黃海榮

高通量測序技術(shù)泛指二代測序技術(shù)和三代測序技術(shù),也被統(tǒng)稱為新一代測序技術(shù)(next generation sequencing,NGS)。依據(jù)檢測策略的不同,高通量測序方法主要分為靶向測序(targeted NGS,tNGS)、宏基因組(metagenomics NGS,mNGS),以及全基因組測序(whole genome sequencing,WGS)。tNGS先通過靶向捕獲特定基因后再進(jìn)行高通量測序,具有能同時(shí)平行檢測多個(gè)靶基因的特點(diǎn),近期在結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)耐藥基因檢測領(lǐng)域開始被應(yīng)用[1]。 2023年7月,世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)發(fā)布了《應(yīng)用新一代靶向測序技術(shù)檢測耐藥結(jié)核病:快速通告,2023》[2],在tNGS技術(shù)全球應(yīng)用尚處于起步階段的背景下,足以體現(xiàn)WHO對新一代tNGS技術(shù)在耐藥結(jié)核病診斷中應(yīng)用前景的認(rèn)可和高度重視。WHO希望在有關(guān)tNGS技術(shù)在耐藥結(jié)核病診斷中應(yīng)用的更為詳細(xì)的數(shù)據(jù)正式公布之前,提前向全球分享此次對該項(xiàng)技術(shù)分析后的主要發(fā)現(xiàn)和結(jié)論,以提高結(jié)核病防控領(lǐng)域?qū)NGS技術(shù)檢測MTB耐藥應(yīng)用價(jià)值的認(rèn)識,從而推動(dòng)該新技術(shù)的合理應(yīng)用和推廣。

一、tNGS技術(shù)檢測MTB耐藥推薦意見的形成過程

2022年,WHO組織專家對商業(yè)化的以診斷耐藥結(jié)核病為目標(biāo)的tGNS技術(shù)相關(guān)的已發(fā)表和待發(fā)表的數(shù)據(jù)進(jìn)行薈萃分析。專家組以臨床標(biāo)本處理作為關(guān)注的起點(diǎn),以檢測報(bào)告作為結(jié)果評價(jià)的對象,對耐藥基因突變的解讀以WHO的MTB標(biāo)準(zhǔn)基因突變目錄作為參考依據(jù),對tGNS技術(shù)的診斷準(zhǔn)確性、成本效益,以及檢測的可行性、可接受性、公平性和用戶評價(jià)等進(jìn)行綜合分析。WHO專門成立了指南制定小組(Guideline Development Group,GDG),在2023年5月召開會議,對薈萃分析結(jié)果進(jìn)行討論并形成推薦意見。本版快速通告發(fā)布的目的是為向國家級結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施者及其他利益相關(guān)方分享WHO對tNGS技術(shù)診斷耐藥結(jié)核病數(shù)據(jù)分析后的主要發(fā)現(xiàn)和觀點(diǎn),更為詳細(xì)的數(shù)據(jù)和建議將在晚些時(shí)候發(fā)布的《WHO結(jié)核病整合指南模塊3:診斷——結(jié)核病的快速診斷(2023年修訂版)》中發(fā)布。

二、tNGS技術(shù)應(yīng)用于耐藥結(jié)核病診斷的臨床背景

雖然耐藥分子診斷技術(shù)不斷問世,普及程度逐步提高,但常用分子檢測技術(shù)的缺陷也日益顯現(xiàn)。目前主流的分子診斷技術(shù)產(chǎn)品主要針對特定藥物的靶基因進(jìn)行檢測,雖然技術(shù)的可靠性已被廣泛認(rèn)可,但對于尚沒有建立相應(yīng)檢測方法的抗結(jié)核藥物,在化療方案中選用這些藥物仍具有盲目性[3]?？紤]到耐藥的實(shí)際發(fā)生情況,不管是針對敏感結(jié)核病的化療方案還是耐藥結(jié)核病化療方案,均存在選藥不當(dāng)?shù)娘L(fēng)險(xiǎn)。即便是抗結(jié)核新藥如貝達(dá)喹啉、利奈唑胺和普托馬尼,隨著應(yīng)用的增多必然帶來耐藥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。在WHO推薦的快速檢測診斷技術(shù)中,有的技術(shù)能迅速檢測出利福平耐藥,但由于缺乏對應(yīng)的技術(shù)快速檢測細(xì)菌是否對異煙肼耐藥,因此無法快速判斷患者是否患有耐多藥結(jié)核病,由此誕生了“利福平耐藥”這一耐藥定義。利福平耐藥的定義屬于權(quán)宜之計(jì),反映了對其他藥物快速耐藥診斷能力的不足。據(jù)估計(jì),臨床利福平敏感但異煙肼耐藥的結(jié)核病患者數(shù)是利福平耐藥患者數(shù)的2倍,而全球耐多藥/利福平耐藥結(jié)核病患者中,氟喹諾酮類藥物耐藥率約為20%,但由于缺乏適宜的快速檢測技術(shù),不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)這些耐藥患者。因此,對于耐多藥/利福平耐藥結(jié)核病患者,不能避免對其仍然采用相應(yīng)藥物治療[4]。此外,針對耐多藥/利福平耐藥結(jié)核病已經(jīng)建立了多種強(qiáng)有力的化療方案,如BPaLM(B:貝達(dá)喹啉,Pa:普托馬尼,L:利奈唑胺,M:莫西沙星)方案,其所包含的貝達(dá)喹啉和利奈唑胺是該方案中的核心藥物,如果核心藥物發(fā)生耐藥會導(dǎo)致治療失敗,因此,也需要建立針對新型抗結(jié)核藥物的耐藥檢測方法?？傊?為提高藥物敏感結(jié)核病和耐藥結(jié)核病的治療成功率,亟待建立能夠?qū)崿F(xiàn)對抗結(jié)核治療方案中所有被包含藥物的耐藥檢測技術(shù)。在上述背景下,能夠一次檢測多達(dá)幾十個(gè)靶標(biāo)的tNGS技術(shù)在耐藥結(jié)核病領(lǐng)域的應(yīng)用受到了高度關(guān)注[5]。

