劉 莎，鄧?yán)幔?耕,4,*，楊洪生

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 401334；3.重慶市生物技術(shù)研究所有限責(zé)任公司，重慶 401121；4.川渝共建特色食品重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716；5.綿陽(yáng)常山農(nóng)業(yè)科技有限公司，四川 綿陽(yáng) 621000）

臭黃荊（Premna ligustroidesHemsl.）是一種馬鞭草科腐婢屬灌木，廣泛分布于中國(guó)西南地區(qū)，適宜在貧瘠的山地種植，具有良好的藥用價(jià)值和食用價(jià)值[1]。葉中含有木栓酮、木栓醇、袖皮素等藥用成分，其水提取物可解毒消腫、抗疲勞、降低膽固醇，根水提取物可抗炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫力，種子提取物可治療頭痛、風(fēng)疹皮癢[2]。臭黃荊葉資源豐富，但目前仍處于未開(kāi)發(fā)狀態(tài)。同明臭黃荊葉含有豐富的蛋白質(zhì)和果膠，是制作民間小吃“神仙豆腐”的原料。隨著綠色環(huán)保意識(shí)加強(qiáng)，越來(lái)越多的人開(kāi)始關(guān)注天然產(chǎn)物，因此，開(kāi)發(fā)臭黃荊資源，將其融入大健康產(chǎn)業(yè)，不僅有理論研究意義，還有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

果膠是存在于植物細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)壁的酸性雜多糖，其組成有同質(zhì)多糖和雜多糖兩種類型，多為半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）及其衍生物，呈白色或黃色粉狀，分子質(zhì)量約20～400 ku，通常按其酯化度分為高酯果膠（酯化度＞50%）和低酯果膠（酯化度≤50%）[3]。果膠主要是由α-1,4-糖苷鍵連接的D-半乳糖醛酸單元構(gòu)成線性主鏈并具有分枝的雜多糖[4]，不同來(lái)源果膠的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物活性不相同，溶解性也有差異。果膠在食品工業(yè)可作為膠凝劑、增稠劑、乳化劑、質(zhì)構(gòu)改良劑等，還具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫和抗癌等生理活性[5]。目前果膠提取方法主要包括水提法、酸提法、堿提法和酶鋪助提取法等[6]，水提法適用于水溶性果膠的提取，但大量不溶于水的果膠在提取過(guò)程中被浪費(fèi)；酸法和堿法在研究和工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用較多，但是這兩種方法對(duì)環(huán)境污染較大且成本高。而酶提取法具有底物特異性、水解條件溫和、水解過(guò)程易于控制、定向生成產(chǎn)物、成本低廉、環(huán)境友好等眾多優(yōu)點(diǎn)[7]。

果膠多糖的特性例如酯化度、分子質(zhì)量和單糖組成等對(duì)果膠分子的活性具有十分重要的影響，通過(guò)酶處理使天然果膠的聚合度和酯化度大幅度降低，可獲得高生物活性（抗菌、抗氧化）的改性果膠[8]。基于以上研究背景，本實(shí)驗(yàn)利用單一果膠酶和復(fù)合酶分別提取臭黃荊葉果膠，以水提果膠為對(duì)照，測(cè)定3 種臭黃荊葉果膠的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和抗氧化性能，并探究3 種臭黃荊葉果膠的抑菌活性，以期為其在健康食品、抗菌藥物等方面的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮臭黃荊葉 四川綿陽(yáng)常山農(nóng)業(yè)科技有限公司；果膠酶（500 U/mg）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、VC標(biāo)準(zhǔn)品、2,2’-聯(lián)氮-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)，ABTS） 上海源葉生物科技有限公司；纖維素酶（10 000 U/mg）重慶躍翔工業(yè)有限公司；D-半乳糖醛酸、沒(méi)食子酸、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，福林-酚試劑，單糖標(biāo)準(zhǔn)品（甘露糖、鼠李糖（rhamnose，Rha）、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸、木糖、巖藻糖） 北京Solarbio生物科技有限公司；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、埃希氏大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus） 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室；麥凱康培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂、7.5%氯化鈉肉湯 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

759紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；SY-10真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；5804R多功能臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)艾本德公司；SYNERGY H1酶標(biāo)儀 美國(guó)Biotek公司；Spectrum 100傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)珀金埃爾默公司；LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；凝膠滲透色譜儀 美國(guó)Wyatt技術(shù)公司；超凈工作臺(tái) 山東Biobase生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品準(zhǔn)備

冷凍干燥臭黃荊葉，磨成細(xì)粉過(guò)200 目篩，取篩下物裝袋密封，避光干燥處儲(chǔ)存（水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于4%）。

水提果膠（water-extracted pectin from thePremna ligustroidesHemsl.leaves，WPHP）：稱取10.00 g臭黃荊葉粉（干質(zhì)量）于燒杯，加入10 倍質(zhì)量蒸餾水，攪拌均勻，50 ℃水浴提取5 h，抽濾收集上清液，加入上清液1.5 倍體積無(wú)水乙醇，混合均勻，醇沉過(guò)夜，離心（6 000 r/min，10 min），沉淀經(jīng)冷凍干燥得水提果膠。

果膠酶提果膠（pectinase-extracted pectin from thePremna ligustroidesHemsl.leaves，PPHP）：稱取10.00 g臭黃荊葉粉（干質(zhì)量）于燒杯，加入10 倍質(zhì)量蒸餾水，加入臭黃荊葉粉質(zhì)量1%的果膠酶，攪拌均勻，50 ℃水浴提取5 h，抽濾收集清液，加入1.5 倍體積無(wú)水乙醇，混合均勻，過(guò)夜醇沉，離心（6 000 r/min，10 min），沉淀經(jīng)冷凍干燥得果膠酶提果膠。

復(fù)合酶提果膠（mixed enzymes-extracted pectin from thePremna ligustroidesHemsl.leaves，MPHP）：稱取10.00 g臭黃荊葉粉（干質(zhì)量）于燒杯，加入10 倍質(zhì)量蒸餾水，加入臭黃荊葉粉質(zhì)量1%的復(fù)合酶（m（果膠酶）∶m（纖維素酶）＝1∶1）[9]，攪拌均勻，50 ℃水浴提取5 h，抽濾收集清液，加入1.5 倍體積的無(wú)水乙醇，混合均勻，過(guò)夜醇沉，離心（6 000 r/min，10 min），沉淀冷凍干燥得復(fù)合酶提果膠。

1.3.2 果膠提取率測(cè)定

按照質(zhì)量法[10]測(cè)定果膠提取率（干基計(jì)），計(jì)算如式（1）所示。

1.3.3 基本理化指標(biāo)測(cè)定

采用灼燒法[11]測(cè)定灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)；采用凱氏定氮法[12]測(cè)定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)；采用硫酸-咔唑法[13]測(cè)定半乳糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)；采用滴定法[13]測(cè)定酯化度。

1.3.4 紅外光譜分析

采用紅外光譜法分析3 種果膠分子結(jié)構(gòu)。取少量果膠粉末直接放在衰減全反射晶體上，壓力塔加壓測(cè)試，以4 cm-1光譜分辨率、4 000～600 cm-1范圍掃描樣品，記錄光譜圖用于比較分析。

1.3.5 單糖組成測(cè)定

采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生法[14]測(cè)定臭黃荊葉多糖樣品中的單糖組成。分別稱取1.3.1節(jié)制備的3 種多糖樣品60 mg，于4 mL 2 mol/L H2SO4溶液中溶解，110 ℃加熱水解2 h。用4 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH值為7，純水稀釋到總體積為10 mL，離心（3 000 r/min，10 min），取上清液。量取各水解的多糖樣品100 μL，加200 μL 0.3 mol/L NaOH溶液、200 μL 0.5 mol/L PMP溶液，70 ℃水浴加熱100 min，靜置冷卻10 min。加入200 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和，加純水至1 mL，再加1 mL三氯甲烷溶液萃取，振蕩、離心，棄有機(jī)相，重復(fù)萃取操作3 次。水相補(bǔ)水至2 mL，過(guò)濾，高效液相色譜分析。稱取各單糖標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，混合，純水稀釋至5 mL。量取混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品100 μL，同上述衍生化處理后高效液相色譜分析。

