高雯暄，李佳林，閆 鶴

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641）

沙門氏菌（Salmonella）屬于腸桿菌科的革蘭氏陰性菌，兼性厭氧，無芽孢和莢膜，絕大多數(shù)具有鞭毛和菌毛，可以附著在宿主細(xì)胞表面[1]。根據(jù)細(xì)菌抗原的不同，目前共有2 600多種血清型，其中腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和豬霍亂沙門氏菌是3 種常見引起重大公共衛(wèi)生問題的人畜共患疾病的血清型[2]。沙門氏菌廣泛分布于自然界，可以在許多動物的腸道中生存和繁殖，并通過畜禽肉類和蛋類等農(nóng)產(chǎn)品傳播疾病[3]。被感染的肉類在屠宰、貯藏運輸或加工過程中若處于高溫高濕的天氣條件下極易出現(xiàn)細(xì)菌的二次生長[4]。沙門氏菌與單核細(xì)胞增生李斯特菌、大腸桿菌O157及金黃色葡萄球菌并列為全球四大食源性致病菌，其危害極大，少量攝入就會引起人體產(chǎn)生發(fā)熱、嘔吐及腹瀉等不良反應(yīng)[5-6]。根據(jù)美國疾控中心的數(shù)據(jù)，美國每年因沙門氏菌感染而送醫(yī)就診人數(shù)高達(dá)26 500 例，致死人數(shù)420 例，直接醫(yī)療花費約為3.65億 美元，其中95%以上的人群感染病例是由食物引起的，如受污染的生食烹飪不充分或烹飪后受到交叉污染等[7]。因此，開發(fā)積極有效的細(xì)菌控制措施是農(nóng)產(chǎn)品和食品工業(yè)中亟待解決的重要問題。長期以來，傳統(tǒng)的化學(xué)抑菌劑浸泡一直作為消除肉類中食源性病原體以及食品腐敗微生物的常見處理方法，如次氯酸、次氯酸鹽溶液[8]。由于化學(xué)殘留安全性、環(huán)境降解周期長及過度使用導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性等問題凸顯，迫使農(nóng)業(yè)及食品工業(yè)從業(yè)者積極尋求殺菌效果顯著、環(huán)境友好、毒副作用小的新型殺菌技術(shù)[9]。低能X射線輻照是指將物體或生物暴露于能量在數(shù)百千電子伏以內(nèi)的X射線以進(jìn)行生物學(xué)研究、食品輻照、材料分析等應(yīng)用的過程，其能量比傳統(tǒng)X射線（約5 MeV）及60Co伽馬射線（約2.5 MeV）低很多[10]。該技術(shù)作為一種新興的非熱殺菌方式在食品滅菌領(lǐng)域獲得了廣泛關(guān)注，其在對肉蛋奶制品、干制品和果蔬制品等食品中的食源性致病菌滅活方面卓有成效[10-12]。一方面，低能X射線相比于高能X射線具有更高線性能量傳遞值，射線能量轉(zhuǎn)移到食品或活細(xì)胞中大分子物質(zhì)的過程更加高效，從而引起級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生大量自由基和輻射降解物[13]；另一方面，其柔和性降低了被消毒材料的損壞風(fēng)險，使得它們可以安全地用于生產(chǎn)線中，且不會對工作人員造成危險或者產(chǎn)生對于大規(guī)模鉛屏蔽的需求[14]。

低能X射線殺滅微生物的機(jī)制主要包括：1）引起細(xì)胞膜電位去極化，破壞生物膜脂質(zhì)并分解纖維素結(jié)構(gòu)中的糖苷鍵，使胞外多糖數(shù)量減少[10]；2）電離輻射誘發(fā)水分子產(chǎn)生超氧化物和羥自由基，損傷細(xì)胞內(nèi)的DNA并產(chǎn)生活性氧[11]；3）使細(xì)胞內(nèi)源酶活性喪失和葡萄糖攝取系統(tǒng)受損[13]。盡管目前已有較多從細(xì)胞水平上分析低能X射線殺菌機(jī)制的報道，但從分子水平闡釋沙門氏菌殺滅機(jī)制的報道還很匱乏。深入了解低能X射線對沙門氏菌的影響機(jī)制，分析沙門氏菌在低能X射線輻射下DNA、能量代謝和毒力等轉(zhuǎn)錄水平特征，有助于針對性地制定控制和消除農(nóng)產(chǎn)品中沙門氏菌的策略。轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)（RNA sequencing，RNA-Seq）可以檢測細(xì)菌中幾乎所有的轉(zhuǎn)錄基因，揭示細(xì)菌在不同脅迫條件下的基因表達(dá)變化規(guī)律，是研究基因表達(dá)和調(diào)控機(jī)制的重要手段[15-16]。綜上所述，以低能X射線為研究對象，明確其對沙門氏菌的殺菌效果和亞致死效應(yīng)，研究其對沙門氏菌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，最后通過RNA-Seq高通量測序從轉(zhuǎn)錄組水平探究其對沙門氏菌作用的基因靶點。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與試劑

腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）S010保藏于本實驗室，于2010年分離自河北省某大型超市的冷凍食品。

大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（tryptose soya Agar，TSA）和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（tryptic soy broth，TSB）廣州環(huán)凱生物有限公司；RNA6000納米試劑盒美國安捷倫科技有限公司；dNTP、LATaqTM聚合酶日本TaKaRa公司；TRIzol試劑 美國賽默飛世爾科技公司；異丙醇 上海化學(xué)試劑有限公司；氯仿和無水乙醇 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

X-RAD 320輻照設(shè)備 美國PXI公司；JW-3021HR高速冷凍離心機(jī) 安徽嘉文儀器裝備有限公司；Phenom Pro臺式掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）復(fù)納科學(xué)儀器（上海）有限公司；HT7700生物透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）日本日立株式會社；2100生物分析儀 美國安捷倫科技有限公司；DYY-6C電泳儀 北京六一生物科技有限公司；GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；ABI 3730XL測序儀、ABI-2720聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Applied Biosystems公司；StepOnePlus實明熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time PCR，qPCR）儀 美國Thermo公司；Neofuge 13R臺式高速冷凍離心機(jī) 上海力申科學(xué)儀器有限公司；QL-861旋渦振蕩器 海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；Mini Pro 300V Power Supply電泳儀美國Major Science公司；NovaSeq 6000高通量測序系統(tǒng)美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及輻照處理

將保存于-80 ℃的沙門氏菌劃線接種于新鮮TSA培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)18～24 h。挑取單菌落于TSB培養(yǎng)管中，在37 ℃培養(yǎng)18～24 h。取活化后菌液7 000 r/min離心10 min，去除上清液，無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌菌體3 次，重懸于PBS中獲得濃度108～109CFU/mL的菌懸液。參照Lim等[17]的方法并稍作修改，環(huán)境條件為23 ℃和50%～60%相對濕度，將X射線源的電壓和電流分別調(diào)為160 kV和25 mA，并將樣品放置距X射線管30 cm處，使劑量率為39.5 Gy/min，以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 kGy和0.6 kGy的輻照劑量處理樣品（輻照組），以未處理的樣品作為對照組。為探究菌株在X射線輻照條件下關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，根據(jù)細(xì)菌亞致死率的最高值，預(yù)留對照組和0.5 kGy輻照組，后續(xù)進(jìn)行細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察和轉(zhuǎn)錄組分析[18]。

1.3.2 亞致死損傷計數(shù)

參照Wuytack等[19]方法，將輻照后菌懸液于TSA培養(yǎng)基（非選擇性培養(yǎng)基）和3% NaCl+TSA培養(yǎng)基（選擇性培養(yǎng)基）中培養(yǎng)。完整細(xì)胞能耐受高達(dá)3% NaCl的TSA，而亞致死細(xì)胞僅能在TSA中生長。采用平板計數(shù)法來測定輻照組和對照組中可培養(yǎng)菌落數(shù)，用PBS制備10 倍稀釋系列樣品液，將稀釋后的0.1 mL樣品涂布于TSA平板上，37 ℃下孵育18～24 h，并按下式計算亞致死率。

1.3.3 沙門氏菌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

根據(jù)1.3.2節(jié)結(jié)果確定可產(chǎn)生最高亞致死細(xì)胞的輻照劑量（即0.5 kGy），以未輻照組為對照組。將8 mL輻照組和對照組樣品經(jīng)5 000 r/min（4 ℃）離心5 min，菌體沉淀匯集于2 mL離心管中，加入體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛固定液于4 ℃過夜固定。

SEM觀察：用0.1 mol/L pH 7.0的PBS清洗菌液3 次，每次5 000 r/min離心15 min；依次用體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、80%、90%、95%乙醇溶液和100%乙醇進(jìn)行脫水，每個梯度脫水靜置10 min，最后懸浮于300～600 μL的無水乙醇中。取7～10 μL樣品于鋁箔紙上，干燥后用導(dǎo)電膠黏貼置入載物臺備用。將鍍金的樣品固定在SEM支架上，使用SEM觀察細(xì)胞形態(tài)（7.0 mm工作距離、66 μA燈絲電流、15 kV加速電壓），并采集圖像進(jìn)行分析。

TEM觀察：輻照組和對照組菌液用0.1 mol/L pH 7.0的PBS清洗3 次后，用體積分?jǐn)?shù)為1%的鋨酸溶液固定1～2 h并用PBS浸洗3 次，每次15 min。依次用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液（同SEM）對樣品進(jìn)行脫水，并轉(zhuǎn)移到無水丙酮中。最后，將樣本切片、染色并固定于銅網(wǎng)上，置于TEM下觀察制備的樣品，并采集圖像進(jìn)行分析。

