李月興，陳波洋，李 倩，陳 帥，陳云志 （貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550025）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種全身性自身免疫性疾病，除累及關(guān)節(jié)外，還涉及血管炎、心臟病、類風(fēng)濕結(jié)節(jié)等眾多關(guān)節(jié)外表現(xiàn)[1]。臨床數(shù)據(jù)顯示，多數(shù)RA 患者兼有包括動脈粥樣硬化、心肌梗死等在內(nèi)的心血管并發(fā)癥，故死亡風(fēng)險較高[2]。中性粒細(xì)胞是RA患者關(guān)節(jié)滑液中含量較高的免疫細(xì)胞，在受炎癥因子、活性氧等異物刺激后，可活化為中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）。NETs作為一種被瓜氨酸化組蛋白H3（citrullinated histone H3，CitH3）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）等顆粒蛋白修飾的DNA網(wǎng)狀物，有助于機(jī)體炎癥的控制；但當(dāng)體內(nèi)NETs含量過高時，跟隨其釋放到細(xì)胞外的組蛋白和蛋白酶等會加劇RA患者的免疫紊亂，并破壞內(nèi)皮細(xì)胞，從而造成循環(huán)系統(tǒng)損害[3]。

維生素D（vitamin D，VD）是體內(nèi)磷鈣代謝的關(guān)鍵信號分子，可在RA 等多種自身免疫性疾病中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。25-羥基維生素D3[25-hydroxyvitamin D3，25（OH）D3]是VD的血清標(biāo)志物，可在25-羥基維生素D-1α羥化酶（25-hydroxyvitamin D-1α-hydroxylase，CYP27B1）的催化下轉(zhuǎn)化成VD的主要活性形式--1α，25-二羥基維生素D3[1α，25-dihydroxy-cholecalciferol，1α，25（OH）2D3]，與維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）結(jié)合，參與炎癥控制、心血管保護(hù)等生物學(xué)過程[4]。研究顯示，血清VD 水平與RA、心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險呈負(fù)相關(guān)[5-6]；補(bǔ)充VD 可延緩RA 的進(jìn)展，并可通過抑制NETs 關(guān)鍵酶--還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶的形成而起到保護(hù)血管內(nèi)皮的作用[5-7]。

飛龍掌血為蕓香科植物飛龍掌血Toddaliaasiatica（L.）Lam.的干燥根皮，是我國貴州、云南等地的常用民族藥材。該藥性溫，味辛、微苦，可散瘀止血、祛風(fēng)除濕、消腫解毒，常用于治療風(fēng)濕痹癥[8]。研究表明，飛龍掌血能通過平衡調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞和輔助性T 細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17）的表達(dá)來調(diào)控白細(xì)胞介素17（interleukin-17，IL-17）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等炎癥及氧化應(yīng)激指標(biāo)的分泌/表達(dá)，從而發(fā)揮對關(guān)節(jié)炎及相關(guān)心血管疾病的改善作用[9-11]。有研究指出，Th17、IL-17、MCP-1、SOD 等炎癥、氧化應(yīng)激指標(biāo)編碼基因的表達(dá)與VD、NETs存在一定的關(guān)聯(lián)[12-14]，但飛龍掌血能否通過VD 和NETs 來調(diào)控RA 患者相關(guān)炎癥、氧化應(yīng)激指標(biāo)的分泌/表達(dá)，進(jìn)而影響其心血管損害的作用過程尚不明晰?；诖耍狙芯繑M從VD和NETs的角度出發(fā)，初步探討飛龍掌血對膠原誘發(fā)關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型大鼠心血管損害的干預(yù)效果及潛在機(jī)制，以期為飛龍掌血在RA 并發(fā)癥中的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

Multiskan MK3 型酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；DYY-7C 型電泳儀電源、DYCZ-24DN 型垂直電泳槽均購自北京六一儀器廠；RM2016 型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)購自德國Leica公司；JB-P5型包埋機(jī)購自武漢俊杰電子有限公司；BX53 型生物顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 主要藥品與試劑

