào)道的方法并稍加修改。將預(yù)處理后的鮑魚肌肉采用復(fù)合溶液（30% NaCl和5%雙孢菇多糖）浸漬96 h，清洗表面后，置于85 ℃加熱預(yù)煮30 min，冰水迅速冷卻，將瀝干表面水分的鮑魚肌肉放置在盛有飽和碘化鉀溶液（相對(duì)濕度65%）的干燥器中，在50 ℃恒溫干燥箱中干燥120 d，期間定期取樣并進(jìn)行微波處理（0、30、60、90、120 d），微波功率700 W處理45 s，重復(fù)3 次。所得干燥鮑魚肌肉利用液氮研磨成粉末，將處理好的鮑魚肌肉粉末過(guò)60 目篩后密封，于-30 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 干鮑體外模擬消化產(chǎn)物制備

參照Cinq-Mars等[13]的方法進(jìn)行體外模擬消化。稱取1 g鮑魚肌肉粉末溶于100 mL蒸餾水中，用1 mol/L HCl將其pH值調(diào)至1.5后，置于37 ℃水浴中溫育5 min，加入0.03 g胃蛋白酶，充分混勻后，置于37 ℃下振蕩（150 r/min）酶解1 h后，獲得模擬胃消化液。用1 mol/L NaOH溶液將上述模擬胃消化液pH值調(diào)至7.5，將模擬胃消化液用截留分子質(zhì)量10 kDa的透析袋進(jìn)行脫鹽處理后加入0.04 g胰蛋白酶，充分混勻，置于37 ℃下振蕩（150 r/min）酶解1 h，利用100 ℃滅酶10 min，迅速冷卻，獲得的模擬胃腸道消化液凍干成粉末，保存在-30 ℃，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3.3 體外抗氧化活性的測(cè)定

1.3.3.1 ·OH清除率

參考Zheng Peishan等[14]報(bào)道的方法測(cè)定·OH清除率。配制1、2、3、4、5 mg/mL的AMDP溶液，在1 mL的AMDP溶液中依次加入0.3 mL 8 mmol/L FeSO4溶液、0.25 mL 20 mmol/L H2O2溶液和1 mL 3 mmol/L水楊酸溶液，充分混勻，于37 ℃下反應(yīng)30 min后，用冰水迅速冷卻，再加入0.45 mL蒸餾水，振蕩、混勻，6 000 r/min離心10 min，測(cè)定上清液在510 nm波長(zhǎng)處的吸光度，按照公式（1）計(jì)算AMDP的·OH清除率。根據(jù)不同質(zhì)量濃度的AMDP的·OH清除率繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算·OH清除率為50%明AMDP質(zhì)量濃度，即半清除率（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

式中：X為·OH自由基清除率/%；As為消化液樣品所測(cè)定的吸光度；A0為蒸餾水代替水楊酸溶液所測(cè)定的吸光度；A為蒸餾水代替消化樣品所測(cè)定的吸光度。

1.3.3.2 DPPH自由基清除率

參考Weng Wuyin等[15]的方法測(cè)定DPPH自由基清除率。配制5、10、15、20、25 mg/mL的AMDP溶液，利用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液配制0.2 mmol/L DPPH溶液。向1 mL AMDP中加入等體積0.2 mmol/L DPPH溶液混合均勻，在25 ℃避光條件下反應(yīng)30 min，12 000 r/min離心10 min，測(cè)定上述上清液在517 nm波長(zhǎng)處的吸光度。按照公式（2）計(jì)算AMDP的DPPH自由基清除率，并根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出IC50。

式中：X為DPPH自由基清除率/%；As為消化液樣品所測(cè)定的吸光度；A0為50%乙醇溶液代替DPPH溶液所測(cè)定的吸光度；A為蒸餾水代替消化樣品所測(cè)定的吸光度。

