肖亞男, 張 丹, 于 麗, 吳佳蔓, 耿 曉, 鞏 陽

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 中醫(yī)科,遼寧 沈陽 110016

腹部和盆腔經(jīng)輻射后引起的放射性腸炎是臨床中常見問題之一,其臨床表現(xiàn)通常包括腹痛、腹瀉、血便、敗血癥、全身炎癥和多器官功能障礙綜合征等[1-3]。目前,臨床治療放射性腸炎以手術(shù)、對癥治療及營養(yǎng)支持療法為主,但遠期效果并不理想[4]。隨著國內(nèi)外對放射性腸炎廣泛深入的研究,迫切需要建立適合臨床研究的放射性腸炎動物模型。有研究報道,磷脂酰肌醇-3 激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase,PI3K)可通過調(diào)控蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)進而調(diào)節(jié)細胞因子介導(dǎo)的中性粒細胞存活,并進一步調(diào)節(jié)促炎因子白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的分泌[5]。本研究旨在探討PI3K/AKT信號通路對放射性腸炎的作用及機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 30只健康雄性SD大鼠(6～7周齡,體質(zhì)量180～200 g)購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。大鼠飼養(yǎng)于北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實驗動物房,實驗室溫度為 20℃～24℃,相對濕度為45%～65%,自由飲食飲水。將30只雄性SD大鼠隨機分為0 Gy組、10 Gy組、13 Gy組、16 Gy組、18 Gy組,每組各6只。所有實驗操作和實驗方案經(jīng)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動物倫理委員會審批通過。

1.2 試劑及儀器 TB Green Premix Ex Taq試劑盒,TaKaRa;雅酶一步法PAGE凝膠快速制備試劑盒(6%、10%,上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司);AKT抗體、PI3K抗體(Cell Signaling Technology)、Anti-GAPDH抗體(Sigma-Aldrich)。Rayto RT-6100酶標分析儀(深圳雷度生命科學(xué)股份有限公司);Thermo NanoDrop2000分光光度計(美國Thermo Fisher公司);ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher公司);醫(yī)用直線加速器(醫(yī)科達Infinity,北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院放療科提供)。

1.3 照射方法 10 Gy組、13 Gy組、16 Gy組、18 Gy組大鼠均給予10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉。待大鼠肌肉完全松弛后,以仰臥固定,6MV-X射線單次大劑量給予腹盆照射,照射范圍上界胸骨劍突下、下界恥骨聯(lián)合,周圍不用鉛塊遮擋,源皮距100 cm,吸收劑量率290 cGy/min。

1.4 疾病活動指數(shù) 自照射后第1天起,每天觀察各組大鼠的一般征象,自主活動等情況。依據(jù)疾病活動指數(shù)(disease activity index,DAI)評分標準計算各組大鼠DAI評分[5]。DAI評分越高,表示疾病活動越劇烈,炎癥反應(yīng)越重。

1.5 蘇木精-伊紅染色法 照射后第4、14天,將各組大鼠麻醉開腹,以肛門到盲腸為標志點切取腸組織,生理鹽水沖洗,以4%多聚甲醛溶液固定,腸組織脫水,石蠟包埋、切片,進行蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin,HE)染色。顯微鏡下觀察大鼠腸黏膜組織病理變化,并進行病理評分[6]。評分標準:0 級,正常的直腸黏膜;1 級,很輕微損傷,切片中<10%視野炎性細胞浸潤,黏膜極少量破壞,直腸腺體大體完整,無血管急性充血反應(yīng);2 級,輕微損傷,切片中約10%組織炎性細胞浸潤,黏膜壞死,無脫落,直腸腺體輕度破壞,無血管急性充血反應(yīng);3級,中度損傷,有明顯的直腸上皮丟失,切片中約10%～20%視野炎性細胞浸潤,黏膜壞死,有脫落,直腸部分腺體脫落,可見血管急性充血反應(yīng);4級,嚴重損傷,出現(xiàn)潰瘍或壞死,切片中>20%視野炎性細胞浸潤,黏膜壞死,脫落明顯,直腸腺體脫落,血管急性充血反應(yīng)較多。病理評分越高,表示腸組織炎癥反應(yīng)越重。