色譜條件：色譜柱為Agilent EC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），紫外檢測(cè)器（波長(zhǎng)250 nm）。具體檢測(cè)條件：流動(dòng)相A為乙腈-0.05 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 6.9，15∶85，V/V），流動(dòng)相B為乙腈-0.05 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 6.9，40∶60，V/V）。低壓梯度洗脫，洗脫條件為0～10 min 100%～85% A，10～30 min 85%～75% A，30～35 min 75%～100% A，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm。

1.3.6 果膠分子質(zhì)量測(cè)定

采用凝膠滲透色譜法測(cè)定果膠樣品分子質(zhì)量分布，色譜檢測(cè)條件：示差折光檢測(cè)器；PL aquagel-OH MIXED 8 μm色譜柱；流動(dòng)相：0.1 mol/L NaNO3；流速1 mL/min；柱溫30 ℃。稱取干燥果膠多糖樣品2 mg，溶于1.0 mL蒸餾水，用0.45 μm水相微孔濾膜過(guò)濾，吸取100 μL依照色譜條件進(jìn)樣。

1.3.7 總酚含量測(cè)定

采用福林-酚比色法[15]測(cè)定總酚含量。吸取2 mg/mL樣品液1.0 mL，加1.5 mL稀釋1 倍的福林-酚試劑，混勻，靜置5 min，再加4 mL 20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）Na2CO3溶液混勻，純水定容至25 mL，40 ℃避光顯色30 min，于755 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝30.35x+0.004 8（R2＝0.999），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算總酚質(zhì)量濃度，單位為mg/mL，并換算成總酚含量。

1.3.8 總黃酮含量測(cè)定

采用改良的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[16]測(cè)定總黃酮含量。吸取2 mg/mL果膠多糖1.0 mL，加入5% NaNO2溶液1.0 mL，靜置5 min，加10% Al(NO3)3溶液1.0 mL并混勻，放置5 min后加4% NaOH溶液10.0 mL，最后用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液定容至25 mL，搖勻，靜置10 min。以不加樣品液管調(diào)零，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝0.658 3x-0.034 3（R2＝0.999 4），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算總黃酮質(zhì)量濃度，單位為mg/mL，并換算成總黃酮含量。

1.3.9 抗氧化活性測(cè)定

1.3.9.1 DPPH自由基清除率

根據(jù)Mensor等[17]的方法略微修改測(cè)定DPPH自由基清除率。用純水制備不同質(zhì)量濃度的果膠多糖（0.2～1.2 mg/mL）。將0.2mL 多糖溶液與2mL 0.01mmol/mLDPPH溶液混合，在25 ℃下反應(yīng)30 min，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，每組做3 個(gè)平行。取3 支試管，分別標(biāo)記為0、1、2。0 號(hào)試管：2mL 純水+2 mL DPPH溶液；1號(hào)試管：2 mL樣品+2 mL DPPH溶液；2號(hào)試管：2 mL樣品+2 mL無(wú)水乙醇。以不同質(zhì)量濃度（0.2～1.2 mg/mL）VC溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。按式（2）計(jì)算DPPH清除率。

式中：S為DPPH自由基清除率/%；A0為0號(hào)試管的吸光度；A1為1號(hào)試管的吸光度；A2為2號(hào)試管的吸光度。

1.3.9.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除率

根據(jù)Thaipong等[18]的方法進(jìn)行測(cè)定ABTS陽(yáng)離子自由基清除率。配制6.94 mmol/L ABTS水溶液和2.6 mmol/L K2S2O8水溶液，將兩者混合均勻，陰涼處放置16 h，充分反應(yīng)。用磷酸鹽緩沖液（0.2 mmol/L pH 6.6）稀釋溶液，于734 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，直到最終吸光度為0.70。加入96 孔板，黑暗處放置20 min，測(cè)定734 nm波長(zhǎng)處吸光度。陽(yáng)性對(duì)照與1.3.9.1節(jié)一致。ABTS陽(yáng)離子自由基清除率按公式（3）計(jì)算。

式中：S為ABTS陽(yáng)離子自由基清除率/%；A0為25 μL蒸餾水+175 μL ABTS溶液吸光度；A1為25 μL樣品溶液+175 μL ABTS溶液吸光度；A2為25 μL樣品溶液+175 μL蒸餾水吸光度。