飛龍掌血藥材（批號210301）購自貴陽市德昌祥藥房，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院蔣志濱副教授鑒定為蕓香科植物飛龍掌血T.asiatica（L.）Lam.的干燥根皮。甲氨蝶呤片（陽性對照藥，批號036210906，規(guī)格2.5 mg）購自上海上藥信誼藥廠有限公司；牛Ⅱ型膠原（貨號L22S11C125306）購自上海源葉生物科技有限公司；弗氏不完全佐劑（貨號SLCH4885）購自美國Sigma-Aldrich公司；VD 滴劑（通路驗(yàn)證試劑，批號129214211，規(guī)格為每粒含VD3400 單位）購自國藥控股星鯊制藥（廈門）有限公司；MPO、IL-6、25（OH）D3酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號分別為ML-E-20221022710、MLE-20221023761、ML-E-20221022898）均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；兔甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（批號AB-P-R001）購自杭州賢至生物科技有限公司；兔CYP27B1、MPO 多克隆抗體（批號分別為PB0577、BA0544）均購自武漢博士德生物工程有限公司；兔CitH3多克隆抗體、兔VDR單克隆抗體（批號分別為NB100-57135、NBP2-66778）均購自美國Novus Biologicals 公司；兔IL-6 多克隆抗體（批號DF6087）購自美國Affinity公司；兔肽?；彼崦搧啺泵?（peptidylarginine deiminase 4，PAD4）單克隆抗體（批號ab214810）購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗（批號A0208）購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

本研究所用實(shí)驗(yàn)動物為8 周齡的SPF 級雌性SD 大鼠（70只），體重為（200±10）g。所有動物均購自并飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（黔）2021-0003。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理審查委員會批準(zhǔn)，編號為20210100。

2 方法

2.1 飛龍掌血藥液的制備

取飛龍掌血藥材，共3 份，分別以8 倍水浸泡0.5 h后，煎煮30 min×2 次；合并提取液，過濾，濃縮，得質(zhì)量濃度分別為0.054、0.108、0.216 g/mL（以生藥量計(jì)）的藥液，備用。

2.2 分組、造模與給藥

將大鼠隨機(jī)分為正常組（9只）和造模組（61只）。取造模組大鼠，按如下方法[15]造模：將牛Ⅱ型膠原用乙酸溶解制成膠原溶液（2 mg/mL）后，與弗氏不完全佐劑等體積混合，制得膠原乳液。于實(shí)驗(yàn)第0天在大鼠背部、尾根部和雙足進(jìn)行多點(diǎn)注射（每處0.1 mL），即初次免疫；于第7 天在其背部、尾根部不同部位再次注射（每處0.1 mL），即二次免疫。于造模后（第8 天）隨機(jī)選擇數(shù)只大鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分--無皮膚發(fā)紅和關(guān)節(jié)腫脹癥狀，記0 分；腳踝或足部輕微發(fā)紅、腫脹，記1 分；腳踝和足部均輕微發(fā)紅、腫脹，記2分；腳踝和跖骨關(guān)節(jié)中度發(fā)紅、腫脹，記3分；全足嚴(yán)重發(fā)紅、腫脹，記4分；尾部紅斑和前肢腫脹各記0.5 分；總分為5 分，評分大于4 分則判定為CIA模型復(fù)制成功[16]。

將造模成功的54只大鼠隨機(jī)分為模型組，甲氨蝶呤組（陽性對照，1.5 mg/kg，每周2次，劑量參考相關(guān)文獻(xiàn)[17]設(shè)置），VD組[通路驗(yàn)證，1 000單位/（kg·d），每天1次，劑量參考相關(guān)文獻(xiàn)[18]設(shè)置]，飛龍掌血低、中、高劑量組[0.54、1.08、2.16 g/（kg·d），以生藥量計(jì)，每天1 次，劑量參考成人臨床常用劑量并根據(jù)大鼠體表面積折算而得，中劑量為臨床等效劑量]，每組9只。各藥物組大鼠灌胃相應(yīng)藥液，正常組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水（每天1次），連續(xù)4周。