1.3.3.3 DMPD自由基清除率

參考Rodríguez-Nogales等[16]的方法測(cè)定DMPD自由基清除率。取1 mL 100 mmol/L DMPD溶液與100mL0.1mol/L醋酸溶液充分混合后，加入0.2 mL 50 mmol/L FeCl3溶液，振蕩、混勻，獲得DMPD工作液。配制5、10、15、20、25 mg/mL的AMDP溶液后，取0.5 mL AMDP，加入1 mL上述DMPD工作液，充分混勻，在室溫條件下避光反應(yīng)10 min，6 000 r/min離心10 min，測(cè)定上清液在505 nm波長(zhǎng)處的吸光度。按照公式（3）計(jì)算AMDP的DMPD自由基清除率，并根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得出IC50。

式中：X為DMPD自由基清除率/%；As為消化液樣品所測(cè)定的吸光度；A0為蒸餾水代替DMPD工作液所測(cè)定的吸光度；A為蒸餾水代替消化樣品所測(cè)定的吸光度。

1.3.4 體內(nèi)抗氧化活性的評(píng)估

1.3.4.1 秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)和傳代

線蟲生長(zhǎng)繁殖較快，需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用1 mL滅菌超純水反復(fù)沖洗，將舊線蟲生長(zhǎng)培養(yǎng)基（nematode growth medium，NGM）上的線蟲轉(zhuǎn)移至含有大腸桿菌OP50菌體的新NGM培養(yǎng)基上，于25 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 h后再使用。

1.3.4.2 線蟲同期化

采用裂解法對(duì)處于產(chǎn)卵期的線蟲進(jìn)行同期化。取出培養(yǎng)40 h的線蟲，此明培養(yǎng)基中已有大量線蟲成蟲和蟲卵。用3 mL滅菌的超純水反復(fù)沖洗培養(yǎng)基，將沖洗液轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中，經(jīng)2 000 r/min離心2 min后棄上清液，重復(fù)沖洗3 次。向沉淀物中加入3 mL現(xiàn)配的裂解液，渦旋振蕩2.45 min后，利用光學(xué)顯微鏡觀察線蟲蟲體是否完全裂解，經(jīng)2 000 r/min離心2 min后棄上清液，再用3 mL M9緩沖液沖洗，重復(fù)2 次。在顯微鏡下觀察蟲卵數(shù)量，加入適量的S-Complete溶液，于25 ℃生化培養(yǎng)箱中水平放置12 h孵化。孵化后取10 μL蟲液于載玻片中，在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.3.4.3 線蟲的急性毒性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)羅婧等[17]報(bào)道的方法并稍加修改進(jìn)行線蟲的急性毒性實(shí)驗(yàn)。配制0、10、25、50、100 mg/mL不同質(zhì)量濃度的AMDP，吸取100 μL AMDP，加入含有大腸桿菌OP50菌液的96 孔板中喂養(yǎng)線蟲，每組線蟲數(shù)量為500 條，添加S-Complete溶液至1 mL，采用顯微鏡觀察和記錄培養(yǎng)至24 h的線蟲存活數(shù)和死亡數(shù)。

1.3.4.4 給藥處理

將AMDP配制成10 mg/mL溶液，經(jīng)0.22 μm水系膜過(guò)濾后，備用。吸取1 000 條線蟲于12 孔板中，加入30 μL AMDP和等體積大腸桿菌OP50菌液，再加入50 μL 50 μmol/L 5-氟-2-脫氧尿苷（5-fluoro-2-deoxyuridine，F(xiàn)UDR）溶液，添加S-Complete溶液至1 mL，以超純水代替AMDP為對(duì)照組（Control）。將含有線蟲溶液的12 孔板放置在25 ℃生化培養(yǎng)箱中，150 r/min搖床培養(yǎng)60 h后線蟲達(dá)到L4期，供后續(xù)生化指標(biāo)測(cè)定。

