趙瑩瑩, 陳莉莎, 閆 麗, 王愷悅, 于月新

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 生殖醫(yī)學科,遼寧 沈陽 110016

近年來,不孕不育癥的發(fā)病率呈逐年升高趨勢,全球8%～12%的育齡夫婦患有不孕不育癥[1],其中,與男性有關的不育癥約占所有不孕不育癥的50%[2]。導致男性不育的因素有很多,主要包括生殖系統(tǒng)損傷、內分泌紊亂、環(huán)境污染、不良生活方式、藥物引發(fā)不良反應等[3-4]?；钚匝跏且活惥哂懈叨然钚缘难踝杂苫目偡Q,包括超氧陰離子、過氧化氫、過氧自由基及羥基自由基等[5]。氧化應激主要是由于細胞內的抗氧化劑清除活性氧的能力下降或細胞內活性氧的產生過多無法及時清除,導致細胞內的抗氧化/氧化平衡失調,細胞內的自由基濃度增加,進而干擾細胞正常代謝過程[6]。有研究報道,氧化應激損傷是精子細胞功能障礙的主要原因,也是通過損傷精子結構和功能完整性而導致男性不育的主要病因,目前,氧化應激誘導精子功能下降的確切機制尚不清楚,但主要歸因于軸突的過氧化損傷和細胞內ATP水平的消耗,其次是由于脂膜過氧化及細胞核、線粒體的DNA斷裂而產生過量的4-羥基壬烯醛和丙二醛[7-8]。雷公藤多苷片被長期廣泛用于治療炎癥和免疫疾病,其主要藥理有效成分為雷公藤甲素,具有生殖毒性。過量攝入雷公藤甲素會干擾睪丸能量代謝和正常生殖功能,導致精子質量下降,睪丸萎縮,從而導致男性生殖功能障礙。有研究發(fā)現,雷公藤甲素作為化學制劑對男性生殖損傷具有較高的穩(wěn)定性和重現性,而相較于物理方法和手術手段對實驗動物進行造模損傷,化學方法應用于生殖障礙動物模型具有簡便和成本低的優(yōu)點[9]。因此,本研究選擇了雷公藤甲素作為雄性不育動物模型的模型藥物。既往研究發(fā)現,原花青素可激活核因子E2相關因子2(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)-Kelch樣ECH關聯蛋白1(recombinant Kelch like ECH associated protein 1,Keap1)信號通路,抑制氧化應激反應[10]。本研究旨在探討原花青素對雄性小鼠生殖功能損傷的作用及其相關機制?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性健康C57/BL6J小鼠24只,體質量18～22 g,購自遼寧長生生物科技有限公司。小鼠均飼養(yǎng)于SPF級實驗室,溫度維持在(22℃±3℃),濕度維持在45%～65%,自由飲食飲水。適應性飼養(yǎng)7 d后,將小鼠隨機分入3組,每組各8只。對照組:小鼠灌胃或腹腔注射0.9%生理鹽水。模型組:小鼠經0.9%生理鹽水灌胃1 h后腹腔注射雷公藤甲素120 μg/kg。干預組:原花青素250 mg/kg灌胃處理1 h后腹腔注射雷公藤甲素120 μg/kg。連續(xù)處理28 d,每3 d給小鼠稱體質量以調整灌胃和腹腔注射劑量。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 樣品采集 小鼠處死前禁食不禁水12 h,以2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠,分別取血和睪丸,將左右兩邊睪丸分別稱質量,測定睪丸臟器指數;同時,收集小鼠右側附睪進行精子分析。收集小鼠血清和右側睪丸,放置于-80℃冰箱保存待用。

1.3 小鼠附睪精子參數測定 將整個右側附睪置于1 ml 37℃預熱生理鹽水中,迅速將附睪尾剪碎,放置于37℃水浴鍋中10 min,使精子從附睪小管中游出。(1)精子數量的測定:將精子懸液滴入血球計數板上,蓋上蓋玻片,將其置于顯微鏡下觀察,按紅細胞計數法對鏡下的精子進行計數,測定小鼠的精子數量。(2)精子活力的測定:將滴有精子懸液的血球計數板于顯微鏡下觀察,每次隨機記錄100個精子中具有活動力的精子數量。

1.4 酶聯免疫吸附檢測 對小鼠血清的生殖激素水平和氧化應激水平進行測定。測定的生殖激素主要包括睪酮、雌二醇、卵泡刺激素、黃體生成素,氧化應激指標包括丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶。檢測均通過小鼠酶聯免疫吸附檢測試劑盒進行,嚴格按照說明書進行具體操作。