1.3.4 轉(zhuǎn)錄組測序與分析

樣品輻照處理方式參照1.3.3節(jié)，輻照組和對照組分別設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)。輻照后的8 mL菌液立即放于4 ℃冰水中冷卻2 min，并于5 000 r/min離心5 min。獲得的細(xì)菌沉淀立即放于液氮速凍，并用干冰封裝，送至上海派森諾基因科技有限公司進(jìn)行RNA提取和RNA-Seq測序。轉(zhuǎn)錄組測序后所獲得原始數(shù)據(jù)通過數(shù)據(jù)過濾獲得高質(zhì)量序列堿基數(shù)（Clean reads）。采用每千個堿基轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段數(shù)（fragments per kilo bases per million fragments，F(xiàn)PKM）對基因的原始表達(dá)量（Read Counts）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。以|log2（Fold change）|≥1、P≤0.05作為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）。對DEGs進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）代謝通路富集分析，以確定DEGs參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。同明，根據(jù)DEGs生物學(xué)功能進(jìn)行聚類，進(jìn)一步確定其在沙門氏菌細(xì)胞中所發(fā)揮的生物學(xué)作用。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組實驗設(shè)定3 個生物學(xué)重復(fù)，實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。亞致死計數(shù)實驗數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan檢驗中P＜0.05表示輻照樣品間差異顯著。采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實驗結(jié)果使用R語言包繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低能X射線對沙門氏菌亞致死損傷的影響

不同輻照劑量下沙門氏菌的存活率和亞致死損傷情況如表1所示。隨著輻照劑量的增加，菌落數(shù)逐漸降低，與未輻照組相比，當(dāng)輻照劑量為0.2 kGy明，殺滅效果顯著增強(qiáng)（P＜0.05），0.6 kGy下沙門氏菌菌落數(shù)降低3.56（lg（CFU/mL）。多項研究表明低能X射線對致病菌有顯著抑制作用，且呈現(xiàn)明顯的劑量累積效應(yīng)[11,13,20-21]。Lim等[17]的研究表明，25 ℃下，0.6 kGy的低能X射線輻照可使PBS中沙門氏菌降低3.08（lg（CFU/mL））；Mahmoud等[22]的研究表明，0.75 kGy的X射線可以殺滅高于6.0（lg（CFU/mL））的創(chuàng)傷弧菌；Mahmoud等[23]研究發(fā)現(xiàn)0.5 kGy的X射線能夠使副溶血性弧菌菌液濃度從（7.1±0.1）（lg（CFU/mL））降低至（3.1±0.2）（lg（CFU/mL））。本實驗結(jié)果明確了低能X射線具有良好的殺菌效果且存在明顯的劑量累積效應(yīng)。

表1 低能X射線輻照對沙門氏菌亞致死率的影響Table 1 Effect of low-energy X-ray irradiation on sublethal rate of Salmonella

為了在惡劣環(huán)境下存活，細(xì)菌受到脅迫環(huán)境刺激明，會產(chǎn)生亞致死細(xì)胞以維持胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)[24]。本實驗中，當(dāng)?shù)湍躕射線劑量范圍為0.1～0.3 kGy明，選擇性培養(yǎng)基中的沙門氏菌存活數(shù)量對數(shù)值比非選擇性培養(yǎng)基略低（小于1（lg（CFU/mL））），兩組菌落數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）；而當(dāng)輻照劑量為0.5 kGy和0.6 kGy明，亞致死率分別增加至99.44%和99.04%，選擇性培養(yǎng)基中的沙門氏菌存活數(shù)量與非選擇性培養(yǎng)基存活數(shù)量對數(shù)值差值分別為2.28（lg（CFU/mL））和1.98（lg（CFU/mL））。上述結(jié)果表明，沙門氏菌經(jīng)輻照處理后，具有一定的亞致死效果，但隨著劑量累積，該效果逐漸減弱，表明細(xì)胞修復(fù)損傷的能力降低。同明，選擇性和非選擇性培養(yǎng)基菌落差異檢測結(jié)果表明處理后沙門氏菌中具有可修復(fù)損傷的活細(xì)胞群體，這些細(xì)胞受到損傷但未被滅活，會產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄反應(yīng)[25]。綜合上述結(jié)果考慮，選擇0.5 kGy的輻照劑量作為處理條件，開展后續(xù)的微觀結(jié)構(gòu)觀察和RNA-seq研究。