2.3 大鼠足跖腫脹情況觀察及取材

造模后，于給藥前對各組大鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分，并分別于給藥前和末次給藥后用游標(biāo)卡尺測量大鼠右后肢足跖厚度。測量結(jié)束后，以1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取其腹主動脈血，靜置后以3 000 r/min 離心15 min，收集上層血清，于-80 ℃下保存，備測。取血后，處死各組大鼠，快速收集其左后肢踝關(guān)節(jié)組織，以4%多聚甲醛固定，右后肢踝關(guān)節(jié)于-80 ℃下保存，備測；取大鼠心臟組織，橫切一分為二，上部于-80 ℃下保存，下部以4%多聚甲醛固定，備測；取大鼠腹主動脈組織，以4%多聚甲醛固定，備測。

2.4 大鼠踝關(guān)節(jié)、心臟及腹主動脈組織的病理學(xué)觀察

采用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法觀察。取“2.3”項(xiàng)下每組5只大鼠以4%多聚甲醛固定的踝關(guān)節(jié)組織適量，脫鈣后依次以75%、85%、95%、100%乙醇梯度脫水，經(jīng)石蠟包埋后切片，再依次用蘇木精、伊紅染色，經(jīng)二甲苯透明后，以中性樹膠封片，使用顯微鏡對其踝關(guān)節(jié)進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察及圖像采集。

取“2.3”項(xiàng)下每組5只大鼠以4%多聚甲醛固定的心臟和腹主動脈組織各適量，按前述方法脫水、包埋、切片、染色、透明后封片，使用顯微鏡對其心臟及腹主動脈進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察及圖像采集。

2.5 大鼠血清中MPO、IL-6、25（OH）D3含量檢測

采用ELISA 法檢測。隨機(jī)選取每組5 只大鼠凍存的血清樣本，按照相應(yīng)試劑盒說明書方法操作，使用酶標(biāo)儀檢測其血清中MPO、IL-6、25（OH）D3含量。

2.6 大鼠心臟組織中PAD4、VDR蛋白表達(dá)水平檢測

采用免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）法檢測。取“2.4”項(xiàng)下每組3只大鼠的心臟組織切片，經(jīng)枸櫞酸抗原修復(fù)溶液孵育15 min 后，以山羊血清封閉，滴加PAD4、VDR 一抗（稀釋比例均為1∶100），于4 ℃下孵育過夜；用磷酸鹽緩沖液清洗3次后，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育30 min；再次清洗后，以DAB 顯色液顯色，再以Mayer’s 蘇木精復(fù)染，經(jīng)乙醇梯度脫水后，以二甲苯透明，風(fēng)干后封片，使用顯微鏡進(jìn)行觀察。采用Image-Pro Plus 6.0 軟件對IHC 圖進(jìn)行光密度分析，計(jì)算陽性區(qū)域（即黃褐色或棕褐色區(qū)域）的平均光密度用以表示PAD4、VDR蛋白的表達(dá)水平。

2.7 大鼠心臟組織中CitH3、MPO、IL-6、CYP27B1 蛋白表達(dá)水平檢測

采用Western blot 法檢測。取“2.3”項(xiàng)下每組3 只大鼠的凍存心臟組織，解凍后剪取適量，用含PMSF 的裂解液勻漿后，于冰上裂解30 min，在4 ℃下以12 000 r/min離心5 min，取上清液，使用BCA法測定蛋白濃度并作變性處理。取變性蛋白適量，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（電壓依次為80、120 V）分離并轉(zhuǎn)膜（電流為200 mA），用脫脂奶粉封閉；洗膜后，加入CitH3、MPO、IL-6、CYP27B1、GAPDH一抗（稀釋比例均為1∶1 000），于4 ℃下孵育過夜；洗膜后，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例為1∶600），室溫孵育2 h；洗膜后，加入化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影并成像。使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）的灰度值比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)的多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)的多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 飛龍掌血對CIA模型大鼠足跖腫脹度的影響

正常組大鼠四肢未見明顯紅腫。與正常組比較，大鼠在造模完成后足跖腫脹明顯，關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分和足趾厚度均顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，經(jīng)藥物干預(yù)后，甲氨蝶呤組、飛龍掌血中劑量組大鼠的足跖厚度均顯著減少（P＜0.01）；VD組大鼠的足趾厚度雖有所減少，但與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1、圖1。