1.6 實時熒光定量PCR檢測 取各組大鼠腸組織液氮處理,采用Trizol法提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用TB Green Premix Ex Taq試劑盒進行實時熒光定量PCR檢測,IL-6、TNF-α、IL-1β、內(nèi)參β-actin引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。引物序列如下:IL-6,正向5′-TTCACAGAGGATACCACCCACA-3′,反向5′-CAGTGCATCATCGCTGTTCATAC-3′;TNF-α,正向5′-GCGTGTTCATCCGTTCTCTACC-3′,反向5′-AGAGCCACAATTCCCTTTCTAAGTT- 3′;IL-1β,正向5′-GACAAGCAACGACAAAATCCCT-3′,反向5-GGAACTGTGCAGACTCAAACTCC-3;內(nèi)參β-actin,正向5′-CGTTGACATCCGTAAAGACCTCTA-3′,反向5′-GAGCCACCAATCCACACAGAGTA-3′。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法 取80 mg腸黏膜組織,提取總蛋白,采用蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量,10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白,轉(zhuǎn)膜,室溫下封閉2 h,分別加入PI3K一抗(1∶500稀釋)、AKT一抗(1∶1 000稀釋)、GAPDH一抗(1∶3 000稀釋),以4℃孵育過夜。再加入辣根過氧化物酶標記二抗(1∶20 000稀釋),室溫孵育2 h,浸入電化學(xué)發(fā)光液,使用Chemidoc成像系統(tǒng)進行掃描拍照,應(yīng)用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值,使用GAPDH做為內(nèi)參,統(tǒng)計得出各組大鼠的蛋白表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況及DAI評分比較 0 Gy組大鼠進食、飲水量及排便情況均正常,反應(yīng)靈敏,皮毛光潔;10 Gy組大鼠自照射后第3天體質(zhì)量下降,大便呈黃色,喜靜,皮毛欠光潔;13 Gy組大鼠攝食飲水量明顯減少,自照射后第1天體質(zhì)量下降,出現(xiàn)稀便血便,反應(yīng)遲緩,皮毛光潔度差;16 Gy組與18 Gy組大鼠自照射后第1天起體質(zhì)量下降,出現(xiàn)拒食拒水,毛發(fā)枯槁,蜷縮少動,腹瀉,水樣便膿血便。照射后第4天,16 Gy組大鼠死亡3只,18 Gy組大鼠全部死亡,其余各組未出現(xiàn)因照射死亡。與0 Gy組比較,10、13、16和18 Gy組大鼠腸組織長度呈不同程度縮短,縮短程度與照射劑量呈正相關(guān)(P<0.000 1)。見圖1。10、13、16和18 Gy 組大鼠照射后第4天的DAI評分均高于0 Gy組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。13、16和 18 Gy組大鼠照射后第4天的DAI評分均高于10 Gy組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠DAI評分比較(a.照射后第4天;b.照射后第14天)

2.2 各組大鼠病理組織學(xué)變化比較 HE染色結(jié)果顯示,照射后第4天,0 Gy組大鼠腸黏膜單層柱狀上皮、黏膜肌層和固有層結(jié)構(gòu)完整;10 Gy組大鼠可見輕度隱窩受損,黏膜下少量炎細胞浸潤,為輕度炎癥表現(xiàn);13 Gy組大鼠全層變性、壞死,黏膜層壞死、脫落,大量炎性細胞浸潤;16、18 Gy組大鼠炎癥過重,黏膜層結(jié)構(gòu)部分完全消失,腺體重度損傷。照射后第14天,0 Gy組黏膜上皮完整,排列整齊未見異常;10 Gy組隱窩、腺體結(jié)構(gòu)基本完整,僅可見黏膜組織輕微水腫;13 Gy組腺體萎縮,黏膜下水腫及炎性細胞浸潤。見圖3。10、13、16和18 Gy組大鼠照射后第4天的病理學(xué)評分均高于0 Gy組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);13、16和18 Gy組大鼠照射后第4天的病理學(xué)評分均高于10 Gy組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。10、13 Gy組大鼠照射后第14天的病理學(xué)評分均高于0 Gy組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);13 Gy組大鼠照射后第14天的病理學(xué)評分高于10 Gy組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖3 各組大鼠腸組織病理學(xué)變化比較(a.照射后第4天;b.照射后第14天;HE×200)