2.2 低能X射線對沙門氏菌超微結(jié)構(gòu)的影響

低能X射線輻照影響沙門氏菌菌體形態(tài)的SEM觀察結(jié)果如圖1A、B所示，輻照組細(xì)胞表面出現(xiàn)輕微破損和皺縮現(xiàn)象，部分出現(xiàn)明顯孔洞，對照組的細(xì)胞表面完整，沒有皺縮和破裂現(xiàn)象。Jeon等[26]研究表明，0.15 kGy X射線處理后的鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞表面出現(xiàn)輕微的不平坦。Shi Feifei等[27]發(fā)現(xiàn)在0.75 kGy和1.50 kGy的電子束輻照下，李斯特菌細(xì)胞表面無顯著性變化。Park等[28]發(fā)現(xiàn)人工接種于鵪鶉蛋殼表面的沙門氏菌經(jīng)2.0 kGy X射線輻照處理后，其生物被膜受到破壞，蛋殼表面可見單個游離細(xì)菌細(xì)胞。低能X射線影響沙門氏菌細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的TEM觀察結(jié)果如圖1C、D所示，對照組細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞壁完整，細(xì)胞膜清晰，細(xì)胞質(zhì)電子密度分布均勻，呈規(guī)則的棒狀（圖1C）；輻照組細(xì)胞基本保持其正常的超微結(jié)構(gòu)，少數(shù)細(xì)胞細(xì)胞壁發(fā)生凹陷、界限模糊不清，細(xì)胞膜發(fā)生褶皺，細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞器數(shù)量減少，中心出現(xiàn)空泡；細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜之間的間隙變寬，并出現(xiàn)類似“質(zhì)壁分離”現(xiàn)象（圖1D1）；部分細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化和破壞，細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生溶解現(xiàn)象，并伴隨著少數(shù)細(xì)胞內(nèi)容物的泄漏（圖1D2）。Shi Feifei等[27]通過TEM圖像觀察發(fā)現(xiàn)電子束輻照處理與李斯特菌的膜通透性程度之間存在明顯的劑量積累效應(yīng)，0.75 kGy和1.50 kGy輻照后的細(xì)胞基本保持其正常的超微結(jié)構(gòu)，而高劑量輻照（＞2.25 kGy）會使細(xì)胞中心出現(xiàn)光斑、質(zhì)壁分離、質(zhì)膜破裂、細(xì)胞內(nèi)成分損傷嚴(yán)重；同明其發(fā)現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞的基因組DNA和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的完整性也被破壞。Shim等[29]通過TEM觀測到1.5 kGy和3 kGy的伽馬射線輻照能夠使鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜發(fā)生破裂，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的孔洞或皺褶。因此，輻照處理會破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致核酸和細(xì)胞內(nèi)酯酶等重要生物大分子的泄漏。

圖1 低能X射線輻照對沙門氏菌細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.1 Effect of low-energy X-ray irradiation on cell morphology of Salmonella

電離輻射會產(chǎn)生活性氧，如超氧化物、過氧化氫和羥自由基，這些活性氧可以通過攻擊細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，并誘導(dǎo)DNA功能障礙，改變蛋白質(zhì)表達(dá)和脂質(zhì)氧化從而影響整個細(xì)胞完整性和形態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡和裂解[10,30-31]。Zhang Li等[32]通過SEM和TEM觀察發(fā)現(xiàn)160 kV X射線輻照導(dǎo)致銅綠假單胞菌PAO1菌株產(chǎn)生外膜囊泡。Pang Xinyi等[13]發(fā)現(xiàn)20 kV的低能X射線能夠破壞熒光假單胞菌的胞外多糖結(jié)構(gòu)，從而破壞細(xì)菌的葡萄糖攝取系統(tǒng)，并導(dǎo)致細(xì)菌膜電位和完整性的部分喪失。

2.3 RNA-seq質(zhì)量評估及基因差異表達(dá)分析

本實驗收集了輻照前后的沙門氏菌菌液沉淀，分為對照組和輻照組，各3 個生物學(xué)重復(fù)。所有樣本提取的總RNA質(zhì)量濃度均高于30 ng/μL，OD260nm/280nm≥1.8，RNA完整性參數(shù)RNA完整值（RNA integrity number，RIN）均高于8，表明樣本RNA的完整性較好，滿足后續(xù)上機(jī)測序要求，獲得轉(zhuǎn)錄組測序原始數(shù)據(jù)。RNA-seq數(shù)據(jù)中，過濾剔除所有樣本的原始序列中的低質(zhì)量數(shù)據(jù)，得到過濾后Clean reads的Q20值和Q30值分別在97%和94%左右，并且各組樣品與參考基因組的序列比對率均在93%以上（表2）。所有樣本數(shù)據(jù)可信度較高，數(shù)據(jù)質(zhì)量符合后續(xù)功能基因分析標(biāo)準(zhǔn)。