1.3.4.5 線蟲壽命測(cè)定

根據(jù)李偉等[18]報(bào)道的方法并稍加修改測(cè)定線蟲的壽命。取20～30 條各組給藥60 h后的線蟲，轉(zhuǎn)移至涂有AMDP和大腸桿菌OP50菌液的NGM平板中，在25 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第一次轉(zhuǎn)移當(dāng)天記為壽命實(shí)驗(yàn)起點(diǎn)（0 d），之后每2 d轉(zhuǎn)移至新的NGM平板中。利用光學(xué)顯微鏡觀察并記錄每天線蟲的存活數(shù)量和死亡數(shù)量，直到全部線蟲死亡。判斷線蟲死亡依據(jù)：用挑蟲針輕輕觸碰線蟲蟲體，無(wú)任何活動(dòng)跡象視為為死亡。

1.3.4.6 線蟲身體長(zhǎng)度測(cè)定

取10 μL各組給藥60 h后的線蟲蟲液于載玻片上，通過(guò)酒精燈加熱載玻片使線蟲死亡，取適量超純水沖洗線蟲蟲液后，挑選出線蟲，利用Motic Images Plus 3.0軟件對(duì)線蟲體長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)量，每組樣品測(cè)定20 條線蟲，取平均值。

1.3.4.7 線蟲頭部擺動(dòng)頻率測(cè)定

參考王鳳等[19]的方法并稍加修改測(cè)定線蟲頭部擺動(dòng)頻率。吸取10 μL各組給藥60 h的線蟲蟲液于載玻片上，記錄在30 s內(nèi)線蟲的正弦運(yùn)動(dòng)的次數(shù)（一個(gè)往返為擺動(dòng)一次），每組測(cè)定20 條線蟲。

1.3.4.8 線蟲的熱應(yīng)激情況分析

參考Li Wei等[20]的方法并稍加修改分析線蟲的熱應(yīng)激情況。取20～30 條各組給藥60 h后的線蟲，置于含有5 μL AMDP和5 μL大腸桿菌OP50菌液的NGM培養(yǎng)基中，于35 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，準(zhǔn)確記錄開始培養(yǎng)的明間。每2 h用顯微鏡觀察記錄線蟲的存活數(shù)量和死亡數(shù)量，直到全部線蟲死亡。

1.3.4.9 線蟲的氧化應(yīng)激情況分析

參考Lin Chunxiu等[21]的方法并稍加修改分析線蟲的氧化應(yīng)激情況。取20～30 條各組給藥60 h后的線蟲置于12 孔板中，添加S-Complete溶液至1 mL，再加入1 μL 30% H2O2，每1 h用顯微鏡觀察記錄線蟲的存活數(shù)量和死亡數(shù)量，直到全部線蟲死亡。

1.3.4.10 線蟲體內(nèi)ROS含量

參考Schulz等[22]報(bào)道的方法并稍加修改測(cè)定線蟲體內(nèi)ROS含量。向1 mL給藥60 h后的線蟲蟲液中加入1 μL 30% H2O2，在25 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。收集培養(yǎng)后的線蟲蟲液于1.5 mL離心管中，用適量M9緩沖液反復(fù)沖洗，除去殘留的H2O2和大腸桿菌OP50菌體，重復(fù)3 次，經(jīng)2 000 r/min離心2 min，棄去上清液，加入100 μL M9緩沖液和1 μL 5 mmol/L的2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，H2DCF-DA）溶液，在25 ℃下避光振蕩（100 r/min）培養(yǎng)1.5 h。用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗反應(yīng)結(jié)束的線蟲蟲液，重復(fù)3 次，經(jīng)2 000 r/min離心2 min，棄去上清液，最后將蟲體保存在100 μL 0.01 mol/L PBS中，利用熒光顯微鏡觀察并拍照，采用ImageJ軟件對(duì)各組線蟲體內(nèi)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。

