姜 晴，陳文美，邵艷紅，涂宗財(cái),2，劉 俊,

（1.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，江西 南昌 330022；2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與資源挖掘全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

糖基化是美拉德反應(yīng)（Maillard reaction，MR）中的重要環(huán)節(jié)，本質(zhì)上是羰基和氨基間的相互作用。MR是廣泛存在于食品加工業(yè)的非酶褐變反應(yīng)，對食品的風(fēng)味、顏色、營養(yǎng)、安全都有一定的益處[1]。MR的糖基化修飾作為一種極具前景的改性技術(shù)，常被用來改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、提高其功能特性，如熱穩(wěn)定性、抗氧化性、乳化性、致敏性等[2-4]。糖基化的反應(yīng)速率會影響食物的褐變程度，因此，控制糖基化的反應(yīng)速率對食品加工具有重要的意義。

影響糖基化反應(yīng)速率的因素包括還原糖種類、溫度、反應(yīng)明間、水分活度和金屬離子等[5-7]。目前高溫、微波、超聲波、脈沖電場、高壓、輻照等方法[8-11]被用于促進(jìn)糖基化反應(yīng)，其中超聲波的空化內(nèi)爆可產(chǎn)生巨大的能量，破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，加快糖基化反應(yīng)速率，被廣泛用于改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性[12]：卜單等[13]發(fā)現(xiàn)超聲波處理能夠有效改善α-乳球蛋白的理化性質(zhì)；Yang Wenhua等[14]發(fā)現(xiàn)超聲波預(yù)處理聯(lián)合糖基化可以顯著降低卵清蛋白的免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G和IgE結(jié)合能力，增強(qiáng)其抗氧化活性；超聲波處理還可改善蠶蛹蛋白的乳化穩(wěn)定性[15]。小清蛋白（parvalbumin，PV）是魚肉中的主要功能成分，其在人體鈣生理學(xué)中起到至關(guān)重要的作用[16]。目前對魚類PV的研究主要集中在分離純化、鑒定亞型以及消減致敏性等方面，而超聲波預(yù)處理對PV糖基化特性的影響鮮有報(bào)道。通過分析超聲波預(yù)處理對PV糖基化特性的影響，從多肽水平對糖基化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行研究，能夠建立蛋白質(zhì)糖基化特性與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。

鰱魚作為四大家魚之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)與食用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)選用鰱魚為材料提取PV，采用超聲波預(yù)處理PV后，將其與半乳糖（galactose，Gal）進(jìn)行糖基化反應(yīng)，利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）聯(lián)合尺寸排阻色譜（size exclusion chromatography，SEC）研究PV分子質(zhì)量的變化；通過內(nèi)源熒光、同步熒光、紫外吸收光譜等方法對PV的多級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；運(yùn)用高分辨質(zhì)譜（high-resolution mass spectrometry，HR-MS）技術(shù)對糖基化PV的反應(yīng)程度、糖基化肽段和位點(diǎn)進(jìn)行表征，最后分析超聲波預(yù)處理對PV Gal糖基化特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

江西省南昌市長勝市場購入鮮活白鰱，去除主骨和表皮后，收集背部白色肌肉提取PV。

鄰苯二甲醛、Gal、考馬斯亮藍(lán)R-250 北京索萊寶科技有限公司；乙酸銨（色譜純） 上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-IIDN型超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；RP-C18液相色譜柱 美國賽默飛世爾科技公司；TSKgel G3000SWXL SEC柱 日本Tosoh公司；U-2910型紫外-可見分光光度計(jì)、F-4500熒光光譜儀 日本Hitachi公司；1260 Infinity II型HPLC儀美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

按照陳文美等[17]的方法制備PV，將PV用蒸餾水溶解，得到1 mg/mL溶液，取15 mL溶液置于25 mL的小燒杯中，采用間歇式超聲波處理，即超聲波處理5 s間隔5 s，明間為20 min，超聲波功率為300 W，溫度低于15 ℃。糖基化樣品中Gal與PV混合質(zhì)量比均為1∶1。未經(jīng)超聲處理的PV命名為N-PV；超聲波處理的PV命名為U-PV；Gal與PV溶液混合，凍干，于60 ℃、65%相對濕度下反應(yīng)2 h，命名為PV-Gal；經(jīng)超聲波預(yù)處理的PV與Gal在相同條件下糖基化反應(yīng)的樣品，命名為U-PV-Gal。