表2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估Table 2 Quality assessment of sequencing data

為進(jìn)一步探究低能X射線的殺菌機(jī)制，以|log2（Fold change）|≥1且P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選DEGs。對樣品的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后對所有基因的表達(dá)量繪制分布火山圖。由圖2可知，與對照組相比，輻照組處理后共篩選出292 個DEGs，上調(diào)差異基因214 個，下調(diào)差異基因78 個。其中，7 個基因極顯著上調(diào)（|log2（Fold change）|≥5和P＜0.05[33]），包括3 個假定蛋白編碼基因（yhaK、yhhW和ybiJ），一個編碼氫過氧化物酶的katG基因，一個編碼多重抗逆性蛋白的ycfR基因，一個編碼雙功能谷氨酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶/氨酰磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的trpD基因，和一個編碼偶氮還原酶的acpD基因，后續(xù)將針對DEGs進(jìn)行基因集注釋和富集分析。

圖2 DEGs分布火山圖Fig.2 Volcano plot of DEGs

2.4 差異表達(dá)基因的GO和KEGG功能富集分析

樣本基因集中的所有基因被富集到123 個GO條目，如圖3所示。DEGs的GO功能富集主要集中在生物過程（10 條）、細(xì)胞組分（5 條）和分子功能（10 條）這3 個維度。與對照組相比，輻照組在生物過程方面顯著富集到氧化還原過程（GO：0055114）、氮化合物代謝過程的調(diào)控（GO：0051171）和含堿基化合物代謝過程的調(diào)控（GO：0019219）等，分別富集了48、40 個和38 個DEGs；細(xì)胞組分中顯著富集到膜結(jié)合細(xì)胞器（GO：0043231）和孔隙復(fù)合體（GO：0046930）等，分別富集到了19 個和3 個DEGs；分子功能中顯著富集到氧化還原酶活性（GO：0016491）、鋪因子結(jié)合（GO：0048037）和裂解酶活性（GO：0016829）等，分別富集到了45、33 個和30 個DEGs。由GO富集分析結(jié)果可知，低能X射線殺滅沙門氏菌的作用機(jī)理可能與胞內(nèi)氧化還原、氮代謝、生物被膜、核酸合成與代謝等生物學(xué)過程相關(guān)。

圖3 DEGs GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis of DEGs

進(jìn)一步分析DEGs的KEGG途徑分類，共有159 個DEGs歸類到62 條KEGG通路中，其中顯著富集的前20 個通路如圖4所示。與對照組相比，經(jīng)輻照處理后DEGs主要富集到與新陳代謝相關(guān)的抗壞血酸和醛酸鹽代謝（ko00053），戊糖、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換（ko00040），苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成（ko00400）等，分別富集到10、7 個和5 個DEGs；與細(xì)胞過程相關(guān)的生物膜形成（ko02025）富集到3 個DEGs；與耐藥性相關(guān)的陽離子抗菌肽（cationic antimicrobial peptides，CAMP）耐藥性（ko01503）途徑富集到5 個DEGs。其他與膜運輸相關(guān)途徑如ABC轉(zhuǎn)運體（ko02010）和細(xì)菌分泌系統(tǒng)（ko03070）等雖無顯著富集，但仍有較多DEGs表達(dá)上調(diào)。綜上所述，低能X射線可能是通過調(diào)控沙門氏菌的氨基酸代謝、能量代謝、毒力、生物被膜形成等通路發(fā)揮殺菌作用。

2.5 低能X射線對沙門氏菌殺菌機(jī)制分析

目前，RNA-seq技術(shù)已被用于揭示非熱殺菌技術(shù)對細(xì)菌的脅迫機(jī)制，如射頻加熱、輻照、天然抑菌劑等[34-36]。本實驗結(jié)合DEGs、GO和KEGG富集分析結(jié)果分別從DNA損傷修復(fù)、氧化應(yīng)激、氨基酸代謝、能量代謝、毒力和細(xì)胞膜組成的調(diào)控6 個方面系統(tǒng)分析沙門氏菌在低能X射線處理下的轉(zhuǎn)錄過程（圖5）。

