宿 娜, 山周琦玥, 陳 帥, 曾貴林

1.崇州市人民醫(yī)院 腫瘤血液科,四川 成都 611200;2.成都市第五人民醫(yī)院 腫瘤科,四川 成都 611130

腫瘤轉(zhuǎn)移是肺癌患者死亡的主要原因,其發(fā)生可涉及腫瘤細(xì)胞自身生物學(xué)特征、組織微環(huán)境及免疫炎癥狀態(tài)等多種機(jī)制的相互作用[1]。早期判斷肺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后,對患者診療及干預(yù)具有重要參考意義,而選擇與其相關(guān)的敏感標(biāo)志物是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[2]。成纖維細(xì)胞生長因子-2(fibroblast growth factor 2,FGF2)是一種強(qiáng)效促血管因子,血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)為促血管形成的特異性調(diào)節(jié)因子,二者均可通過誘導(dǎo)新血管形成,為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)支持及轉(zhuǎn)移途徑,在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)[3-4]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTC)是從原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移灶逃逸進(jìn)入血液循環(huán)的癌細(xì)胞,可發(fā)展成新的腫瘤轉(zhuǎn)移灶,被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移性病變形成的中間環(huán)節(jié)[5]。本研究旨在探討外周血FGF2、VEGFA及CTC含量與肺癌轉(zhuǎn)移、臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2019年1月至2020年12月崇州市人民醫(yī)院收治的136例肺癌患者設(shè)為肺癌組。再根據(jù)有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移將患者分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(n=104)與非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(n=32);根據(jù)是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組(n=42)與非遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組(n=94),轉(zhuǎn)移灶的診斷結(jié)合多種影像學(xué)檢查及組織病理學(xué)結(jié)果證實(shí)。納入標(biāo)準(zhǔn):符合《中國原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2015年版)》[6]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn):病理檢查缺失;合并免疫性疾病、血液性疾病、腎病;合并其他惡性腫瘤。另選取同期收治的60例肺部良性疾病患者設(shè)為良性組。肺癌組中,男性96例,女性40例;平均年齡(56.14±6.13)歲;平均體質(zhì)量指數(shù)(22.28±3.62)kg/m2。良性組中,男性36例,女性24例;平均年齡(55.15±6.47)歲;平均體質(zhì)量指數(shù)(22.49±2.48)kg/m2。兩組研究對象一般資料比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。所有研究對象均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血CTC水平檢測 CellSave管收集患者外肘靜脈血7.5 ml,于離心管離心(加6.5 ml緩沖液),對CTC進(jìn)行免疫捕捉與熒光染色(CellTracks Autoprep循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測儀),MagNest裝置的樣本盒收集被捕捉并獲得染色的細(xì)胞,避光孵育;強(qiáng)磁場作用下,從未結(jié)合磁珠細(xì)胞中將靶細(xì)胞分離,向樣本盒的分析表面移動,富集形成單細(xì)胞層,此時(shí)CTC表型為DAPI(+)、EpCAM(+)、CK(+)、CD45(-),白細(xì)胞為DAPI(+)、EpCAM(-)、CK(-)、CD45(+),經(jīng)過免疫磁顆粒選定且熒光染色后的CTC通過CellTracks AnalyzerⅡ計(jì)數(shù),獲得結(jié)果。檢測結(jié)果以7.5 ml血液中CTC個(gè)數(shù)表示,陽性標(biāo)準(zhǔn):7.5 ml外周血中見1個(gè)CTC細(xì)胞。

1.2.2 外周血FGF2及VEFGA水平檢測 抽取患者空腹靜脈血5 ml,室溫靜置1 h后放置于4℃環(huán)境下3 000 r/min離心10 min,收集上清液保存于-80℃冰箱。分別采用Takara公司提供的VEGFA檢測試劑盒、R&D公司提供的FGF2試劑盒,嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟,檢測VEFGA、FGF2水平。受條件限制,上述外周血指標(biāo)檢測均由外檢機(jī)構(gòu)完成。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組與良性組外周血FGF2、VEFGA水平及CTC陽性情況比較 肺癌組患者外周血FGF2、VEFGA水平及CTC陽性占比均高于良性組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 肺癌組與良性組外周血FGF2、VEFGA水平及CTC陽性情況比較

2.2 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者外周血FGF2、VEFGA水平及CTC陽性情況比較 肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者外周血FGF2、VEFGA水平及CTC陽性占比均顯著高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者外周血FGF2、VEFGA水平及CTC陽性情況比較

2.3 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組與非遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組患者外周血FGF2、VEFGA水平及CTC陽性情況比較 肺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組患者外周血FGF2、VEFGA水平及CTC陽性率高于非遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組與非遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組患者外周血FGF2、VEFGA水平及CTC陽性情況比較

2.4 不同臨床病理特征患者外周血FGF2、VEFGA水平及CTC陽性情況比較 年齡≥50歲的肺癌患者外周血FGF2水平及CTC陽性占比均高于年齡<50歲患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。小細(xì)胞癌患者外周血FGF2水平及CTC陽性占比均高于非小細(xì)胞癌患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TNM Ⅲ～Ⅳ分期者外周血FGF2及VEFGA水平高于TNM Ⅰ～Ⅱ分期患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。低分化肺癌患者外周血FGF2、VEFGA水平及CTC陽性占比高于中分化及高分化,且中分化高于高分化,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。腫塊直徑>3 cm患者外周血FGF2水平及CTC陽性占比均低于腫塊直徑≤3 cm患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4～8。