圖4 各組大鼠病理學(xué)評分比較(a.照射后第4天;b.照射后第14天)

2.3 各組大鼠腸黏膜IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA表達比較 10、13和16 Gy組照射后第4天大鼠腸黏膜IL-6、TNF-α、IL-1β mRNA表達均高于0 Gy組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);13、16 Gy組大鼠照射后第4天大鼠腸黏膜IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA表達均高于10 Gy組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。10、13 Gy組大鼠照射后第14天腸黏膜IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA表達均高于0 Gy組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);13 Gy組大鼠照射后第14天腸黏膜IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA表達均高于10 Gy組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組大鼠腸黏膜IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA表達比較(a.照射后第4天;b.照射后第14天)

2.4 各組大鼠腸黏膜組織PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達水平比較 10、13和16 Gy組大鼠照射后第4天腸黏膜PI3K、AKT蛋白相對表達量均高于0 Gy組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);13、16 Gy組大鼠照射后第4天腸黏膜PI3K、AKT蛋白相對表達量均高于10 Gy組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。10、13 Gy組大鼠照射后第14天腸黏膜PI3K、AKT蛋白相對表達量均高于0 Gy組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);13 Gy組大鼠照射后第14天腸黏膜PI3K、AKT蛋白相對表達量高于10 Gy組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

圖6 各組腸組織蛋白表達水平比較(a.照射后第4天;b.照射后第14天)

3 討論

PI3K/AKT信號通路是細胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)通路之一[7]。有研究報道,PI3K/AKT通路在多種疾病中對細胞的存活、凋亡和轉(zhuǎn)移過程中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用[8-11]。有研究報道,PI3K/AKT信號通路參與放射性腸炎的發(fā)生[12]。PI3K具有第二信使作用,多種生長因子和信號傳導(dǎo)復(fù)合物均能啟動PI3K的激活過程,最終磷酸化AKT[13-14]。AKT磷酸化可導(dǎo)致核因子-κB活化,活化后的核因子-κB異位入核,促進細胞轉(zhuǎn)錄基因編碼大量炎癥反應(yīng)蛋白(IL-6、TNF-α、IL-1β),進而誘導(dǎo)單核細胞、巨噬細胞和血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生炎性細胞浸潤,分泌產(chǎn)生炎性因子和炎癥遞質(zhì),促進趨化中性粒細胞等炎性細胞進入腸道病變部位,引起一系列組織破壞[15-20]。

本研究結(jié)果顯示:與0 Gy組比較,10 Gy組大鼠相應(yīng)表型不明顯;13 Gy組大鼠DAI及病理評分均升高,且病理損傷程度符合放射性腸炎的病理變化;16、18 Gy組大鼠病理損傷過重,大量死亡,難以開展進一步的觀察研究。這提示,X線造成腸上皮細胞損傷,炎性細胞浸潤,腸組織結(jié)構(gòu)破壞,其中存活數(shù)量最多的大鼠中13 Gy組放射劑量最大,為該實驗最佳放射劑量。本研究結(jié)果還顯示,各組大鼠的腸黏膜組織PI3K、AKT蛋白相對表達量均高于0 Gy組,IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA表達量均高于0 Gy組。

這提示,放射性腸炎發(fā)病機制可能為X線照射激活PI3K/AKT通路,促使IL-6、TNF-α、IL-1β表達上調(diào),致使腸道炎癥出現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示,除0 Gy組外,照射后第4天其他照射組大鼠的腸組織縮短程度、DAI及病理評分均高于第14天;第4天較第14天各指標表達量升高更加顯著。這提示,照射后第4天大鼠的癥狀最重,第14天已出現(xiàn)自愈,因此該方法建立的放射性腸炎大鼠模型最佳造模時間為7～10 d。

綜上所述,直線加速器單次腹盆腔局部照射13 Gy能在保證大鼠存活率的前提下最大程度增加對腸組織的損傷,成功誘導(dǎo)大鼠放射性腸炎,可作為最佳照射劑量,且其發(fā)病機制可能與PI3K/AKT信號通路有關(guān)。