圖1 各組大鼠的足部照片

表1 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分和足跖厚度比較（±s，n＝9）

表1 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分和足跖厚度比較（±s，n＝9）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01。

組別正常組模型組甲氨蝶呤組VD組飛龍掌血低劑量組飛龍掌血中劑量組飛龍掌血高劑量組關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分0 4.44±0.30a 4.50±0.25a 4.39±0.33a 4.56±0.30a 4.50±0.25a 4.33±0.25a給藥前足跖厚度/mm 3.05±0.36 5.94±0.61a 5.98±0.23a 5.00±0.46a 5.64±0.62a 5.75±0.80a 5.34±0.41a末次給藥后足跖厚度/mm 3.45±0.21 4.89±0.36a 4.11±0.37b 4.64±0.25 4.89±0.48 4.33±0.31b 4.58±0.32

3.2 飛龍掌血對CIA模型大鼠踝關(guān)節(jié)、心臟、腹主動脈組織病理形態(tài)的影響

3.2.1 踝關(guān)節(jié)組織

正常組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織結(jié)構(gòu)清晰完整；模型組大鼠踝關(guān)節(jié)組織襯里下層可見明顯的炎癥細(xì)胞（以淋巴細(xì)胞為主）浸潤和纖維組織增生（以成纖維細(xì)胞、纖維細(xì)胞增多為主）；甲氨蝶呤組和VD組大鼠襯里下層的炎癥細(xì)胞浸潤較模型組明顯減少，飛龍掌血各劑量組大鼠的上述癥狀較模型組有不同程度好轉(zhuǎn)，且以中劑量組效果最佳（僅在襯里下層觀察到極少量炎癥細(xì)胞浸潤和纖維組織增生）。結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)觀察的顯微圖（HE染色）

3.2.2 心臟組織

正常組大鼠的心肌纖維走向明確，排列整齊；模型組大鼠有極少的心肌纖維排列紊亂，可見明顯的組織空泡和部分周圍血管壁增厚；各藥物組大鼠心臟組織的上述損傷有不同程度減輕，且以甲氨蝶呤組和飛龍掌血中劑量組效果較佳。結(jié)果見圖3。

圖3 各組大鼠心臟組織病理學(xué)觀察的顯微圖（HE染色）

3.2.3 腹主動脈組織

正常組大鼠腹主動脈內(nèi)皮完整，結(jié)構(gòu)清晰；模型組大鼠腹主動脈組織可見內(nèi)皮脫落；甲氨蝶呤組、飛龍掌血各劑量組大鼠腹主動脈組織可見不同程度的內(nèi)皮脫落、中膜增厚、彈性纖維斷裂，而VD 組大鼠則未見上述改變。結(jié)果見圖4。

圖4 各組大鼠腹主動脈組織病理學(xué)觀察的顯微圖（HE染色）

3.3 飛龍掌血對CIA 模型大鼠血清中MPO、IL-6、25（OH）D3含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中MPO、IL-6 含量顯著升高，25（OH）D3含量顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，VD 組、飛龍掌血中劑量組大鼠血清中MPO 含量，以及各藥物組大鼠血清中IL-6 含量（飛龍掌血低劑量組除外）均顯著降低，各藥物組大鼠血清中25（OH）D3含量（飛龍掌血低劑量組除外）均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血清中MPO、IL-6、25（OH）D3含量比較（±s，n＝5）

表2 各組大鼠血清中MPO、IL-6、25（OH）D3含量比較（±s，n＝5）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較；P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05。

組別正常組模型組甲氨蝶呤組VD組飛龍掌血低劑量組飛龍掌血中劑量組飛龍掌血高劑量組MPO/（ng/mL）128.48±8.45 177.88±11.88a 126.39±25.19 112.94±22.87c 159.10±28.57 119.07±20.37c 137.55±24.09 IL-6/（pg/mL）121.84±21.70 174.63±21.19a 115.80±29.06b 121.99±21.79b 152.42±22.92 125.68±21.43b 113.19±18.82b 25（OH）D3/（ng/mL）37.75±2.79 17.96±3.70a 30.54±5.13c 31.80±5.99b 22.74±3.22 30.51±6.36c 28.78±4.19c