1.3.9.3 Fe3+還原率

Fe3+還原率測(cè)定按照J(rèn)in Hua等[19]的方法適當(dāng)修改進(jìn)行測(cè)定。取100 μL不同質(zhì)量濃度果膠溶液（0.2～1.2 mg/mL），與100 μL pH 6.6磷酸緩沖溶液、100 μL 1%鐵氰化鉀溶液混合，50 ℃水浴反應(yīng)20 min，冷卻后加入100 μL 10%三氯乙酸溶液，離心（3 000 r/min，15 min）。取上清液90 μL，加入100 μL蒸餾水、10 μL 0.1%三氯化鐵，靜置10 min，于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。同明將鐵氰化鉀溶液替換成100 μL蒸餾水作為空白對(duì)照。以VC為陽(yáng)性對(duì)照，重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

1.3.10 果膠樣品液抑菌性測(cè)定

1.3.10.1 樣品液制備

配制40 mg/mL果膠樣品液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.10.2 最小抑菌濃度和最低殺菌濃度

采用2 倍梯度稀釋法，取試管6 支，每管加無(wú)菌液體培養(yǎng)基3.0 mL，于第1支試管加入樣品3.0 mL，混勻，取3.0 mL加入第2支試管，以此類推，直到第6支試管棄去3.0 mL。各管加入0.1 mL菌液（OD600nm＝1）。同明每組設(shè)陽(yáng)性對(duì)照管（只含等量菌液）以及陰性對(duì)照管（無(wú)菌生理鹽水）各1 支，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，根據(jù)試管內(nèi)樣液混濁度判斷菌體生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)液完全清亮，表示無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)；培養(yǎng)液混濁，表示有細(xì)菌生長(zhǎng)。對(duì)于樣液混濁肉眼無(wú)法判斷的試管，做進(jìn)一步平板涂布，37 ℃培養(yǎng)24 h，以無(wú)菌生長(zhǎng)的最小濃縮液質(zhì)量濃度為樣品液對(duì)該菌最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC）。將MIC及高于MIC的各管在生理鹽水平板上涂布，37 ℃培養(yǎng)24 h，以菌落少于10 個(gè)的相應(yīng)濃縮液質(zhì)量濃度為對(duì)該菌種的最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）。

1.3.10.3 紙片法藥敏實(shí)驗(yàn)測(cè)定

分別取3 個(gè)不同質(zhì)量濃度（10、20、40 mg/mL）果膠樣品液15 mL，放入直徑6 mm滅菌濾紙片（12 片為1 組）36 片，浸泡2 h。自然干燥，紫外燈滅菌15 min。無(wú)菌條件下，將菌株混懸液（OD600nm＝1）稀釋100 倍，接種到普通營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基表面，每種菌株平行接種3 個(gè)平板，將紙片貼于平板，平板劃分為4 個(gè)區(qū)，每個(gè)平板貼4 片，其中一片為陰性對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌效果。在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)，菌生長(zhǎng)被抑制形成透明抑菌圈，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑，抑菌圈大小能夠反映測(cè)試菌對(duì)果膠提取液的敏感程度，判斷標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 紙片法判斷抑菌敏感度標(biāo)準(zhǔn)[20]Table 1 Criteria for determination of antibacterial sensitivity paper disc method[20]

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 26.0和Excel 2016軟件處理數(shù)據(jù)并進(jìn)行相關(guān)性分析，用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取臭黃荊葉果膠多糖基本指標(biāo)

3 種方法提取臭黃荊葉果膠多糖的提取率、半乳糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酯化度如表2所示，MPHP果膠提取率超過(guò)PPHP和WPHP，原因是纖維素酶對(duì)臭黃荊葉細(xì)胞壁的分解破壞程度大，使細(xì)胞更容易破裂，從而導(dǎo)致細(xì)胞中更多的多糖等物質(zhì)溶出。3 種方法提取的果膠多糖其半乳糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)及酯化度分別為：MPHP半乳糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)45.13%、酯化度12.56%，PPHP半乳糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)33.42%、酯化度40.21%，WPHP半乳糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)15.30%、酯化度62.33%，前兩者屬于低酯果膠，后者屬于高酯果膠。果膠在酶法提取過(guò)程中通過(guò)酶降解果膠鏈上的中性糖，同明使同聚半乳糖醛酸骨架解聚，從而降低了酯化度[21]；因此，酶提取果膠其半乳糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，而酯化度下降。PPHP和MPHP蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)無(wú)顯著差異（P＞0.05），其蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于瓜爾豆膠（8.2%）、黃原膠（5.4%）和阿拉伯樹(shù)膠（1.8%）等[22]。WPHP灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)與PPHP和MPHP差異顯著（P＜0.05），且高于阿拉伯樹(shù)膠（1.2%）和黃原膠（1.5%），但3 種臭黃荊葉果膠多糖灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于瓜爾豆膠（11.9%）[23]。

