陳曉敏，劉 娜，張麗娜，李友佳 （西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，西安 710004）

多肽在內(nèi)分泌、免疫、神經(jīng)系統(tǒng)等生命活動(dòng)中發(fā)揮了重要作用，目前已有上百種多肽藥物獲批上市，被廣泛用于抗腫瘤、抗病毒、降糖等領(lǐng)域[1-2]。同時(shí)，多肽藥物因活性高、劑量小、毒副作用少等優(yōu)點(diǎn)，已成為新藥研發(fā)的熱點(diǎn)之一[3]。盡管多肽藥物安全性較高，但仍會(huì)引發(fā)紅腫、皮疹、瘙癢、蕁麻疹甚至過敏性休克等多種不良反應(yīng)，臨床仍需予以關(guān)注。其中，多肽藥物致過敏樣癥狀不屬于典型的Ⅰ型超敏反應(yīng)，其嚴(yán)重程度與藥物注射劑量密切相關(guān)，且可能與肥大細(xì)胞直接活化所致藥物類過敏反應(yīng)相關(guān)，如艾塞那肽引起的過敏性休克、萬古霉素引起的嚴(yán)重“紅人綜合征”等[4-6]。

Mas 相關(guān)G 蛋白偶聯(lián)受體X2（Mas-related G protein-coupled receptor X2，MRGPRX2）是表達(dá)于肥大細(xì)胞的一類G 蛋白偶聯(lián)受體[7]。研究顯示，激活后的MRGPRX2可促使肥大細(xì)胞活化，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子含量迅速升高，并進(jìn)一步釋放顆粒物質(zhì)和過敏介質(zhì)，從而引起類過敏反應(yīng)[8-9]。有研究證實(shí)，P 物質(zhì)（substance P，SP）、促分泌素等內(nèi)源性多肽和阿片類、四氫異喹啉類、喹諾酮類等小分子藥物均可通過直接激活MRGPRX2而引發(fā)類過敏反應(yīng)[10-11]；此外，艾替班特、奧曲肽、西曲瑞克等多肽藥物也被證實(shí)可通過MRGPRX2 激活肥大細(xì)胞而引發(fā)皮疹、瘙癢甚至過敏性休克等類過敏反應(yīng)癥狀，表明MRGPRX2是介導(dǎo)多肽藥物致類過敏反應(yīng)的關(guān)鍵受體[12-13]。

為提高多肽藥物的臨床安全性、降低多肽藥物臨床試驗(yàn)的失敗率，多項(xiàng)研究針對多肽結(jié)構(gòu)及其激活MRGPRX2 的作用進(jìn)行了評價(jià)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)可激活MRGPRX2的多肽具有相似的序列，包括帶正電荷的氨基酸（如賴氨酸、精氨酸）和脂肪族氨基酸（如丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸）；同時(shí)，這類多肽在pH7.0 下通常帶正電荷，且所含疏水氨基酸比例較高[14-15]。本課題組前期基于SP 等肽類物質(zhì)開展了一系列結(jié)構(gòu)分析及活性評價(jià)，構(gòu)建了一個(gè)小分子肽（十一肽以內(nèi)）化合物庫，并從中發(fā)現(xiàn)了一種可激活肥大細(xì)胞的九肽IVQKIKHCF[由異亮氨酸（Ile）、纈氨酸（Val）、谷氨酰胺（Gln）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、半胱氨酸（Cys）、苯丙氨酸（Phe）組成，即H2N-Ile-Val-Gln-Lys-Ile-Lys-His-Cys-Phe-COOH]。在此基礎(chǔ)上，本研究擬進(jìn)一步證實(shí)IVQKIKHCF 對肥大細(xì)胞的激活作用是否與MRGPRX2有關(guān)，旨在為多肽藥物的設(shè)計(jì)與開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括MCO-15AC 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）、800TS型酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）、LCMS-8040型三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（日本Shimadzu 公司）、Ti-U 型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

IVQKIKHCF[純度98%（經(jīng)高效液相色譜法測定）]由南京肽業(yè)生物科技有限公司合成、表征；胎牛血清購自美國Gibco 公司；DMEM 培養(yǎng)基購自美國Corning 公司；StemPro-34 培養(yǎng)基購自美國Invitrogen 公司；Opti-MEM培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；100×青-鏈霉素雙抗購自依科賽生物科技（太倉）有限公司；SP購自西安易飛生物科技有限公司；β-氨基己糖、氘代組胺（內(nèi)標(biāo)）均購自美國Sigma-Aldrich 公司；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑、Fluo-3 AM/鈣離子熒光探針均購自美國Invitrogen公司；Q5?定點(diǎn)突變試劑盒購自美國NEB 公司；人腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素8（interleukin-8，IL-8）、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1β（macrophage inflammatory protein-1β，MIP-1β）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒均購自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；MrgprX2干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）片段和作為陰性對照的無序siRNA片段均由蘇州吉瑪基因股份有限公司設(shè)計(jì)、合成，前者上、下游序列分別為5'-GUACAACAGUGAAUGGAAATT-3'、5'-UUUCCAUUCACUGUUGUACTT-3'，后者上、下游序列分別為5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'、5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。