3.4 飛龍掌血對CIA模型大鼠心臟組織中PAD4、VDR蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠心臟組織中PAD4 蛋白的表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.01），而VDR 蛋白的表達(dá)略有上調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，甲氨蝶呤組、VD 組和飛龍掌血高劑量組大鼠心臟組織中PAD4 蛋白的表達(dá)均顯著減弱，而甲氨蝶呤組、VD 組和飛龍掌血中、高劑量組大鼠心臟組織中VDR 的表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見圖5～圖7。

圖5 各組大鼠心臟組織中PAD4蛋白表達(dá)的顯微圖（IHC法）

圖6 各組大鼠心臟組織中VDR蛋白表達(dá)的顯微圖（IHC法）

圖7 各組大鼠心臟組織中PAD4、VDR 蛋白表達(dá)水平比較（±s，n＝3）

3.5 飛龍掌血對CIA 模型大鼠心臟組織中CitH3、MPO、IL-6、CYP27B1蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠心臟組織中CitH3、MPO、IL-6 蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01），CYP27B1 的表達(dá)水平雖有降低但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，VD組、飛龍掌血高劑量組大鼠心臟組織中CitH3蛋白的表達(dá)水平，以及甲氨蝶呤組、VD 組和飛龍掌血中、高劑量組大鼠心臟組織中MPO、IL-6 蛋白的表達(dá)水平均顯著降低，而VD 組和飛龍掌血中、高劑量組大鼠心臟組織中CYP27B1 蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見圖8、表3。

表3 各組大鼠心臟組織中CitH3、MPO、IL-6、CYP27B1蛋白表達(dá)水平比較（±s，n＝3）

表3 各組大鼠心臟組織中CitH3、MPO、IL-6、CYP27B1蛋白表達(dá)水平比較（±s，n＝3）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較；P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05。

組別正常組模型組甲氨蝶呤組VD組飛龍掌血低劑量組飛龍掌血中劑量組飛龍掌血高劑量組CitH3/GAPDH 0.102±0.009 0.748±0.050a 0.273±0.022 0.205±0.009b 0.664±0.048 0.504±0.096 0.259±0.024c MPO/GAPDH 0.135±0.058 0.742±0.015a 0.314±0.089b 0.297±0.158b 0.579±0.059 0.492±0.107b 0.283±0.115b IL-6/GAPDH 0.082±0.011 0.758±0.070a 0.217±0.041b 0.291±0.073b 0.634±0.074 0.483±0.058b 0.264±0.060b CYP27B1/GAPDH 0.258±0.013 0.109±0.024 0.429±0.021 0.769±0.022b 0.247±0.026 0.745±0.048b 0.584±0.109c

4 討論

心血管系統(tǒng)作為血液信號的直接接收者，對RA 患者慢性炎癥和自身免疫性抗體顯著上調(diào)的血液環(huán)境極其敏感并能最先作出反饋，故心血管系統(tǒng)是RA 患者主要的關(guān)節(jié)外受累系統(tǒng)，心血管疾病也是RA 患者主要的關(guān)節(jié)外表現(xiàn)之一[19]。飛龍掌血作為經(jīng)典苗藥，是治療RA的常用藥?，F(xiàn)代藥理研究表明，其能通過抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂和改善心臟舒縮功能等多個途徑來保護(hù)心血管[10-11]。本研究通過足跖厚度和HE 染色觀察發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，大鼠在造模完成后足跖腫脹明顯，關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分和足趾厚度均顯著增加，關(guān)節(jié)組織襯里下層可見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤和纖維組織增生，心臟組織中有明顯的組織空泡和部分周圍血管壁增厚，腹主動脈組織可見內(nèi)皮脫落，提示CIA 模型復(fù)制成功，且大鼠存在一定的心臟損害；經(jīng)飛龍掌血干預(yù)后，大鼠踝關(guān)節(jié)組織、心臟組織的上述病理改變均有不同程度減輕，且以中劑量組干預(yù)效果最佳，但腹主動脈內(nèi)皮脫落等現(xiàn)象依然存在，提示飛龍掌血能改善RA及相關(guān)心臟損害，但同樣能誘使腹主動脈產(chǎn)生一定的應(yīng)激反應(yīng)；此外，由于中劑量為臨床等效劑量，處于最佳療效窗口，故干預(yù)效果較其他劑量更好。