表2 不同酶法提取臭黃荊葉果膠多糖基本組分Table 2 Basic composition of pectin polysaccharides extracted from Premna ligustroides Hemsl.leaves by different enzymatic methods

2.2 臭黃荊葉果膠結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

2.2.1 紅外光譜結(jié)構(gòu)表征

3 種臭黃荊葉果膠多糖紅外光譜結(jié)構(gòu)表征結(jié)果如圖1所示，4 000～650 cm-1范圍類均表現(xiàn)出糖類的特征吸收峰，3 200 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰是由O—H鍵的伸縮振動(dòng)所引起，2 924 cm-1處的吸收峰是由C—H鍵的伸縮振動(dòng)所引起，1 748 cm-1處的吸收峰是羧羰基和酯羰基中C＝O鍵伸縮振動(dòng)所引起，1 629～1 605 cm-1處的吸收峰是由游離羧基中C＝O鍵的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)所引起，伸縮振動(dòng)的C＝O鍵和非對(duì)稱伸縮振動(dòng)的C＝O證明提取物為果膠類多糖。1 427～1 423 cm-1處吸收峰是由—COOH的C—O伸縮振動(dòng)引起的，證明有果膠特征基團(tuán)羧基存在。

圖1 不同酶法提取臭黃荊葉果膠多糖紅外光譜Fig.1 Infrared spectra of pectin extracted from Premna ligustroides Hemsl.leaves by different enzymatic methods

由圖1可見(jiàn)，水提法、果膠酶提法和復(fù)合酶提法制備的果膠多糖在1 741 cm-1附近的振動(dòng)峰強(qiáng)度依次減小，而復(fù)合酶法提取的樣品中該峰基本消失，可能是由于復(fù)合酶條件下發(fā)生酯化的甲氧基被水解。1 426 cm-1處吸收峰是由C—H的變角振動(dòng)所引起，它和3 200～3 600 cm-1處的C—H 伸縮振動(dòng)吸收峰構(gòu)成了糖環(huán)的特征吸收峰。890～970 cm-1附近吸收峰表示α-型糖苷鍵；在1 030～1 150 cm-1處的吸收峰表示β-型糖苷鍵。3 種臭黃荊葉果膠多糖在1 016 cm-1均出現(xiàn)寬峰，說(shuō)明3 種方法提取的臭黃荊葉果膠均為吡喃糖，另外MPHP在1 153 cm-1處的吸收峰是帶有β-1,6-糖苷鍵的C—O—C基團(tuán)的伸縮振動(dòng)峰[24]，說(shuō)明MPHP屬于帶有β-1,6-糖苷鍵的吡喃多糖。