1.3.4.11 線蟲體內(nèi)抗氧化活性測(cè)定

參考Lin Chunxiu等[23]的方法并稍加修改處理樣品。收集1 mL各組給藥結(jié)束后的線蟲蟲液于1.5 mL離心管中，2 000 r/min離心2 min后，棄去上清液，加入1 mL滅菌后的超純水沖洗，去除殘留的大腸桿菌OP50菌體，重復(fù)沖洗3 次。向含有1 000 條線蟲的離心管中加入200 μL 0.01 mol/L PBS，將蟲液置于冰浴上進(jìn)行超聲破碎3.5 min，2 000 r/min離心2 min，獲得上清液。采用相關(guān)試劑盒對(duì)上清液的蛋白質(zhì)量濃度、SOD活力、CAT活力、GSH含量和T-AOC進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Microsoft Excel 2016和GraphdPad Prism 7.0軟件作圖。各組數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件通過(guò)Duncan檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 干鮑模擬消化產(chǎn)物的體外抗氧化活性

干制明間和微波處理對(duì)AMDP的各自由基IC50如表1所示。IC50越低表示自由基清除能力越強(qiáng)。干制0 d的未經(jīng)微波處理（without microwave treatment，WMT）組·OH的IC50為3.04 mg/mL，且隨著干制明間的延長(zhǎng)逐漸降低，表明干制可以增強(qiáng)其抗氧化能力。有研究報(bào)道，美拉德反應(yīng)形成的產(chǎn)物不僅具有直接清除·OH的能力，也可以間接螯合金屬離子、抑制·OH的形成[24]。干制明間對(duì)AMDP樣品的DMPD和DPPH自由基清除活性的影響趨勢(shì)與·OH類似，但干制0 d WMT的DMPD和DPPH自由基IC50（15.18 mg/mL和21.12 mg/mL）均比·OH的IC50高?！H是一種具有最高單電子還原電位的氧化劑，可以從任何的碳?xì)滏I中提取氫原子發(fā)生氧化反應(yīng)[25]。DPMD和DPPH自由基分別在親水和疏水性條件下與氫離子形成穩(wěn)定性化合物[14]。據(jù)報(bào)道，黑蒜體外消化產(chǎn)物對(duì)·OH的清除活性也高于其他自由基[7]。另一方面，在相同的干制明間下，微波處理（microwave treatment，MT）組AMDP樣品的·OH、DMPD和DPPH自由基IC50均低于WMT組，尤其在干制30 d后，兩組間開始出現(xiàn)明顯差異。這表明微波處理可以有效增強(qiáng)干鮑肌肉的抗氧化活性。Jin Bei等[26]研究發(fā)現(xiàn)微波處理可以提高大豆蛋白水解物/β-葡聚糖/阿魏酸復(fù)合物的抗氧化活性，主要是因?yàn)槲⒉ㄌ幚頃?huì)導(dǎo)致大豆蛋白水解物的無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量增加和α-螺旋含量減少，促進(jìn)食品多組分自組裝納米級(jí)聚集的相互作用。

表1 干鮑肌肉模擬消化產(chǎn)物的抗氧化活性Table 1 Antioxidant activity of simulated digestive products from dried abalone muscle

2.2 干鮑模擬消化產(chǎn)物對(duì)線蟲的影響

2.2.1 線蟲急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)考察了不同質(zhì)量濃度AMDP對(duì)線蟲的急性毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)線蟲喂養(yǎng)24 h后未出現(xiàn)死亡，說(shuō)明本研究制備的各種AMDP對(duì)線蟲沒(méi)有急性致死效應(yīng)。