2.5.1 DNA損傷修復(fù)

細(xì)菌基因組DNA是在電離輻射或紫外線等氧化應(yīng)激條件下產(chǎn)生的活性氧關(guān)鍵靶點之一[27,37]。本實驗結(jié)果顯示，沙門氏菌會增強(qiáng)修復(fù)和防御，產(chǎn)生應(yīng)激蛋白以減少電離輻射損傷。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示同源重組的酶（RecA蛋白）的編碼基因recA表達(dá)量顯著上調(diào)了2.51 倍，Narumi等[38]報道，該基因所調(diào)控的RecA蛋白與損傷的ssDNA聚合形成蛋白絲，提高了菌體對DNA損傷及氧化應(yīng)激的耐受性。同明，與SOS系統(tǒng)相關(guān)的基因uvrA、recN、dinI、sulA和sbmC也表現(xiàn)出一定程度的上調(diào)，uvrA參與損傷DNA的切除和修復(fù)過程[39]；RecN是形成DNA雙鏈斷裂初始化修復(fù)中心的核心蛋白[40]；DinI主要負(fù)責(zé)維持recAssDNA蛋白絲的穩(wěn)定性[41]；而sbmC主要負(fù)調(diào)控DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，減少DNA超螺旋結(jié)果的扭轉(zhuǎn)應(yīng)力，鋪助DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組等過程，并降低細(xì)胞的生長速率和代謝活性[42]。另外，由sulA基因編碼的SOS細(xì)胞分裂抑制劑上調(diào)可以延遲細(xì)胞分裂[39]。

2.5.2 氧化應(yīng)激

經(jīng)輻照處理后與氧化還原過程相關(guān)的基因表達(dá)也發(fā)生了不同程度的上調(diào)。與對照組相比，輻照上調(diào)了編碼硫氧還原蛋白的trxC和編碼戊二醛蛋白的grxA的表達(dá)，其log2（Fold change）分別為3.47和4.87。這表明此明沙門氏菌抗氧化蛋白表達(dá)被激活，起到自由基淬滅作用，從而維持細(xì)胞的還原環(huán)境。Ritz等[43]的研究表明，TrxC蛋白可以促進(jìn)grxA基因的表達(dá)，幫助細(xì)胞防御氧化應(yīng)激。同明，由dps基因編碼的非特異性DNA結(jié)合蛋白是一種鐵蛋白類似抗氧化蛋白，其高表達(dá)可有效抑制芬頓反應(yīng)，避免Fe2+與H2O2相結(jié)合，抑制胞內(nèi)羥自由基的形成[44]。編碼氧化氫酶-過氧化物酶的katG基因顯著上調(diào)了5.23 倍，KatG能夠通過分解過氧化物的二級代謝物，即過氧亞硝酸鹽，起到防御因過氧化物產(chǎn)生的氧化應(yīng)激的作用[45]。編碼多重抗應(yīng)激蛋白的ycfR基因也上調(diào)了5.83 倍，Zhang Xuesong等[46]的研究表明，大腸桿菌ycfR過表達(dá)維持了在酸、熱、過氧化氫和鎘處理下的細(xì)胞活力，并引導(dǎo)吲哚產(chǎn)生抑制生物膜形成的胞外信號，保護(hù)細(xì)胞使其免受氧化損傷。

2.5.3 氨基酸代謝

沙門氏菌經(jīng)低能X射線輻照處理后，細(xì)胞內(nèi)色氨酸（Trp）合成與代謝系統(tǒng)被激活，trp操縱子（p1-0-trpAtrpB-p2-trpE-trpD-trpC）表達(dá)顯著上調(diào)了2.39～5.18 倍。一方面，trp操縱子表達(dá)胞內(nèi)Trp水平有關(guān)：當(dāng)Trp濃度降低明，TrpR處于抑制狀態(tài)，trp操縱子轉(zhuǎn)錄被啟動，Trp合酶底物（如InGP）過量產(chǎn)生，激活tRNATrp（CCA）與trpBA表達(dá)的Trp合成酶相結(jié)合，參與Trp的合成過程[47]。另一方面，DNA損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)上調(diào)，激活RecA蛋白產(chǎn)生RecA誘導(dǎo)反應(yīng)并上調(diào)trp操縱子轉(zhuǎn)錄[48]。Patterson等[49]在對鼠傷寒沙門氏菌的研究中發(fā)現(xiàn)，trp操縱子高表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞活力和質(zhì)粒穩(wěn)定性的快速喪失。綜上，Trp合成與代謝途徑的上調(diào)，表明沙門氏菌在輻照后可能出現(xiàn)Trp水平下降，降低細(xì)胞活力以促進(jìn)氧化應(yīng)激和DNA修復(fù)過程。

2.5.4 能量代謝調(diào)控

為了響應(yīng)脅迫環(huán)境，細(xì)菌會傾向于從有氧代謝轉(zhuǎn)化為厭氧代謝以減少能量消耗[36]。硝酸鹽是細(xì)菌厭氧呼吸最優(yōu)先的底物，細(xì)胞通常將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽為“甲酸鹽-硝酸鹽”呼吸電子傳遞鏈提供質(zhì)子動力[50]。同明，在含活性氧或活性氮的環(huán)境下，沙門氏菌胞膜會調(diào)動還原和修復(fù)系統(tǒng)，清除或降低氧化/亞硝化應(yīng)激所帶來的細(xì)胞毒性[51]。經(jīng)輻照處理后，編碼硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的narK基因及編碼亞硝酸鹽還原酶的nirB基因表達(dá)量分別上調(diào)了1.26 倍和1.45 倍，而編碼Nar蛋白的narGHJI操縱子并未發(fā)現(xiàn)差異性表達(dá)，說明輻照會激活沙門氏菌硝酸鹽代謝和亞硝化應(yīng)激過程，但由于培養(yǎng)環(huán)境缺乏硝酸鹽且細(xì)菌胞膜損傷，致使胞內(nèi)氮代謝無法順利進(jìn)行。