表4 不同年齡患者外周血FGF2、VEFGA水平及CTC陽性情況比較

表5 不同病理類型患者外周血FGF2、VEFGA水平及CTC陽性情況比較

表6 不同手術(shù)分期患者外周血FGF2、VEFGA水平及CTC陽性情況比較

表7 不同組織分級患者外周血FGF2、VEFGA水平及CTC陽性情況比較

表8 不同腫塊大小患者外周血FGF2、VEFGA水平及CTC陽性情況比較

2.5 外周血FGF2、VEFGA及CTC水平與肺癌轉(zhuǎn)移預(yù)后關(guān)系分析 以中位數(shù)法將肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者進(jìn)行分組,隨訪截至2022年2月,隨訪時(shí)間12.5～36.0個(gè)月,Kaplan-Meier法結(jié)果顯示,FGF2高表達(dá)組(FGF2>10.23 ng/L,n=64)和FGF2低表達(dá)組(FGF2≤10.23 ng/L,n=40)生存曲線差異顯著(Log-rankχ2=4.69,P=0.030);VEGFA高水平組(VEGFA>132.54 ng/L,n=58)和低水平組(VEGFA≤132.54 ng/L,n=46)生存曲線無顯著性差異(Log-rankχ2=1.60,P=0.205);CTC陽性組(n=96)和陰性組(n=8)生存曲線無顯著性差異(Log-rankχ2=1.96,P=0.161)。見圖1～3。

圖1 肺癌轉(zhuǎn)移患者不同外周血FGF2表達(dá)生存曲線

3 討論

FGF2是一種強(qiáng)有力的促血管生成因子,成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及粒細(xì)胞等多種細(xì)胞均可產(chǎn)生FGF2,在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中,FGF2可大量釋放入血,通過促血管生成,可為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)支持及轉(zhuǎn)移通路,從而加重病情進(jìn)展及術(shù)后復(fù)發(fā)危險(xiǎn)性[7]。有研究報(bào)道,FGF2可通過FGFR1信號通路參與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展[8]。本研究發(fā)現(xiàn),肺癌患者外周血FGF2水平升高,尤其是伴淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者,此外,年齡≥50歲、小細(xì)胞癌、分期偏晚、肺癌組織低分化及腫塊≤3 cm者外周血FGF2水平也更高,這說明外周血FGF2水平上升與肺癌發(fā)展進(jìn)程及病情嚴(yán)重程度有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示,外周血FGF2高水平者術(shù)后無進(jìn)展生存時(shí)間明顯縮短,這可能因?yàn)镕GF2水平過高,患者更易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致無進(jìn)展生存時(shí)間更短,病死率更高。本研究結(jié)果提示,FGF2或許可作為肺癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后預(yù)測的敏感指標(biāo),但其臨界值仍有待進(jìn)一步探究。

VEGFA是體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞特異性絲裂原與血管生成因子,不僅與血管形成密切相關(guān),也參與多種疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、視網(wǎng)膜病變等發(fā)生發(fā)展過程,且癌細(xì)胞可分泌VEGFA,并作用于其受體內(nèi)皮細(xì)胞,進(jìn)而參與誘導(dǎo)血管生成、腫瘤生長、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等進(jìn)程[9]。有研究報(bào)道,VEGFA能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖、增加血管通透性,利于腫瘤組織脫落,并激活基質(zhì)金屬蛋白酶,促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解、血管生成,與肺癌轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,并影響患者預(yù)后[10]。本研究發(fā)現(xiàn),肺癌患者外周血VEGFA水平升高,且伴轉(zhuǎn)移者VEGFA更高,此外,分期偏晚、組織分級較低者外周血VEGFA水平也較高,提示VEGFA與肺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移有關(guān)。但本研究中,外周血VEGFA水平高低與患者生存預(yù)后無顯著關(guān)系,提示VEGFA或許并非肺癌預(yù)后預(yù)測的敏感指標(biāo);但這一結(jié)果也可能受本研究樣本量影響,后期可擴(kuò)大樣本進(jìn)一步分析。

CTC是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移過程中潛在的生物標(biāo)志物,在肺癌早期診斷、預(yù)測復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移等方面具有重要意義。但CTC在外周血中的含量極少,常規(guī)細(xì)胞學(xué)方法檢測困難,導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受到限制,而采用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)技術(shù)檢測外周血CTC含量,具有高效、高靈敏度、操作簡單等優(yōu)勢[11]。本研究結(jié)果顯示,良性病變者外周血CTC陽性率僅3.33%,而肺癌患者可達(dá)72.06%,提示CTC在區(qū)分肺癌的良惡性中具有較高的敏感性。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),患者年齡越大、小細(xì)胞癌、組織分級越低、腫塊越小,其外周血CTC陽性可能性越大。既往研究報(bào)道,CTC與肺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)[12],支持本研究結(jié)果。但本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn),CTC陽性與否與生存預(yù)后無顯著關(guān)系,這一結(jié)果可能受檢測方式、樣本量等影響,也可能因?yàn)榉伟┝馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移患者整體預(yù)后本身較差,且CTC陰性患者很少,因此,CTC陰性較CTC陽性患者無進(jìn)展存活率并未表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。

綜上所述,外周血FGF2、VEGFA水平升高,CTC表達(dá)陽性,與肺癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān),且外周血FGF2表達(dá)對肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者無進(jìn)展生存期有較好的預(yù)測價(jià)值。