RA患者心血管并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險較普通人群高了2 倍，而NETs 介導(dǎo)慢性低度炎癥可能是RA 患者心血管并發(fā)癥風(fēng)險增加的主要原因之一[2]。研究指出，PAD4蛋白可瓜氨酸化中性粒細(xì)胞的核內(nèi)組蛋白，是RA 患者NETs 形成的主要途徑之一；同時，PAD4 蛋白介導(dǎo)的瓜氨酸化可在RA 患者的心肌間質(zhì)內(nèi)進(jìn)行，并誘發(fā)進(jìn)行性心肌功能障礙[20]。當(dāng)NETs釋放后，CitH3蛋白可成為抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（RA 特異性抗體）的靶標(biāo)，從而加強(qiáng)機(jī)體自身免疫反應(yīng)；此外，CitH3、MPO等NETs相關(guān)蛋白可破壞細(xì)胞膜完整性和細(xì)胞間連接，從而直接損傷血管內(nèi)皮；MPO蛋白還可成為自身抗原而引發(fā)抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體相關(guān)性血管炎；NETs 還可出現(xiàn)在血栓部位而加重血栓形成，造成機(jī)體局部缺血[3，21-22]。IL-6作為一種經(jīng)典的促炎因子，在心肌梗死部位呈高表達(dá)，是心臟損害的常見炎癥因子[23]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中MPO、IL-6 含量明顯增高，心臟組織中PAD4、CitH3、MPO、IL-6 蛋白的表達(dá)水平亦顯著升高；經(jīng)各劑量飛龍掌血干預(yù)后，上述指標(biāo)得到不同程度的改善，提示飛龍掌血可減少NETs 形成及炎癥反應(yīng)，具有改善CIA 模型大鼠心臟損傷的作用。

VD 信號存在于NETs 形成途徑的上游，但RA 患者的VD 水平普遍較低[6]。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞可表達(dá)CYP27B1蛋白，后者可催化1α，25（OH）2D3的局部轉(zhuǎn)化；而在正常生理?xiàng)l件下，1α，25（OH）2D3信號被VDR 蛋白接收后可形成VDR-1α，25（OH）2D3復(fù)合物，參與受體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控[24]，故心臟組織中VDR的缺乏是導(dǎo)致心臟肥大的原因之一。低水平25（OH）D3是血管內(nèi)皮功能異常、動脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)生的獨(dú)立危險因素[25]，VD缺乏者易發(fā)生左心房纖維化，且具有較高的心房顫動發(fā)生風(fēng)險[26]。本研究通過檢測VD 相關(guān)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組大鼠血清中25（OH）D3含量顯著降低，心臟組織中CYP27B1、VDR蛋白的表達(dá)水平雖略有變化但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；經(jīng)不同劑量的飛龍掌血干預(yù)后，上述指標(biāo)均有不同程度的改善，提示飛龍掌血能通過調(diào)控VD 代謝途徑來改善RA 相關(guān)心臟損害。同時，本研究設(shè)置了VD 組，意在驗(yàn)證VD 與NETs 的上下游關(guān)系，結(jié)果顯示，補(bǔ)充VD 后，大鼠體內(nèi)PAD4、CitH3、MPO、IL-6蛋白的表達(dá)均受到抑制，提示VD處于NETs上游，可調(diào)控NETs的形成。

綜上所述，飛龍掌血可通過抑制NETs 的形成及炎癥反應(yīng)的發(fā)生來改善RA 癥狀及相關(guān)心臟損害，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)VD 水平有關(guān)。但VD 和NETs 兩者間的具體調(diào)控機(jī)制尚未闡明，本課題組將進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以進(jìn)一步探討其中關(guān)系。