1.5 Western-blot檢測 分別進行睪丸組織中Nrf2-Keap1蛋白的提取和總蛋白測定后,將蛋白樣品經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉移至PVDF膜上,室溫封閉1 h,一抗4℃孵育過夜。TBST漂洗3次,加入相對應二抗室溫孵育1 h。TBST漂洗3次,采用ECL Western印跡試劑盒進行化學發(fā)光檢測。

2 結果

2.1 3組小鼠精子參數比較 模型組小鼠精子數量和活力低于對照組,干預組小鼠精子數量和活力高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 3組小鼠精子參數比較

2.2 3組小鼠體質量及睪丸臟器指數比較 3組小鼠體質量比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型組小鼠睪丸臟器指數低于對照組,干預組小鼠睪丸臟器指數高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 3組小鼠體質量和睪丸臟器指數比較

2.3 3組小鼠血清生殖激素水平比較 模型組小鼠血清睪酮和雌二醇水平高于對照組,卵泡刺激素和黃體生成素水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);干預組小鼠血清睪酮和雌二醇水平低于模型組,卵泡刺激素和黃體生成素水平高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 3組小鼠血清生殖激素水平比較

2.4 3組小鼠氧化應激水平比較 模型組小鼠丙二醛水平高于對照組,超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);干預組小鼠丙二醛水平低于模型組,超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶水平高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組小鼠氧化應激水平比較

2.5 3組小鼠睪丸組織中Nrf2-Keap1蛋白表達水平比較 模型組Nrf2蛋白和Keap1蛋白表達水平低于對照組,干預組Nrf2蛋白和Keap1蛋白表達水平高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 3組小鼠睪丸組織中Nrf2、Keap1蛋白表達水平比較

3 討論

本研究通過對小鼠腹腔注射雷公藤甲素成功建立了雄性小鼠生殖功能損傷模型,在該損傷模型中觀察到小鼠精子質量明顯惡化,睪丸臟器指數降低,血清生殖激素水平紊亂,睪丸組織內觸發(fā)了氧化應激改變,與既往研究[11-12]結果一致。本研究結果顯示:模型組小鼠精子數量和活力低于對照組,干預組小鼠精子數量和活力高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);模型組小鼠睪丸臟器指數低于對照組,干預組小鼠睪丸臟器指數高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);模型組小鼠血清睪酮和雌二醇水平高于對照組,卵泡刺激素和黃體生成素水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),干預組小鼠血清睪酮和雌二醇水平低于模型組,卵泡刺激素和黃體生成素水平高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);模型組小鼠丙二醛水平高于對照組,超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),干預組小鼠丙二醛水平低于模型組,超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶水平高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);模型組Nrf2蛋白和Keap1蛋白表達水平低于對照組,干預組Nrf2蛋白和Keap1蛋白表達水平高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。即原花青素可改善雷公藤甲素誘導的小鼠精子參數、睪丸臟器指數、生殖激素及氧化應激水平,其保護作用機制可能是通過Nrf2-Keap1通路抑制睪丸組織氧化應激。

氧化應激會通過誘導質膜過氧化損傷而引發(fā)生精功能障礙[13]。因精子富含多不飽和脂肪酸,與其他細胞相比,對氧化損傷更為敏感[14]?；钚匝醯漠a生也會降低睪丸組織中精原細胞的數量,不利于精子產生[15]。原花青素干預處理有效降低了雷公藤甲素誘導的精子質量惡化,這可能與睪丸微環(huán)境氧化應激的改善有關,表現為丙二醛水平降低、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性升高。Nrf2是一種結構復雜,在肝、脾、腎等器官中高度表達并在抗氧化體系中發(fā)揮著重要作用的蛋白[16]。原花青素可誘導Keap1半胱氨酸殘基的共價修飾使其構象改變,緊密結合的Nrf2-Keap1二聚體解偶聯,從而抑制Nrf2泛素化,促進其磷酸化,使游離的Nrf2進入細胞核[17]。Nrf2進入細胞核后,與Maf蛋白或Jun蛋白、Fos蛋白結合形成異二聚體,隨后與ARE基因識別并結合,激活下游抗氧化酶,如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等[18]。本研究中,模型組Nrf2蛋白和Keap1蛋白表達水平低于對照組,干預組Nrf2蛋白和Keap1蛋白表達水平高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。即雷公藤甲素會降低Nrf2和Keap1的表達水平,而原花青素預處理可通過激活Nrf2-Keap1進一步增加抗氧化酶的表達。這提示,原花青素對睪丸損傷的保護作用可能與Nrf2表達上調有關。

綜上所述,原花青素能夠改善雄性小鼠生殖功能損傷,其機制與調節(jié)Nrf2-Keap1抗氧化系統(tǒng)有關。