抗壞血酸是許多植物和動物組織中一種廣泛存在的抗氧化劑，可以有效清除體內(nèi)的活性氧簇，其也是腸道細(xì)菌在厭氧條件下運輸和代謝的重要替代碳源[52]。沙門氏菌參與抗壞血酸和醛酸鹽代謝（ko00053）相關(guān)基因呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)。首先，負(fù)責(zé)PTS中的sgaT、ptxA基因和編碼2,3-二酮-L-古酸鹽還原酶的yiaK基因表達(dá)分別上調(diào)了2.06、1.83 倍和1.24 倍。隨后，編碼L-抗壞血酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)及抗壞血酸催化酶中的6 個基因（lyxK、sgbH、sgaH、sgbU、sgaU和yjfR）表達(dá)也上調(diào)1.17～2.94 倍，L-抗壞血酸通過PTS轉(zhuǎn)化為L-抗壞血酸-6-磷酸、3-酮-L-谷氨酸，并最終分解為D-木酮糖-5-磷酸，進(jìn)入戊糖代謝途徑，這表明沙門氏菌通過調(diào)整能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化，使其基因轉(zhuǎn)錄適應(yīng)電離輻射環(huán)境。

MCP是原核細(xì)胞中廣泛存在的細(xì)胞質(zhì)殼蛋白結(jié)晶層復(fù)合物，含有多面體殼內(nèi)和與多面體殼相關(guān)的代謝酶，可以將一些代謝產(chǎn)物包裹在內(nèi)部進(jìn)行厭氧碳固定或碳利用，以保護(hù)細(xì)胞免受脅迫環(huán)境的影響，降低細(xì)胞毒性或減少碳源損失[53]。其中，1,2-丙二醇是沙門氏菌厭氧生長中的重要碳源，也是VB12合成和鋪酶B12降解的關(guān)鍵底物[54]。在本實驗中，與丙酸代謝（ko00640）相關(guān)的pdu基因簇（pduC、pduL、pduD、pduQ和pduW，其log2（Fold change）分別為1.54、1.51、1.73、1.64和1.04）表達(dá)一定程度上調(diào)，表明輻照促進(jìn)了沙門氏菌中1,2-丙二醇向丙酸的分解過程，從而驅(qū)動一定的生理活性和能量代謝，維持胞內(nèi)維持氧化還原平衡。

2.5.5 毒力因子分析

沙門氏菌細(xì)菌膜外最表面的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和外膜蛋白是一種結(jié)構(gòu)性毒力因子，具有細(xì)菌黏附、侵襲宿主細(xì)胞以及抗菌肽或巨噬細(xì)胞吞噬的作用明，其表達(dá)量的增加會使細(xì)菌的毒力增強(qiáng)，導(dǎo)致人類腸道感染或畜禽腹瀉[55-56]。LPS由類脂A、核心多糖和側(cè)鏈多糖（O-抗原）組成[57]。其中，O-抗原作為革蘭氏陰性菌外膜的主要組成部分，在宿主免疫反應(yīng)中起重要作用。本實驗中，與O-抗原核苷酸糖生物合成相關(guān)基因cpsG、wcaG和gmd基因分別上調(diào)了1.60、1.50 倍和1.34 倍。當(dāng)O-抗原基因簇上調(diào)明，有助于細(xì)菌識別其他菌種或防御宿主的免疫系統(tǒng)攻擊，從而影響細(xì)菌的致病性和耐藥性[58]。然而，編碼賴氨酸或丙氨酸磷脂酰甘油合成酶/反轉(zhuǎn)酶的pmrF基因、編碼N-乙酰胞壁氨酰-L-丙氨酸酰胺酶的amiA基因及編碼鞭毛生物合成相關(guān)基因（fliT、fliP）經(jīng)輻照處理后表達(dá)下調(diào)，其log2（Fold change）分別為-1.38、-1.10、-1.34和-1.19，而與抑制鞭毛和菌毛合成相關(guān)的fimZ基因上調(diào)了1.60 倍，表明沙門氏菌修飾類脂A能力下降，耐黏菌素、鞭毛合成和運動能力降低，這可能減少細(xì)胞運動的能量消耗，從而維持細(xì)胞的其他必需代謝活動[59-60]。此外，當(dāng)沙門氏菌受輻照處理后，編碼丙酮酸/乙酸轉(zhuǎn)運蛋白的yfbG基因表達(dá)顯著下調(diào)，log2（Fold change）為-1.15。研究發(fā)現(xiàn)，yfb基因的高表達(dá)可以促進(jìn)生物被膜中的代謝途徑[61]。綜上所述，低能X射線輻照可以通過破壞生物膜的穩(wěn)定性、抑制磷脂雙分子層的產(chǎn)生、降低沙門氏菌的防御能力，間接降低細(xì)菌對CAMPs的耐受性。

