王 立, 何維新, 謝 鵬, 賀小武, 余力棟, 嚴(yán) 爍, 周建平

聯(lián)勤保障部隊第九〇六醫(yī)院1.普通外科(二);2.肝病科,浙江 寧波 315000

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一,隨著手術(shù)、放療、化療及靶向治療等腫瘤綜合診療手段的不斷發(fā)展,結(jié)直腸癌患者的預(yù)后得到明顯改善,5年生存率可達(dá)65%,但仍有一半以上的患者會在病程中出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移,并最終導(dǎo)致死亡[1]。尋找合適的分子生物學(xué)標(biāo)記物來評估結(jié)直腸癌患者的臨床治療效果及預(yù)后是目前丞需解決的問題。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)是指由腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞,有研究顯示,其在惡性腫瘤的診斷、治療及預(yù)后評估等方面均有非常重要的價值[2]。本研究旨在觀察CTCs在結(jié)直腸癌患者手術(shù)前后的變化情況,并分析其與腫瘤病理因素的相關(guān)性?，F(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 將聯(lián)勤保障部隊906醫(yī)院自2018年6月至2020年12月收治的90例結(jié)直腸癌患者納入結(jié)直腸癌組。納入標(biāo)準(zhǔn):性別年齡不限;接受腹腔鏡結(jié)直腸癌根治術(shù),無手術(shù)禁忌證;經(jīng)腸鏡檢查和活組織病理學(xué)檢查明確診斷為結(jié)直腸癌;入組前未接受放療、化療等任何術(shù)前治療;簽署知情同意書。另將同期的18例結(jié)直腸良性疾病(腸息肉等)患者納入良性組。良性組中,男性11例,女性7例,年齡27～73歲;結(jié)直腸癌組中,男性57例,女性33例,年齡37～79歲。兩組患者一般資料比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 CTCs的分離和富集 采用免疫磁珠陰性富集法完成。每次CTCs檢測的5 ml血樣取自結(jié)直腸癌患者(分別于術(shù)前1 d、術(shù)后第7天早晨抽肘正中靜脈血),血樣放置于預(yù)先準(zhǔn)備好的ACD管中保存。CTCs的分離和富集過程采用基于美晶醫(yī)療CellRichTM CTCs檢測平臺的免疫磁珠法結(jié)合密度梯度離心法,去除血液中除腫瘤細(xì)胞以外的無關(guān)細(xì)胞,最后間接分離、富集得到包含CTCs及少量白細(xì)胞的細(xì)胞懸液,并將此懸液涂片。

1.3 CTCs的熒光原位雜交染色及鑒定 采用免疫熒光原位雜交技術(shù)完成。此方法聯(lián)合了基因水平的熒光原位雜交技術(shù)和蛋白水平的免疫熒光染色法,通過染色體計數(shù)探針(chromosome enumeration probes,CEP)進(jìn)行8號染色體著絲粒結(jié)合,anti-CD45抗體熒光染色細(xì)胞膜,二脒基苯基吲哚(diaminidine phenyl indole,DAPI)染色細(xì)胞核,最終鑒別CTCs。

1.4 CTCs判斷標(biāo)準(zhǔn) (1)光鏡下有完整的細(xì)胞核,細(xì)胞呈圓形、橢圓形或長形,細(xì)胞長徑>10 μm。(2)熒光下細(xì)胞形態(tài)及邊緣完整,熒光染色標(biāo)準(zhǔn)CD45(抗白細(xì)胞表面抗原)陰性。(3)細(xì)胞核DAPI核染色陽性,細(xì)胞核直徑>8 μm,且核形狀不規(guī)則。(4)CEP8陽性的定義為8號染色體探針信號點(diǎn)>2個(呈現(xiàn)異倍體)細(xì)胞。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)示意圖:異倍體陽性,DAPI陽性,CD45陰性。見圖1。同一個標(biāo)本中符合上述標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞≥2個視為CTCs陽性。

圖1 CTCs鑒定示意圖(主機(jī)為Leica DM3000,軟件版本為Leica Application Suite Version 4.9.0,放大倍數(shù)為400倍;a.DAPI染色陽性細(xì)胞,代表是細(xì)胞核;b.CEP8探針標(biāo)記陽性細(xì)胞,代表該細(xì)胞染色體為異倍體;c.CD45染色陰性細(xì)胞,代表該細(xì)胞非白細(xì)胞;d.前3張圖疊加的合圖,代表為CTCs陽性細(xì)胞)

1.5 資料收集 記錄結(jié)直腸癌組患者的一般資料和病理檢查資料,包括性別、年齡、腫瘤部位、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯、脈管侵犯、TNM分期等。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計數(shù)資料以例(百分率)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者CTCs陽性率比較 結(jié)直腸癌組術(shù)前1 d外周血中檢出CTCs陽性患者50例,陽性率55.5%(50/90);良性組于腸鏡或病理確認(rèn)后第1天進(jìn)行外周血CTCs檢測,檢出陽性1例,陽性率5.6%(1/18)。結(jié)直腸癌組CTCs陽性率高于良性組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 結(jié)直腸癌組患者外周血CTCs與腫瘤病理因素的相關(guān)性 在結(jié)直腸癌組中:男性、女性CTCs陽性率分別為63.1%(36/57)、42.4%(14/33);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分別為62.2%(38/61)、41.4%(12/29);分化程度高、中、低分別為61.7%(21/34)、50.0%(13/26)、53.3%(16/30);年齡≤65歲、年齡>65歲分別為62.2%(23/37)、50.9%(27/53);TNM分期Ⅰ/Ⅱ期、Ⅲ/Ⅳ期分別為43.5%(17/39)、64.7%(33/51);腫瘤部位在右半結(jié)腸、左半結(jié)腸(含直腸)分別為43.2%(19/44)、67.4%(31/46);神經(jīng)侵犯(+)、(-)分別為62.2%(28/45)、48.9%(22/45);浸潤深度T1+T2、T3+T4分別為33.3%(7/21)、62.3%(43/69);脈管侵犯(+)、(-)分別為57.4%(27/47)、53.5%(23/43)。結(jié)直腸癌組患者外周血CTCs陽性率與性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、年齡、神經(jīng)侵犯、脈管侵犯均無相關(guān)性(P>0.05),但與TNM分期、腫瘤部位、浸潤深度有相關(guān)性(P<0.05)。