1.3 細(xì)胞

人肥大細(xì)胞系LAD2 細(xì)胞由美國國立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，NIH）贈(zèng)予；人胚胎腎細(xì)胞系HEK293細(xì)胞和高表達(dá)MRGPRX2的人胚胎腎細(xì)胞系HEK293 細(xì)胞（MRGPRX2/HEK293 細(xì)胞）由賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將LAD2 細(xì)胞接種于含有Gln、100×青-鏈霉素雙抗、人干細(xì)胞生長因子和StemPro-34 營養(yǎng)補(bǔ)液的Stem-Pro-34 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。將HEK293 細(xì)胞和MRGPRX2/HEK293 細(xì)胞分別接種于含有胎牛血清和100×青-鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

2.2 β-氨基己糖苷酶釋放率的測定

將LAD2 細(xì)胞按1×105個(gè)/孔接種于96 孔板（每孔100 μL）中，于37 ℃下培養(yǎng)過夜；以1 500 r/min 離心5 min后吸棄上清液，將細(xì)胞分為陽性對照組、陰性對照組和不同濃度IVQKIKHCF 組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。陽性對照組加入3 μmol/L 的SP 溶液100 μL（以pH7.4 的臺(tái)式緩沖液為溶劑，該濃度的SP 具有明顯的MRGPRX2 激活效應(yīng)[10]，下同）；陰性對照組加入pH7.4 的臺(tái)式緩沖液100 μL；不同濃度IVQKIKHCF組加入25、50、100 μmol/L的IVQKIKHCF 溶液各100 μL（以pH7.4 的臺(tái)式緩沖液為溶劑，濃度依據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置，下同）。于37 ℃下培養(yǎng)30 min后，以1 500 r/min離心5 min，取各組上清液50 μL，加入1 mmol/L 的β-氨基己糖溶液[以0.1 mol/L檸檬酸溶液-0.1 mol/L檸檬酸鈉溶液（26∶24，V/V）為溶劑]50 μL，于37 ℃下孵育90 min 后，加入終止液150 μL，于室溫下振搖混勻2 min，使用酶標(biāo)儀于405 nm波長下檢測各孔的光密度（OD）值。陰性對照組吸棄剩余上清液，細(xì)胞加入Trition-X 裂解液輕輕吹打后，以2 000 r/min 離心5 min，取細(xì)胞裂解上清液50 μL，同法檢測其OD值。按下式計(jì)算各組細(xì)胞的β-氨基己糖苷酶釋放率：β-氨基己糖苷酶釋放率＝實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清液OD 值/（陰性對照組上清液OD 值+細(xì)胞裂解上清液OD值）×100%。

2.3 組胺釋放量的測定

將LAD2 細(xì)胞按1×105個(gè)/孔接種于96 孔板（每孔100 μL）中，于37 ℃下培養(yǎng)過夜；以1 500 r/min 離心5 min后吸棄上清液，將細(xì)胞分為陽性對照組、陰性對照組和不同濃度IVQKIKHCF 組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。陽性對照組加入3 μmol/L 的SP 溶液100 μL；陰性對照組加入臺(tái)式緩沖液100 μL；不同濃度IVQKIKHCF 組加入25、50、100 μmol/L的IVQKIKHCF溶液各100 μL。于37 ℃下培養(yǎng)30 min后，以1 500 r/min離心5 min，取上清液50 μL，加入氘代組胺（內(nèi)標(biāo)）溶液100 μL，振蕩10 s；于4 ℃下以12 000 r/min 離心10 min，吸取上清液50 μL，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定量分析各組細(xì)胞的組胺釋放量，具體檢測條件和計(jì)算方法見已發(fā)表文獻(xiàn)[16]。

2.4 炎癥因子釋放量的測定

將LAD2細(xì)胞按1×105個(gè)/孔均勻接種于96孔板（每孔100 μL）中，于37 ℃下培養(yǎng)過夜；以1 500 r/min離心5 min后吸棄上清液，將細(xì)胞分為陽性對照組、陰性對照組和不同濃度IVQKIKHCF 組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。陽性對照組加入3 μmol/L 的SP 溶液100 μL；陰性對照組加入臺(tái)式緩沖液100 μL；不同濃度IVQKIKHCF 組加入25、50、100 μmol/L的IVQKIKHCF溶液各100 μL。于37 ℃下孵育8 h后，以1 500 r/min離心5 min，取上清液，嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書操作，采用ELISA法以酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞上清液中炎癥因子（TNF-α、IL-8、MIP-1β、MCP-1）的含量。