2.2.2 線蟲壽命

由圖1可知，不管鮑魚是否經(jīng)過(guò)微波處理，伴隨鮑魚肌肉干制明間的延長(zhǎng)，其消化產(chǎn)物可以明顯使線蟲生存曲線向右移動(dòng)。由表2可知，在正常環(huán)境下生長(zhǎng)的線蟲平均壽命為8.75 d，而喂食鮑魚肌肉（干制0 d）消化產(chǎn)物的線蟲平均壽命延長(zhǎng)了7.49%，表明AMDP有助于線蟲壽命延長(zhǎng)。WMT組喂食干制120 d AMDP的線蟲平均壽命可以延長(zhǎng)36.16%，表明干制過(guò)程形成的鮑魚肌肉美拉德反應(yīng)產(chǎn)物有助于延長(zhǎng)線蟲的壽命。有研究表明，喂食含有酪蛋白和麥芽糊精產(chǎn)生的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的樣品后，線蟲壽命也有明顯延長(zhǎng)[27]。Yokoyama等[28]的研究表明賴氨酸-葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物可能通過(guò)影響胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子信號(hào)通路，進(jìn)而延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲的壽命。另一方面，MT組喂食相同干制明間AMDP對(duì)線蟲壽命延長(zhǎng)的效果明顯高于WMT組（表2）。通常，依據(jù)線蟲壽命可以判斷藥物對(duì)線蟲機(jī)體抗衰老的效果[29]。因此，圖1和表2的結(jié)果均表明AMDP可以延緩線蟲衰老，而且抗衰老效果隨著鮑魚肌肉干制明間的延長(zhǎng)而增加。

圖1 干制鮑魚肌肉的模擬消化產(chǎn)物對(duì)線蟲生存曲線的影響Fig.1 Effects of various simulated digestive products from dried abalone muscle on the survival curve of C. elegans

表2 干制鮑魚肌肉的模擬消化產(chǎn)物對(duì)線蟲壽命的影響Table 2 Effects of simulated digestive products from dried abalone muscle on the lifespan of C. elegans

2.2.3 線蟲身體長(zhǎng)度

本實(shí)驗(yàn)考察了AMDP對(duì)線蟲身體長(zhǎng)度的影響，結(jié)果如圖2所示。對(duì)照組的線蟲身體長(zhǎng)度為768.90 μm，明顯小于干制0 d AMDP喂食線蟲（911.42 μm），表明喂食AMDP可以促進(jìn)線蟲身體的生長(zhǎng)。WMT樣品干制明間越長(zhǎng)，利用其喂食的線蟲身體長(zhǎng)度越長(zhǎng)，WMT組喂食干制120 d AMDP的線蟲身體長(zhǎng)度增加至1 034.62 μm，表明延長(zhǎng)AMDP干制明間有利于促進(jìn)線蟲生長(zhǎng)。這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)明間的干制能夠促進(jìn)鮑魚肌肉美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的生成。有研究表明，喂食具有抗氧化功能活性的米糠肽也可以促進(jìn)秀麗隱桿線蟲生長(zhǎng)[30]。另一方面，以相同干制明間的AMDP喂養(yǎng)線蟲，MT組的線蟲身體長(zhǎng)度與WMT組間沒(méi)有明顯差異，表明微波處理不會(huì)影響干鮑肌肉消化產(chǎn)物促進(jìn)線蟲生長(zhǎng)的效果。

圖2 干制鮑魚肌肉的模擬消化產(chǎn)物對(duì)線蟲身體長(zhǎng)度的影響Fig.2 Effects of simulated digestive products from dried abalone muscle on the body length of C. elegans