2.3 結(jié)直腸癌組患者手術(shù)前后CTCs陽性率變化 在術(shù)后第7天,對結(jié)直腸癌組術(shù)前1 d外周血中檢出CTCs陽性的50例患者進(jìn)行CTCs復(fù)檢,結(jié)果顯示:CTCs數(shù)量減少或歸零41例(82.0%),CTCs數(shù)量無變化5例(10.0%),CTCs數(shù)量增加4例(8.0%)。41例CTCs數(shù)量減少或歸零患者中,浸潤深度T1+T2、T3+T4分別有6例、35例;5例CTCs數(shù)量無變化患者中,浸潤深度T1+T2、T3+T4分別有0例、5例;4例CTCs數(shù)量增加患者中,浸潤深度T1+T2、T3+T4分別有0例、4例。

3 討論

癌癥轉(zhuǎn)移是世界范圍腫瘤相關(guān)性死亡的首要因素[3]。臨床上缺乏對腫瘤微轉(zhuǎn)移的有效檢測手段,導(dǎo)致無法早期發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物、影像學(xué)檢測及組織活檢等,由于診斷閾值設(shè)定、腫瘤的時空異質(zhì)性及取材受限等問題,在癌癥患者轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)評估時能力受限[4]。液體活檢為腫瘤早期診斷、預(yù)后預(yù)測及抗癌藥物反應(yīng)監(jiān)測提供了一種實(shí)時、微創(chuàng)、精準(zhǔn)的方法[5-6]。CTCs檢測就是液體活檢中最重要的組成部分之一,CTCs從原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤脫落到血液中,是可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的“種子”,由于攜帶了完整的分子生物學(xué)信息,在轉(zhuǎn)移發(fā)生的早期階段,CTCs就提供了捕獲最具侵襲性腫瘤細(xì)胞的機(jī)會[7]。

通過對外周血中CTCs的檢測可直接判斷外周血中腫瘤細(xì)胞的存在與否。有多項研究報道,CTCs已在大多癌種的外周血中被檢測到,其預(yù)后價值在乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌及小細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌中得到證實(shí)[8-10]。CTCs的存在還與腫瘤分期具有明顯的相關(guān)性,CTCs數(shù)量越多,患者面臨遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞負(fù)荷越重,未來發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性就越大[11]。本研究結(jié)果顯示:結(jié)直腸癌組外周血中確實(shí)能夠檢測到CTCs,陽性率為55.5%;同時,結(jié)直腸癌組患者外周血CTCs陽性率與TNM分期、腫瘤部位、浸潤深度有相關(guān)性(P<0.05)。這與Cohen等[12]研究結(jié)果相似。有研究提示,左右半結(jié)腸癌可能不只是部位上存在差異,更多差異在腫瘤分子生物學(xué)行為上,該差異可能會導(dǎo)致左右半結(jié)腸癌的預(yù)后及治療選擇不同[13];Nicolazzo等[14]的研究也得出了類似結(jié)論。本研究結(jié)果還顯示:在術(shù)后第7天,結(jié)直腸癌組術(shù)前1 d外周血中檢出CTCs陽性的50例患者中,CTCs數(shù)量減少或歸零41例(82.0%)。這提示,隨著原發(fā)灶的切除,外周血中CTCs也隨之減少或消失,即手術(shù)對腫瘤的治療見效迅速。但仍有10.0%的患者CTCs數(shù)量無變化,甚至8%的患者術(shù)后CTCs數(shù)量增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn):5例CTCs數(shù)量無變化患者中,浸潤深度T1+T2、T3+T4分別有0例、5例;4例CTCs數(shù)量增加患者中,浸潤深度T1+T2、T3+T4分別有0例、4例。即CTCs數(shù)量無變化和增加的患者均腫瘤浸潤較深(T3/T4)。原因在于,腫瘤浸潤較深、腫瘤較大會在術(shù)中不可避免地對腫瘤產(chǎn)生擠壓等,引起腫瘤CTCs釋放入血,還可能是CTCs單次檢測的隨機(jī)誤差導(dǎo)致了CTCs數(shù)量術(shù)后上升。

綜上所述,結(jié)直腸癌患者術(shù)前CTCs的數(shù)量與TNM分期、腫瘤部位、浸潤深度相關(guān),大多患者的CTCs數(shù)量在手術(shù)治療后會下降,對于術(shù)后CTCs仍然陽性的患者,建議繼續(xù)密切跟蹤隨訪。在結(jié)直腸癌腫瘤根治性手術(shù)中,術(shù)中無瘤操作是否妥當(dāng)可能會影響患者術(shù)后CTCs數(shù)量,進(jìn)而影響患者預(yù)后。與此同時,也要考慮到目前CTCs的檢測技術(shù)并不完善,由于外周血中CTCs稀少、分布不均,且在體內(nèi)的停留時間存在爭議[15],導(dǎo)致隨機(jī)單次采血檢測捕獲難度和偶然性增加[16],造成檢測隨機(jī)誤差,因此,建議在CTCs檢測的同時聯(lián)合ctDNA等液體活檢手段,在一定程度上克服CTCs檢測的局限性。