2.5 敲低MrgprX2 對細(xì)胞β-氨基己糖苷酶釋放率的影響

取MrgprX2siRNA 片段75 pmol 和Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑7.5 μL，分別稀釋于Opti-MEM 培養(yǎng)基100 μL中，靜置2 min后，將上述兩者混勻，室溫靜置15 min；將LAD2 細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于6 孔板中，加入MrgprX2siRNA 和Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑的混合液，混勻，得轉(zhuǎn)染MrgprX2siRNA 片段的LAD2 細(xì)胞（KD-LAD2 細(xì)胞），備用。取無序siRNA 片段、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑和LAD2細(xì)胞，同法處理得轉(zhuǎn)染無序siRNA 片段的LAD2 細(xì)胞（NC-LAD2 細(xì)胞），備用。將上述兩種細(xì)胞按1×105個(gè)/孔接種于96孔板（每孔100 μL）中，于37 ℃下培養(yǎng)過夜；以1 500 r/min離心5 min后吸棄上清液，將兩種細(xì)胞均分為陽性對照組、陰性對照組和不同濃度IVQKIKHCF 組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。陽性對照組加入3 μmol/L 的SP 溶液100 μL；陰性對照組加入臺(tái)式緩沖液100 μL；不同濃度IVQKIKHCF 組加入25、50、100 μmol/L 的IVQKIKHCF 溶液各100 μL。于37 ℃下培養(yǎng)30 min 后，按“2.2”項(xiàng)下方法測定并計(jì)算各組細(xì)胞的β-氨基己糖苷酶釋放率。

2.6 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的檢測

將MRGPRX2/HEK293 細(xì)胞和HEK293 細(xì)胞按1×104個(gè)/孔分別接種于96 孔板（每孔100 μL）中，于37 ℃下培養(yǎng)過夜，使其貼壁生長。次日，吸棄培養(yǎng)基，加入pH7.4 且含5 ng/mL Fluo-3 AM 的鈣成像緩沖溶液（calcium imaging buffer，CIB），于37 ℃下孵育30 min。吸棄上清液，細(xì)胞以CIB 清洗2 次后，將MRGPRX2/HEK293細(xì)胞分為陽性對照組、空白對照組、不同濃度IVQKIKHCF組，將HEK293細(xì)胞作為陰性對照組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。陽性對照組加入3 μmol/L 的SP 溶液100 μL；空白對照組加入CIB 100 μL；不同濃度IVQKIKHCF 組加入25、50、100 μmol/L 的IVQKIKHCF溶液各100 μL；陰性對照組加入100 μmol/L 的IVQKIKHCF 溶液100 μL。隨后，立即使用倒置熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)變化情況（每秒拍照1 張，共拍照120 s），以反映細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化情況。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均采用±s表示，兩組樣本的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組樣本的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），進(jìn)一步兩兩比較采Dunnett’s（方差不齊）或LSD-t（方差齊）檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 IVQKIKHCF激活LAD2細(xì)胞引發(fā)脫顆粒反應(yīng)

SP 和25～100 μmol/L 的IVQKIKHCF 均可顯著提高LAD2 細(xì)胞的β-氨基己糖苷酶釋放率和組胺釋放量（P＜0.05），其中β-氨基己糖苷酶的平均釋放率由25 μmol/L IVQKIKHCF 組的19.92% 升高至100 μmol/L IVQKIKHCF 組的60.69%，組胺的平均釋放量由25 μmol/L IVQKIKHCF組的71.23 ng/mL升高至100 μmol/L IVQKIKHCF 組的146.87 ng/mL，均有一定的劑量依賴趨勢。結(jié)果見圖1。

圖1 各組LAD2細(xì)胞的β-氨基己糖苷酶、組胺釋放情況（n＝3）

3.2 IVQKIKHCF激活LAD2細(xì)胞釋放炎癥因子

與陰性對照組比較，100 μmol/L IVQKIKHCF 組和陽性對照組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-8 含量，50、100 μmol/L IVQKIKHCF 組和陽性對照組細(xì)胞上清液中MIP-1β 含量，以及各藥物組細(xì)胞上清液中MCP-1 含量均顯著升高（P＜0.05），其中IL-8、MIP-1β、MCP-1 含量的變化有一定的濃度依賴趨勢。結(jié)果見圖2。