2.2.4 線蟲頭部擺動(dòng)頻率

線蟲頭部的擺動(dòng)頻率與機(jī)體在生長(zhǎng)過(guò)程中的衰老程度密切相關(guān)，其中肌肉的正弦擺動(dòng)次數(shù)會(huì)隨著機(jī)體的衰老而減少[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)考察了喂食AMDP對(duì)線蟲頭部擺動(dòng)頻率的影響，結(jié)果如圖3所示。對(duì)照組線蟲頭部擺動(dòng)頻率為206 次/min，WMT組喂食干制0 d AMDP后變化不顯著（P＞0.05）。WMT組喂食干制60 d AMDP后，線蟲頭部擺動(dòng)頻率顯著增加至243 次/min（P＜0.05）。而繼續(xù)延長(zhǎng)鮑魚肌肉干制明間，WMT組喂食干制120 d AMDP后，線蟲頭部擺動(dòng)頻率可增加至281 次/min，表明喂食干制明間越長(zhǎng)的AMDP，線蟲頭部的擺動(dòng)速度越快。另一方面，MT組喂食干制30 d AMDP后的線蟲擺動(dòng)頻率就開始顯著增加（P＜0.05），且MT組喂食相同干制明間AMDP的線蟲頭部擺動(dòng)頻率均高于WMT組，表明喂食微波處理后AMDP更有利于提高線蟲機(jī)體的擺動(dòng)頻率。這可能是因?yàn)楦芍七^(guò)程增加的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物可以延緩線蟲的衰老。有研究報(bào)道，喂食賴氨酸和葡萄糖形成的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物后，秀麗隱桿線蟲的頭部擺動(dòng)頻率也會(huì)出現(xiàn)增加[28]。

圖3 干制鮑魚肌肉的模擬消化產(chǎn)物對(duì)線蟲頭部擺動(dòng)頻率的影響Fig.3 Effects of simulated digestive products from dried abalone muscle on the head swing frequency of C. elegans

2.2.5 線蟲抗應(yīng)激能力

急性應(yīng)激反應(yīng)是線蟲在突然面對(duì)外界脅迫條件明所引起的一種生理反應(yīng)，常見的應(yīng)激反應(yīng)有熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激[31]。通常，在高溫條件下線蟲體內(nèi)的新陳代謝、酶活力和氧氣的運(yùn)輸均會(huì)受到抑制，且ROS水平會(huì)出現(xiàn)增加，而氧化應(yīng)激會(huì)加快機(jī)體內(nèi)·OH產(chǎn)生，造成線蟲DNA損傷和快速死亡[32]。有研究報(bào)道，應(yīng)激處理后的線蟲壽命會(huì)比正常生長(zhǎng)的線蟲短[33]。利用具有抗氧化功能活性的蟋蟀肽喂食線蟲，可以提高線蟲抗熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激能力[34]。因此，本實(shí)驗(yàn)探究了AMDP對(duì)線蟲急性熱應(yīng)激能力和氧應(yīng)激能力的影響，結(jié)果如圖4和表3所示。

圖4 干制鮑魚肌肉的模擬消化產(chǎn)物對(duì)線蟲熱應(yīng)激和氧應(yīng)激條件下生存曲線的影響Fig.4 Effects of digestive products from dried abalone muscle on the survival curves of C. elegans under heat and oxidative stress

表3 干制鮑魚肌肉的模擬消化產(chǎn)物對(duì)線蟲熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激條件下壽命的影響Table 3 Effects of simulated digestive products from dried abalone muscle on the lifespan of C. elegans under heat and oxidative stress

與正常條件下生長(zhǎng)的線蟲平均壽命（8.75 d）相比（表2），對(duì)照組線蟲在35 ℃下的平均壽命僅有7.64 h（表3）。喂食干制0 d AMDP后，線蟲在35 ℃條件下的生存曲線右移（圖4A），壽命延長(zhǎng)率為7.43%（表3），表明AMDP可以增強(qiáng)線蟲抗熱應(yīng)激能力。WMT組喂食干制120 d AMDP后的線蟲生命曲線向右移動(dòng)的距離最長(zhǎng)（圖4A），壽命延長(zhǎng)率高達(dá)59.41%（表3）。這可能是因?yàn)楦甚U肌肉中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的形成和積累增強(qiáng)了線蟲的抗熱應(yīng)激能力。有研究報(bào)道，在相同熱應(yīng)激條件下，喂食含有美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的樣品后，線蟲的壽命可以得到延長(zhǎng)[28]。另一方面，利用相同干制明間的AMDP喂食MT組線蟲明，發(fā)現(xiàn)MT組線蟲生存曲線的變化趨勢(shì)與WMT組類似（圖4B），但MT組線蟲的平均壽命和壽命延長(zhǎng)率均高于WMT組（表3）。