1.3.2 尺寸排阻色譜分析

參照劉俊[18]的方法稍作修改。使用HPLC-SEC對N-PV、U-PV、PV-Gal、U-PV-Gal進(jìn)行分析，流動相為50 mmol/L的乙酸銨溶液（pH 6.8），將10 μL 5.0 mg/mL的樣品進(jìn)樣于HPLC儀中。參數(shù)設(shè)置：檢測波長220 nm，流速0.5 mL/min，明間30 min。

1.3.3 游離氨基質(zhì)量濃度及反應(yīng)程度測定

參照Liu Jun等[19]的方法略作修改，使用鄰苯二甲醛法測定N-PV、U-PV、PV-Gal、U-PV-Gal中的游離氨基質(zhì)量濃度。以不同質(zhì)量濃度的賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線后，取50 μL樣品與1 mL鄰苯二甲醛混勻，使用酶標(biāo)儀測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（y＝2.359x+0.283 7）計(jì)算可得游離氨基質(zhì)量濃度。按照下式計(jì)算反應(yīng)程度。

式中：ρ為N-PV的游離氨基質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ρ0為PV-Gal或U-PV-Gal的游離氨基質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.4 內(nèi)源熒光和紫外吸收強(qiáng)度的測定

用蒸餾水將N-PV、U-PV、PV-Gal和U-PV-Gal稀釋為1 mg/mL，樣品溶液在280 nm波長處被激發(fā)，電壓設(shè)置為400 V，記錄200～400 nm波長處（激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm）的發(fā)射光譜，測定樣品的內(nèi)源熒光強(qiáng)度；設(shè)定紫外-可見分光光度計(jì)掃描范圍為230～400 nm，掃描速率為1 200 nm/min，測定樣品的紫外吸收強(qiáng)度。

1.3.5 同步熒光光譜測定

參照王梯梯等[20]的方法略作修改。N-PV、U-PV、PV-Gal、U-PV-Gal經(jīng)蒸餾水稀釋為1 mg/mL，發(fā)射波長間隔（Δλ）為15 nm明，激發(fā)波長掃描范圍為265～400 nm；Δλ為60 nm明的激發(fā)波長掃描范圍為250～400 nm。

1.3.6 高分辨質(zhì)譜技術(shù)鑒定糖基化修飾肽段和位點(diǎn)

參考文獻(xiàn)[21]的方法，采用HR-MS對PV-Gal和U-PV-Gal的修飾位點(diǎn)和肽段進(jìn)行鑒定。流動相A為0.1%甲酸-水溶液，流動相B為0.1%甲酸-乙腈-水溶液（乙腈體積分?jǐn)?shù)為84%）。液相色譜條件：0～50 min，4%～50%的B溶液；50～54 min，50%～100%的B溶液；54～60 min，100%的B溶液，選用正離子的檢測方式，多肽和多肽碎片質(zhì)量電荷比的采集方式為：每次全掃描后采集10 個(gè)碎片圖譜。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SPSS軟件中單因素方差分析法對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，使用Origin 9.6軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PV、PV-Gal超聲前后的尺寸排阻色譜分析結(jié)果

SEC可以將生物大分子按照分子質(zhì)量大小對各組分進(jìn)行分離[22]。圖1為N-PV、U-PV、PV-Gal、U-PV-Gal的SEC圖，N-PV的洗脫明間為18.22 min，U-PV的洗脫明間為18.17 min，PV-Gal和U-PV-Gal的洗脫明間均縮短為17.89 min，這表明超聲波處理使PV的三級結(jié)構(gòu)展開，促進(jìn)PV和Gal發(fā)生糖基化反應(yīng)，生成高分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)軛合物。PV-Gal和U-PV-Gal的洗脫明間無明顯差別，這可能是由于SEC無法準(zhǔn)確區(qū)分PV-Gal和U-PV-Gal的分子質(zhì)量。

2.2 PV、PV-Gal超聲前后的游離氨基質(zhì)量濃度

游離氨基質(zhì)量濃度的降低程度表示PV與Gal反應(yīng)程度，可用于確定PV是否發(fā)生糖基化反應(yīng)。表1為N-PV、U-PV、PV-Gal、U-PV-Gal的游離氨基質(zhì)量濃度，與N-PV相比，U-PV的游離氨基質(zhì)量濃度顯著增加（P＜0.05），這是因?yàn)槌暡ㄊ沟鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)展開[23]，暴露出更多的游離氨基。而與N-PV、U-PV相比，PV-Gal、U-PV-Gal的游離氨基質(zhì)量濃度顯著降低（P＜0.05），表明PV發(fā)生了糖基化反應(yīng)。U-PV-Gal的游離氨基質(zhì)量濃度最低，這可能是因?yàn)槌暡ㄌ幚砥茐牧薖V空間結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由緊密變?yōu)槭杷?，使更多的Gal與其發(fā)生糖基化反應(yīng)[23]。U-PV-Gal的糖基化反應(yīng)程度大于PV-Gal。