圖2 各組LAD2細(xì)胞的炎癥因子釋放情況（n＝3）

3.3 IVQKIKHCF 對MrgprX2 敲低LAD2 細(xì)胞的激活作用減弱

與NC-LAD2 細(xì)胞比較，IVQKIKHCF 對KD-LAD2細(xì)胞的激活作用明顯減弱，其β-氨基己糖苷酶釋放率顯著降低（P＜0.05），提示IVQKIKHCF可能通過MRGPRX2激活LAD2細(xì)胞而引發(fā)脫顆粒反應(yīng)。結(jié)果見圖3。

圖3 各組NC-LAD2 細(xì)胞和KD-LAD2 細(xì)胞的β-氨基己糖苷酶釋放情況（n＝3）

3.4 IVQKIKHCF 引起MRGPRX2/HEK293 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高

與SP類似，在25～100 μmol/L的IVQKIKHCF作用下，MRGPRX2/HEK293細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度逐漸升高，且有一定的濃度依賴趨勢；但CIB無法升高細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，同時(shí)100 μmol/L 的IVQKIKHCF 亦無法激活HEK293 細(xì)胞的鈣動(dòng)員，進(jìn)一步表明IVQKIKHCF 可通過激活MRGPRX2 而引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高。結(jié)果見圖4（圖中，每條鈣成像曲線反映的是單個(gè)細(xì)胞的鈣離子濃度變化情況）。

4 討論

研究指出，MRGPRX2 介導(dǎo)的藥物過敏反應(yīng)廣泛存在于各類臨床藥物中，包括抗生素、阿片類鎮(zhèn)痛藥、肌肉松弛劑等。研究顯示，多肽類藥物也可激活MRGPRX2，引發(fā)類過敏反應(yīng)，嚴(yán)重者可導(dǎo)致患者休克或死亡[4-6]。因此，研究多肽激活MRGPRX2 的潛在機(jī)制，可有效促進(jìn)多肽藥物的開發(fā)，對提高其臨床安全性具有重要意義。

β-氨基己糖苷酶是肥大細(xì)胞內(nèi)預(yù)合成的代表性顆粒物質(zhì)[17]，組胺、TNF-α、MIP-1β、MCP-1 則是肥大細(xì)胞釋放的重要過敏介質(zhì)[8-9]，上述指標(biāo)在過敏性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中均具有重要作用。研究指出，藥物作用于MRGPRX2后可激活肥大細(xì)胞，肥大細(xì)胞可釋放上述顆粒物質(zhì)和過敏介質(zhì)，從而誘發(fā)類過敏反應(yīng)，且上述指標(biāo)的釋放量與肥大細(xì)胞的激活程度呈正相關(guān)，故研究者常通過上述指標(biāo)的高低來評價(jià)藥物對肥大細(xì)胞及MRGPRX2 激活效應(yīng)的強(qiáng)弱[8-9，17]。本研究結(jié)果顯示，25～100 μmol/L的IVQKIKHCF可顯著促進(jìn)LAD2細(xì)胞釋放β-氨基己糖苷酶和組胺，且上述作用有一定的濃度依賴趨勢；同時(shí)，IVQKIKHCF 可不同程度地增加LAD2細(xì)胞中TNF-α、IL-8、MIP-1β、MCP-1的釋放。

與NC-LAD2 細(xì)胞比較，IVQKIKHCF 對KD-LAD2細(xì)胞（即敲低MrgprX2的LAD2細(xì)胞）的激活作用明顯減弱，其β-氨基己糖苷酶釋放率顯著降低，提示IVQKIKHCF 可能通過MRGPRX2 激活LAD2 細(xì)胞而引發(fā)脫顆粒反應(yīng)；進(jìn)一步鈣成像實(shí)驗(yàn)證實(shí)，IVQKIKHCF與MRGPRX2 激動(dòng)劑SP 具有相似的效果，可顯著升高M(jìn)RGPRX2/HEK293 細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，且有一定的濃度依賴趨勢，但I(xiàn)VQKIKHCF 對陰性對照HEK293 細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度無明顯影響，初步證實(shí)IVQKIKHCF是通過MRGPRX2而激活細(xì)胞的鈣動(dòng)員。研究指出，鈣離子濃度升高可導(dǎo)致LAD2細(xì)胞釋放顆粒物質(zhì)、炎癥因子及過敏介質(zhì)，發(fā)生類過敏反應(yīng)，上述過程均直接與MRGPRX2的激活作用相關(guān)[10]。

綜上所述，九肽IVQKIKHCF 可通過MRGPRX2 激活肥大細(xì)胞LAD2，釋放顆粒物質(zhì)和炎癥介質(zhì)，從而引發(fā)類過敏反應(yīng)。在多肽藥物研發(fā)時(shí)應(yīng)注意上述結(jié)構(gòu)。