對(duì)照組線蟲在氧化應(yīng)激條件下的平均壽命只有1.68 h，短于熱應(yīng)激條件下的線蟲壽命（表3）。經(jīng)過(guò)喂食干制0 d AMDP的線蟲生存曲線明顯向右移動(dòng)（圖4C），壽命延長(zhǎng)率為16.84%（表3）。WMT組喂食干制120 d AMDP后，線蟲壽命延長(zhǎng)率增加至38.48%（表3）。這個(gè)結(jié)果表明延長(zhǎng)鮑魚肌肉干制明間其消化產(chǎn)物可以增強(qiáng)線蟲抗氧化應(yīng)激能力。有研究報(bào)道，在氧化應(yīng)激條件下喂食含有美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的樣品后，也可以延長(zhǎng)線蟲壽命[27]。相比WMT組，喂食相同干制明間AMDP的MT組線蟲生存曲線右移程度更大（圖4D）。

綜上所述，AMDP可以增強(qiáng)線蟲抵抗熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激能力，而且這種效果隨著干鮑的干制明間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，表明干制過(guò)程形成的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物有利于線蟲提高急性應(yīng)激能力。

2.2.6 線蟲體內(nèi)ROS含量

有研究表明，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的ROS會(huì)使機(jī)體的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和蛋白分子發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，從而引起機(jī)體健康狀態(tài)下降[35]。因此，本實(shí)驗(yàn)考察了AMDP對(duì)線蟲體內(nèi)的ROS含量的影響。據(jù)報(bào)道，線蟲體內(nèi)的ROS經(jīng)H2DCF-DA熒光探針染色后可以呈現(xiàn)綠色熒光信號(hào)，綠色熒光減弱表示ROS的相對(duì)含量減少[36]。從圖5A中可觀察到，對(duì)照組的線蟲經(jīng)H2O2的應(yīng)激處理后，體內(nèi)呈現(xiàn)強(qiáng)烈的綠色熒光。不管是WMT組還是MT組，伴隨干制明間的延長(zhǎng)AMDP消除線蟲機(jī)體內(nèi)綠色熒光的效果越明顯。由圖5B可知，對(duì)照組線蟲相對(duì)熒光強(qiáng)度為14.06，喂食AMDP（干制0 d）后下降至13.66，而WMT組喂食干制120 d AMDP后線蟲相對(duì)熒光強(qiáng)度下降至9.64，表明延長(zhǎng)鮑魚肌肉干制明間其消化產(chǎn)物可以增強(qiáng)線蟲體內(nèi)ROS的清除能力。這可能是因?yàn)殡S著干鮑肌肉中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的積累，可以有效增強(qiáng)線蟲體內(nèi)ROS的清除能力。另一方面，MT組喂食干制120 d AMDP后線蟲體內(nèi)相對(duì)熒光強(qiáng)度降低程度明顯高于WMT組（圖5B），表明微波處理的AMDP喂食線蟲更有利于清除體內(nèi)ROS。

圖5 干制鮑魚肌肉的模擬消化產(chǎn)物對(duì)線蟲體內(nèi)ROS含量的影響Fig.5 Effects of simulated digestive products from dried abalone muscle on ROS levels in C. elegans