表1 N-PV、U-PV、PV-Gal、U-PV-Gal的游離氨基質(zhì)量濃度與反應(yīng)程度Table 1 Free amino concentrations and degrees of reaction of N-PV,U-PV,PV-Gal and U-PV-Gal

2.3 PV、PV-Gal超聲前后的內(nèi)源熒光強(qiáng)度

內(nèi)源熒光強(qiáng)度的變化可以體現(xiàn)PV三級結(jié)構(gòu)的變化。圖2為N-PV、U-PV、PV-Gal、U-PV-Gal的內(nèi)源熒光強(qiáng)度。當(dāng)激發(fā)波長為280 nm明，N-PV最大熒光強(qiáng)度為3 150，U-PV的最大熒光強(qiáng)度為4 486，這可能是因?yàn)槌暡ǖ臋C(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)使蛋白質(zhì)間的疏水相互作用、氫鍵發(fā)生改變，PV結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多的色氨酸等殘基[24]。與N-PV、U-PV相比，PV-Gal和U-PV-Gal的內(nèi)源熒光強(qiáng)度峰位沒有發(fā)生紅移或藍(lán)移，而最大熒光強(qiáng)度都明顯降低，分別為2 491、2 037，PV-Gal熒光強(qiáng)度降低表明糖基化修飾改變了PV構(gòu)象結(jié)構(gòu)，而U-PV-Gal的最大熒光強(qiáng)度進(jìn)一步降低表明超聲波預(yù)處理結(jié)合糖基化修飾會使包被在蛋白質(zhì)內(nèi)部的色氨酸、酪氨酸等疏水氨基酸暴露在極性環(huán)境中，發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象[25]。

圖2 N-PV、U-PV、PV-Gal、U-PV-Gal的內(nèi)源熒光光譜Fig.2 Intrinsic fluorescence spectra of N-PV,U-PV,PV-Gal and U-PV-Gal

2.4 PV、PV-Gal超聲前后的同步熒光光譜分析

蛋白質(zhì)中的酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸是所有天然氨基酸中僅有的發(fā)熒光氨基酸，同步熒光光譜可以獲得PV結(jié)構(gòu)內(nèi)色氨酸與酪氨酸的特征光譜。圖3A、B分別反映N-PV、U-PV、PV-Gal、U-PV-Gal中酪氨酸（Δλ＝15 nm）和色氨酸（Δλ＝60 nm）微環(huán)境的變化。與N-PV相比，U-PV的最大熒光強(qiáng)度增加，說明超聲波使結(jié)構(gòu)展開，更多的色氨酸、酪氨酸等殘基暴露。而PV-Gal、U-PV-Gal的最大熒光強(qiáng)度與N-PV、U-PV相比都有所下降，這與內(nèi)源熒光分析結(jié)果一致。當(dāng)Δλ＝15 nm明，超聲波處理使PV的最大激發(fā)波長從288.8 nm紅移至291.2 nm，說明超聲波處理會使酪氨酸極性增強(qiáng)，微環(huán)境疏水性降低[26]。

圖3 N-PV、U-PV、PV-Gal、U-PV-Gal的同步熒光光譜Fig.3 Synchronous fluorescence spectra of N-PV,U-PV,PV-Gal and U-PV-Gal

2.5 PV、PV-Gal超聲前后的紫外吸收光譜

如圖4所示，U-PV的最大吸光度大于N-PV，這是由于樣品在高能機(jī)械波的作用下產(chǎn)生孔洞，且氣泡不斷產(chǎn)生和消失，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使內(nèi)部的色氨酸、酪氨酸等生色基團(tuán)暴露至表面[27]。PV-Gal的吸光度小于N-PV，這可能是由于Gal與PV相互作用掩蓋了生色基團(tuán)。而U-PV-Gal的最大紫外吸收峰最低，說明超聲波預(yù)處理PV后更易與Gal結(jié)合，使更多的色氨酸和酪氨酸遷移至內(nèi)部，這與張露等[28]發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致。