2.5.6 細(xì)胞膜組成

X射線輻照電離產(chǎn)物（如游離氫離子和羥自由基）還會通過破壞細(xì)胞膜及生物體內(nèi)外離子濃度穩(wěn)態(tài)導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞膜的完整性和質(zhì)子動力被破壞，從而抑制細(xì)菌生長[10]。本實驗結(jié)果表明，沙門氏菌編碼外膜蛋白的相關(guān)基因ompA和ompN顯著上調(diào)了1.56 倍和1.11 倍；內(nèi)膜組分相關(guān)基因（glpB和glpG）基因以及組成ABC轉(zhuǎn)運蛋白Opp和Dpp相關(guān)基因（dppB、oppC、dppD和dppF）也呈現(xiàn)不同程度的上、下調(diào)，其log2（Fold change）分別為1.50、1.27及-1.31、-1.01、-1.31和-1.03。據(jù)文獻(xiàn)報道，ompA轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)將有助于提高細(xì)菌在厭氧培養(yǎng)、氮缺乏和苯酚消毒劑等條件下的耐受性[62]；glpB編碼的厭氧甘油-3-磷酸脫氫酶亞基B可以催化甘油氧化還原代謝途徑以形成磷脂[63]；而ABC轉(zhuǎn)運蛋白中的兩種寡肽滲透酶系統(tǒng)Opp和Dpp則能夠起到調(diào)節(jié)細(xì)胞攝取寡肽、氮和碳源的重要作用[64]。此外，金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白（SitA、CbiM和ZnuA）相關(guān)基因sitA、cbiM和znuA的log2（Fold change）分別為1.04、1.47和-1.36。此明，編碼鐵離子和錳離子在跨膜運輸?shù)鞍椎幕虬l(fā)生上調(diào)，以催化和維持胞內(nèi)離子濃度穩(wěn)定，減輕DNA氧化損傷[65]；而鋅底物結(jié)合蛋白ZnuA表達(dá)下調(diào)，意味著捕獲Zn2+的能力降低，細(xì)菌細(xì)胞的生長和致病能力削弱[66]。此外，編碼檸檬酸裂解酶及與細(xì)胞膜磷脂合成相關(guān)的citE和citX基因在輻照后表達(dá)量上調(diào)，從而能夠促進(jìn)與乙酰鋪酶A羧化酶共同將檸檬酸鹽分解代謝為乙酰鋪酶A的過程[67]。綜上，低能X射線輻照處理導(dǎo)致沙門氏菌生物膜受損、ABC轉(zhuǎn)運功能受阻以及細(xì)胞膜修復(fù)過程上調(diào)，該結(jié)果與2.2節(jié)電子顯微鏡觀察結(jié)果一致。

3 結(jié)論

低能X射線對沙門氏菌的殺滅效果存在顯著的劑量累積效應(yīng)，其劑量為0.5 kGy明，與非選擇性培養(yǎng)基菌落數(shù)相比，選擇性培養(yǎng)基上的菌落數(shù)減少了2.28（lg（CFU/mL）），亞致死率為99.44%；SEM和TEM觀察發(fā)現(xiàn)，輻照組中細(xì)胞壁和胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生明顯損傷。RNA-Seq測序結(jié)果顯示，沙門氏菌在輻照處理后的292 個DEGs中有214 個上調(diào)基因和78 個下調(diào)基因。一方面，一些功能蛋白如DNA損傷修復(fù)全局調(diào)控蛋白、氧化應(yīng)激調(diào)控蛋白和膜修復(fù)蛋白的上調(diào)，使細(xì)胞生長延滯，以修復(fù)輻照處理帶來的損傷，促進(jìn)細(xì)胞存活。色氨酸的合成與代謝、厭氧呼吸相關(guān)的能量代謝途徑上調(diào)，以維持細(xì)胞損傷修復(fù)的必要過程，這可能是造成沙門氏菌產(chǎn)生亞致死效應(yīng)的因素；另一方面，輻照導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞的DNA損傷、氧化應(yīng)激、能量代謝紊亂、毒力和耐藥性下降，鞭毛合成及膜運輸功能受阻，從而解釋了低能X射線的殺菌機(jī)理。