2.2.2 單糖組成

不同方法制備的果膠多糖單糖組成如圖2所示，單糖組成結(jié)果以物質(zhì)的量百分比形式計(jì)算（表3），WPHP單糖組成中葡萄糖占主要部分（64.38%），PPHP單糖組成中半乳糖醛酸占主要部分（37.72%），MPHP單糖組成中半乳糖醛酸（33.48%）和葡萄糖（48.08%）占主要部分，此結(jié)果與之前報(bào)道的臭黃荊葉果膠單糖組成相符。果膠多糖的同聚半乳糖醛酸（homogalacturonan，HG）結(jié)構(gòu)主要由半乳糖醛酸構(gòu)成，而鼠李糖半乳糖醛酸聚糖第I型（RG-I）結(jié)構(gòu)的主鏈由鼠李糖和半乳糖醛酸交替連接構(gòu)成，因此鼠李糖/半乳糖醛酸的物質(zhì)的量比（Rha/GalA值）常用來(lái)反映RG-I結(jié)構(gòu)含量。HG結(jié)構(gòu)為主的商品果膠Rha/GalA值較低（0.017～0.027），而以RG-I結(jié)構(gòu)為主的果膠多糖Rha/GalA值在0.05～1.00之間，比值越接近1則果膠多糖組分中RG-I結(jié)構(gòu)占比越多，HG結(jié)構(gòu)占比越少。WPHP、PPHP和MPHP的Rha/GalA值在0.04～0.29，表明水、果膠酶提取的臭黃荊葉果膠多糖以RG-I結(jié)構(gòu)為主，復(fù)合酶提取的臭黃荊葉果膠多糖以HG結(jié)構(gòu)為主。其中，MPHP的Rha/GalA值為0.04，低于PPHP，說(shuō)明復(fù)合酶法提取明水解HG結(jié)構(gòu)效率高于果膠酶提取，而WPHP的Rha/GalA值為0.29，高于PPHP，可能是由于水提效率較高，中性糖溶于水而被提取出來(lái)。阿拉伯糖和半乳糖以中性糖側(cè)鏈（阿拉伯聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖）的形式存在于果膠多糖的RG-I結(jié)構(gòu)域中，兩者在PPHP中含量均高于MPHP，這說(shuō)明PPHP的中性糖側(cè)鏈最為豐富，因此相較于復(fù)合酶提取，果膠酶提取可能帶來(lái)更高的分支度。

圖2 不同酶法提取臭黃荊葉果膠多糖單糖組成色譜圖Fig.2 Chromatograms of monosaccharide composition of pectin extracted from Premna ligustroides Hemsl.leaves by different enzymatic methods

表3 不同酶法提取臭黃荊葉果膠多糖單糖組成的色譜圖Table 3 Monosaccharide composition of pectin extracted from Premna ligustroides Hemsl.leaves by different enzymatic methods

2.2.3 分子質(zhì)量

由圖3和表4可知，不同方法制備的臭黃荊葉果膠多糖分子質(zhì)量分布不均，且分布范圍較寬，其中WPHP分子質(zhì)量譜圖由兩個(gè)寬峰和一個(gè)尖峰組成，重均分子質(zhì)量分別為2.12×107、4.94×105u和6.77×104u；PPHP分子質(zhì)量譜圖有兩個(gè)峰，重均分子質(zhì)量分別為1.52×105u和1.66×103u；MPHP分子質(zhì)量圖有4 個(gè)峰，重均分子質(zhì)量分別為2.08×107、4.37×105、1.14×105u和4.67×103u；水、果膠酶和復(fù)合酶法提取的臭黃荊葉果膠分子質(zhì)量測(cè)定含有多峰，說(shuō)明提取的臭黃荊葉果膠是雜多糖。陳軍[25]用純水提取的豆腐柴果膠也具有高分子質(zhì)量特征，其重均分子質(zhì)量為9.59×105u。與WPHP相比，PPHP和MPHP出峰明間較晚，說(shuō)明樣品在酶促條件發(fā)生部分降解，果膠鏈結(jié)構(gòu)斷裂，分子質(zhì)量下降。分子質(zhì)量在5 000～35 000 u范圍內(nèi)的果膠多糖被稱為小分子果膠，其具有分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單和易被吸收利用等特點(diǎn)，具有一定的免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗病毒等功能活性[26]。本實(shí)驗(yàn)中PPHP和MPHP均含有分子質(zhì)量5 000～35 000 u的果膠多糖，其可能具有一定功能活性，后續(xù)可深入研究。

圖3 不同酶法提取臭黃荊葉果膠多糖分子質(zhì)量Fig.3 Molecular mass of pectin polysaccharides exracted from Premna ligustroides Hemsl.leaves by different enzymatic methods

表4 不同酶法提取臭黃荊葉果膠多糖的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布Table 4 Relative molecular mass and its distribution of pectin polysaccharides from Premna ligustroides Hemsl.leaves extracted by different enzymatic methods

2.3 臭黃荊葉果膠多糖總酚、總黃酮含量

3 種方法所提取臭黃荊葉果膠總酚和總黃酮含量如表5所示，WPHP總酚和總黃酮含量分別為12.43 mg/g和15.33 mg/g，PPHP總酚和總黃酮含量分別為15.25 mg/g和17.08 mg/g，MPHP總酚和總黃酮含量分別為17.09 mg/g和26.46 mg/g，結(jié)果表明酶處理可以釋放臭黃荊葉中的多酚和黃酮，這與李浡等[27]使用復(fù)合酶提取葡萄酒渣中多酚所得結(jié)果相似。