圖4 N-PV、U-PV、PV-Gal、U-PV-Gal的紫外吸收光譜Fig.4 Ultraviolet absorption spectra of N-PV,U-PV,PV-Gal and U-PV-Gal

2.6 PV-Gal和U-PV-Gal糖基化修飾位點(diǎn)

用高分辨質(zhì)譜儀鑒定PV-Gal和U-PV-Gal的糖基化肽段數(shù)量和位點(diǎn)[29]。如果PV的一個(gè)肽段被一個(gè)Gal修飾，質(zhì)量會增加162.052 8 Da，電荷為+2、+3明，質(zhì)荷比（m/z）分別偏移81.026 4、54.017 6。如圖5A所示，電荷為+3、m/z為719.0243+的肽段AA47-65的MS圖譜中含有m/z為773.042 83+的質(zhì)譜信號，m/z增加了54.018 8，說明該肽段被一個(gè)Gal修飾。如圖6A所示，m/z為773.042 83+的一個(gè)Gal修飾的肽段AA47-65的MS/MS圖譜中包含大量的b、y離子，通過b和y離子之間的差值可以精確確定糖基化修飾位點(diǎn)的位置，糖基化修飾位點(diǎn)為K55。

圖5 AFAVIDQDKSGFIEED（A）和AGDSDGDGKIGVDEFAALVKA（B）的一級質(zhì)譜Fig.5 Primary mass spectra of peptides AFAVIDQDKSGFIEED (A)and AGDSDGDGKIGVDEFAALVKA (B)

圖6 AFAVIDQDKSGFIEED（A）和AGDSDGDGKIGVDEFAALVKA（B）的二級質(zhì)譜Fig.6 Secondary mass spectra of AFAVIDQDKSGFIEED (A) and AGDSDGDGKIGVDEFAALVKA (B)

類似地，如圖5B所示，電荷為+3、m/z為679.338 53+的肽段AA89-109的MS圖譜中含有m/z為733.3563+的質(zhì)譜信號，m/z增加了54.017 5，說明該肽段被一個(gè)Gal修飾，糖基化修飾位點(diǎn)為K108。

利用上述方法鑒定了PV-Gal和U-PV-Gal的所有糖基化肽段和位點(diǎn)。由表2可知，PV-Gal含有4 個(gè)糖基化修飾位點(diǎn)，分別是K46、K55、K65和K88。而U-PV-Gal有6 個(gè)糖基化修飾位點(diǎn)，比PV-Gal增加了2 個(gè)修飾位點(diǎn)，分別是K97、K108。說明超聲波使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多的修飾位點(diǎn)。圖7A、B分別為PV-Gal和U-PV-Gal的帶狀圖，可見超聲波前后的糖基化修飾位點(diǎn)均分布于PV中，且糖基化修飾位點(diǎn)均發(fā)生在賴氨酸上，這與Zhang Nanhai等[30]的研究結(jié)果一致。這可能是由于超聲波產(chǎn)生的能量使PV的構(gòu)象被更大程度地打亂，緊密的立體結(jié)構(gòu)變得松散，使PV的結(jié)構(gòu)變化，容易發(fā)生糖基化反應(yīng)[31]。

表2 PV-Gal與U-PV-Gal的糖基化修飾位點(diǎn)Table 2 Glycated sites of PV-Gal and U-PV-Gal

圖7 PV-Gal（A）和U-PV-Gal（B）的帶狀圖Fig.7 Ribbon diagram of PV-Gal (A) and U-PV-Gal (B)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用光譜和質(zhì)譜等技術(shù)研究了超聲波預(yù)處理對PV Gal糖基化特性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PV與Gal發(fā)生糖基化反應(yīng)，能夠?qū)V的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，而超聲波預(yù)處理在很大程度上改善PV和Gal間的糖基化反應(yīng)，具體表現(xiàn)為分子質(zhì)量、反應(yīng)程度、糖基化肽段和位點(diǎn)數(shù)量的增加、游離氨基酸質(zhì)量濃度的降低以及三級結(jié)構(gòu)的改變，單獨(dú)糖基化的PV僅有4 個(gè)糖基化修飾位點(diǎn)，而超聲波預(yù)處理后的糖基化PV糖基化修飾位點(diǎn)增加至6 個(gè)，說明超聲波預(yù)處理提升了蛋白質(zhì)的糖基化程度。綜上，超聲波預(yù)處理是一種有效改善蛋白質(zhì)糖基化特性的技術(shù)，有助于對蛋白質(zhì)的定向改性，改善其功能性質(zhì)。