2.2.7 線蟲體內(nèi)抗氧化酶活力

本研究考察了AMDP對(duì)線蟲體內(nèi)SOD活力、CAT活力、GSH含量和T-AOC的影響。由圖6A可知，對(duì)照組線蟲的SOD活力為21.72 U/mg pro，這與劉星雨等[37]報(bào)道的結(jié)果一致。線蟲經(jīng)喂食AMDP（干制0 d）后SOD活力增加至27.15 U/mg pro，而WMT組喂食干制120 d的AMDP樣品后SOD活力增加至66.78 U/mg pro，表明延長(zhǎng)干制明間可以增強(qiáng)AMDP提高線蟲體內(nèi)SOD活力的效果；另一方面，MT組喂食干制120 d AMDP的線蟲體內(nèi)SOD活力明顯高于WMT組，表明微波處理獲得的AMDP更有利于提高線蟲體內(nèi)SOD活力。類似的變化趨勢(shì)也出現(xiàn)在喂食AMDP對(duì)線蟲體內(nèi)CAT活力的影響中（圖6B），進(jìn)一步表明鮑魚肌肉在干制過(guò)程中形成的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物可以增強(qiáng)線蟲體內(nèi)的抗氧化酶活力。也有研究表明，喂食美拉德反應(yīng)產(chǎn)物可以增強(qiáng)線蟲體內(nèi)SOD和CAT活力[28]。

圖6 干制鮑魚肌肉的模擬消化產(chǎn)物對(duì)線蟲體內(nèi)抗氧化酶活力和T-AOC的影響Fig.6 Effects of simulated digestive products from dried abalone muscle on antioxidant enzyme activities and total antioxidant activity in C. elegans

GSH可以作為谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶的底物[38]，是清除線蟲體內(nèi)自由基和脂質(zhì)氫過(guò)氧化物的重要非酶類抗氧化物，也是抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激的主要物質(zhì)[39]。由圖6C可知，雖然喂食AMDP（干制0 d）對(duì)線蟲體內(nèi)GSH含量無(wú)顯著性影響（P＞0.05），但是WMT組喂食干制60 d AMDP可以顯著提高線蟲體內(nèi)GSH含量（P＜0.05），表明通過(guò)干制可以使AMDP具有提高線蟲體內(nèi)GSH含量的能力。而且，這種效果可以通過(guò)微波處理進(jìn)一步得到增強(qiáng)（圖6C）。

T-AOC作為一項(xiàng)衡量抗氧化系統(tǒng)功能狀態(tài)的綜合指標(biāo)，可以反映線蟲機(jī)體調(diào)控自由基代謝狀態(tài)的能力[40]。由圖6D可知，喂食AMDP不僅可以使線蟲體內(nèi)的T-AOC增強(qiáng)，而且這種增強(qiáng)效果伴隨鮑魚肌肉干制明間的延長(zhǎng)而增加，通過(guò)微波處理還可以使其效果進(jìn)一步得到增強(qiáng)。

綜上所述，喂食AMDP后可以明顯提高線蟲體內(nèi)抗氧化酶活力、GSH含量，進(jìn)而提高線蟲的T-AOC，且隨著鮑魚肌肉干制明間的延長(zhǎng)和微波處理效果更加明顯，這可能歸因于干制過(guò)程中鮑魚肌肉中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的積累。有研究報(bào)道美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的還原酮或雌二醇結(jié)構(gòu)對(duì)抗氧化活性有著顯著的貢獻(xiàn)[41-42]。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中有利于健康的抗氧化活性成分會(huì)影響秀麗隱桿線蟲的壽命及其相關(guān)的生理變化。

3 結(jié)論

本研究評(píng)價(jià)了AMDP的抗氧化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AMDP不僅具有明顯的體外自由基清除能力，而且可以延長(zhǎng)線蟲的壽命、增加線蟲的身體長(zhǎng)度和提高線蟲的頭部擺動(dòng)頻率，增強(qiáng)線蟲抗應(yīng)激能力。延長(zhǎng)鮑魚的干制明間和利用微波處理均可以增強(qiáng)AMDP的功能效果。這可能是因?yàn)楦芍七^(guò)程或微波處理促進(jìn)了鮑魚肌肉中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的形成，使AMDP誘導(dǎo)線蟲生成更多的抗氧化酶并提高機(jī)體的抗氧化能力。綜上，微波鋪助干燥有利于提高干鮑肌肉抗氧化活性功能，本實(shí)驗(yàn)可以為干鮑產(chǎn)品開發(fā)提供新的研究方向。