表5 不同酶法提取臭黃荊葉果膠多糖的總多酚、總黃酮含量Table 5 Contents of total polyphenols and total flavonoids in pectin polysaccharides from Premna ligustroides Hemsl.leaves extracted by different enzymatic methods

2.4 臭黃荊葉果膠多糖抗氧化性

2.4.1 DPPH自由基清除率

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的質(zhì)子自由基，被廣泛用于各類天然產(chǎn)物自由基清除能力的測(cè)定。由圖4可知，果膠具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，并且隨著果膠溶液質(zhì)量濃度增加，其DPPH自由基清除率提升。相同質(zhì)量濃度的3 種臭黃荊葉果膠DPPH自由基清除率總體由高到低依次為MPHP＞PPHP＞W(wǎng)PHP，但是WPHP與PPHP對(duì)于DPPH自由基的清除能力差異不明顯。當(dāng)MPHP質(zhì)量濃度為1.20 mg/mL明，DPPH自由基清除率達(dá)71.9%。與同質(zhì)量濃度的VC相比，果膠的DPPH自由基清除能力較低。研究表明，果膠質(zhì)量濃度相同明，臭黃荊葉果膠比仙人掌果膠[28]、黑木耳多糖[29]的DPPH自由基清除能力強(qiáng)，這是因?yàn)椴煌参锏亩嗵侵泻械牧u基數(shù)目不同，羥基能與DPPH自由基發(fā)生反應(yīng)，因此羥基數(shù)目越多，其DPPH自由基清除能力越強(qiáng)。

圖4 不同酶法提取臭黃荊葉果膠多糖的DPPH自由基清除率Fig.4 DPPH radical scavenging effect of pectin polysaccharides from Premna ligustroides Hemsl.leaves extracted by different enzymatic methods

2.4.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除率

由圖5可知，果膠具有較強(qiáng)的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力，并且隨著果膠溶液質(zhì)量濃度增加，其ABTS陽(yáng)離子自由基清除率提升。在果膠質(zhì)量濃度分別為0.1 mg/mL和0.3 mg/mL明，WPHP和PPHP對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率差異不明顯。3 種臭黃荊葉果膠多糖對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除率總體由高到低依次為MPHP＞PPHP＞W(wǎng)PHP。當(dāng)MPHP質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL明，ABTS陽(yáng)離子清除率高達(dá)77.80%。

圖5 不同酶法提取臭黃荊葉果膠多糖的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率Fig.5 ABTS cation radical scavenging effect of pectin polysaccharides from Premna ligustroides Hemsl.leaves extracted by different enzymatic methods

2.4.3 Fe3+還原率

由圖6可知，隨著果膠質(zhì)量濃度的增加，F(xiàn)e3+還原率也提升。3 種臭黃荊葉果膠Fe3+還原率由高到低依次為MPHP＞PPHP＞W(wǎng)PHP。MPHP溶液質(zhì)量濃度為1.20 mg/mL明，果膠溶液的Fe3+還原率為77.87%，高于南酸棗果膠多糖[6]，但3 種臭黃荊葉果膠多糖對(duì)Fe3+的抗氧化能力都弱于VC。

圖6 不同酶法提取臭黃荊葉果膠多糖的Fe3＋還原率Fig.6 Fe3+-reducing power of pectin polysaccharides from Premna ligustroides Hemsl.leaves extracted by different enzymatic methods

2.5 臭黃荊葉果膠抗菌性

2.5.1 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

由表6可以看出不同方法處理提取臭黃荊葉果膠抑菌能力不同。MPHP對(duì)3 種菌的抑制效果均優(yōu)于WPHP和PPHP，而WPHP對(duì)于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果優(yōu)于PPHP，PPHP對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果優(yōu)于大腸桿菌。黃思雨等[30]的研究表明臭黃荊葉水提取濃縮物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有抑菌作用，且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用強(qiáng)于大腸桿菌。

表6 不同酶法提取臭黃荊葉果膠多糖的MIC和MBCTable 6 Minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of pectin polysaccharides from Premna ligustroides Hemsl.leaves extracted by different enzymatic methods

2.5.2 抑菌圈直徑

由表7可以看出，臭黃荊葉果膠抑菌效果均隨著質(zhì)量濃度增大而增強(qiáng)。三者相比，MPHP抑菌效果最好，抑菌圈直徑最大，邊緣清晰完整。10 mg/mL和20 mg/mL的WPHP和PPHP對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌均沒(méi)有抑菌效果，可能是質(zhì)量濃度較小的緣故。在相同質(zhì)量濃度下，3 種臭黃荊葉果膠對(duì)各細(xì)菌的抑菌效果：金黃色葡萄球菌＞埃希氏大腸桿菌＞是枯草芽孢桿菌，這與細(xì)胞膜的構(gòu)成相關(guān)。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，其特點(diǎn)是細(xì)胞膜外部有一個(gè)肽聚糖層，它是無(wú)效的滲透屏障；大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，外部磷脂膜帶有結(jié)構(gòu)性脂多糖，它與孔蛋白構(gòu)成選擇性屏障，使得溶菌酶這類親脂類的抑菌物質(zhì)不能滲透，從而無(wú)法起到抑菌作用[31]；雖然枯草芽孢桿菌同為革蘭氏陽(yáng)性菌，但其對(duì)外界抗性強(qiáng)，具有耐高溫和快速?gòu)?fù)活等特點(diǎn)，抑制其生長(zhǎng)需要更高的濃度。臭黃荊葉果膠多糖抑菌能力與黃酮、多酚含量和果膠分子質(zhì)量相關(guān)，由于黃酮、多酚上有很多酚羥基，這些基團(tuán)能夠與蛋白質(zhì)或酶以氫鍵的方式結(jié)合，破壞蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)使其變性失活，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)固縮、解體，從而起到抑菌作用；而果膠經(jīng)過(guò)酶分解，分解后的產(chǎn)物具有很強(qiáng)的抗菌活性，研究表明，果膠降解生成的低聚糖具有促進(jìn)雙歧桿菌生長(zhǎng)繁殖、抑制有害菌增長(zhǎng)和調(diào)整腸道菌群平衡等功能[32]。Takenaka等[33]用檸檬果膠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，果膠分解后表達(dá)其抗菌性的本質(zhì)產(chǎn)物是半乳糖醛酸寡糖。

表7 不同酶法提取臭黃荊葉果膠多糖抑菌圈直徑測(cè)定結(jié)果Table 7 Inhibition zone diameters of pectin polysaccharides from Premna ligustroides Hemsl.leaves extracted by different enzymatic methods

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用水提、果膠酶提和復(fù)合酶提3 種方法分別從臭黃荊葉中提取果膠，并初步分析其化學(xué)組成、分子質(zhì)量、紅外光譜性質(zhì)、體外抗氧化作用及抗菌性。結(jié)果表明，不同提取方法使得果膠的半乳糖醛酸、酯化度、分子質(zhì)量和單糖含量等都發(fā)生了不同程度的變化，從而導(dǎo)致果膠多糖存在結(jié)構(gòu)形態(tài)上的差異。紅外光譜分析結(jié)果顯示，3 種果膠在4 000～650 cm-1范圍內(nèi)都呈現(xiàn)出果膠物質(zhì)的特征吸收峰，說(shuō)明所制備樣品屬于果膠類多糖；分子質(zhì)量分布分析結(jié)果表明臭黃荊葉果膠多糖是由不同分子質(zhì)量的組分組成，酶提取臭黃荊葉果膠分子質(zhì)量小于水提臭黃荊葉果膠，說(shuō)明提取過(guò)程中部分果膠被降解成小分子果膠；體外抗氧化分析結(jié)果顯示，臭黃荊葉果膠多糖對(duì)DPPH自由基及ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力及對(duì)Fe3+還原率都與樣品質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，其中復(fù)合酶法制備的果膠表現(xiàn)出相對(duì)較好的抗氧化作用，且半乳糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和抗菌性均高于其他兩種方法。果膠的抗菌性可能與其半乳糖醛酸、多酚和黃酮含量有關(guān)系，協(xié)同作用產(chǎn)生抗氧化性和抗菌性。通過(guò)研究不同提取方法對(duì)臭黃荊葉果膠多糖的理化性質(zhì)和抗氧化作用的影響，可以為果膠的進(jìn)一步研究提供參考。