三、WHO對tNGS技術(shù)臨床應(yīng)用的主要觀點(diǎn)及對結(jié)核病防治工作的指導(dǎo)意義

(一)tNGS 檢測MTB耐藥具有常規(guī)分子檢測技術(shù)不具備的優(yōu)勢

tNGS技術(shù)可以納入多種藥物的耐藥基因作為檢測靶標(biāo),單一的一次檢測即可實(shí)現(xiàn)對多達(dá)10余種抗結(jié)核藥物的藥物敏感性進(jìn)行判斷,上述藥物既可包括常規(guī)的抗結(jié)核藥物,也包括各種新型抗結(jié)核藥物;檢測可直接應(yīng)用于臨床標(biāo)本,并可在收到標(biāo)本后當(dāng)天或幾天內(nèi)報(bào)告結(jié)果;易于根據(jù)抗結(jié)核藥物耐藥機(jī)制研究的進(jìn)展擴(kuò)展納入耐藥相關(guān)的新基因靶標(biāo);能夠給出各種基因突變的具體類型,有助于區(qū)分同一基因中不同突變類型導(dǎo)致的不同程度的耐藥[6]。

鑒于tNGS技術(shù)在靶基因數(shù)量和突變類型檢測方面強(qiáng)大的優(yōu)勢,且用時(shí)較短,因此,該技術(shù)具有良好的應(yīng)用前景。目前關(guān)于tNGS技術(shù)臨床應(yīng)用的數(shù)據(jù)還比較少,但已展現(xiàn)出符合預(yù)期的表現(xiàn),結(jié)果可靠,一次即可獲得10余種藥物的耐藥基因突變情況。未來隨著技術(shù)的日臻完善,每例病原學(xué)陽性的結(jié)核病患者都可以在就醫(yī)后的短時(shí)間內(nèi)獲得可用抗結(jié)核藥物完整的耐藥譜,指導(dǎo)針對個(gè)體的精準(zhǔn)化療方案的制定,將會對提高結(jié)核病治愈率有立竿見影的效果,并由此縮短患者排菌時(shí)間,減少疾病傳播。

(二)tNGS技術(shù)檢測MTB耐藥性具有良好的可靠性

薈萃分析顯示,tNGS檢測呼吸道標(biāo)本診斷耐藥結(jié)核病具有很高的敏感度和特異度。在病原學(xué)確診的肺結(jié)核患者中,tNGS檢測利福平、異煙肼、莫西沙星及乙胺丁醇耐藥性的合并敏感度均≥95%,檢測左氧氟沙星和吡嗪酰胺耐藥性的合并敏感度分別為94%和88%,而tNGS檢測耐藥性的特異度在所有藥物中均≥96%。在病原學(xué)確診的利福平耐藥結(jié)核病患者中,tNGS檢測異煙肼、左氧氟沙星、莫西沙星、吡嗪酰胺及乙胺丁醇耐藥的合并敏感度均≥95%,而對貝達(dá)喹啉(68%)、利奈唑胺(69%)、氯法齊明(70%)、阿米卡星(87%)和吡嗪酰胺(90%)耐藥檢測的敏感度偏低,但準(zhǔn)確性仍在可接受范圍內(nèi);除鏈霉素(75%)以外,tNGS檢測其他所有抗結(jié)核藥物耐藥性的特異度均≥95%。

對于大多數(shù)常用抗結(jié)核藥物,tNGS技術(shù)檢測耐藥的敏感度和特異度不低于現(xiàn)有的已被廣泛認(rèn)可的表型藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“表型藥敏試驗(yàn)”)或耐藥分子檢測技術(shù),表明其已滿足了臨床應(yīng)用的性能要求。一些相對較新的抗結(jié)核藥物的耐藥檢測的敏感度雖不十分理想,但特異度很高,因此,對于這些藥物tNGS技術(shù)診斷耐藥的可靠性很好,但會出現(xiàn)耐藥患者漏檢。一些藥物耐藥檢測的性能指標(biāo)較低,一方面可能是作為對照方法的表型藥敏試驗(yàn)自身在可重復(fù)性和準(zhǔn)確性方面存在不足,以乙胺丁醇和吡嗪酰胺最為突出[7]。另一方面,一些新型抗結(jié)核藥物還未能建立公認(rèn)可靠的表型藥敏試驗(yàn)方法[8],也缺乏對耐藥機(jī)制的全面了解,導(dǎo)致耐藥相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)不足,如利奈唑胺、貝達(dá)喹啉、氯法齊明等,由此造成很多體外藥敏試驗(yàn)顯示耐藥程度較高的菌株并未發(fā)現(xiàn)存在已知耐藥基因的突變[9-11]。因此,對于上述新藥,其tNGS檢測性能的提高有賴于后續(xù)研究的進(jìn)展。此外,當(dāng)臨床標(biāo)本中MTB載量較低時(shí),容易出現(xiàn)表型藥敏試驗(yàn)和分子檢測結(jié)果不一致的情況。NGS技術(shù)可發(fā)現(xiàn)菌群中含量非常低的基因突變,但非常少量的耐藥菌是否會發(fā)展成真正耐藥還有待更多研究證實(shí)[12]。

(三)開展tNGS檢測MTB耐藥在某些應(yīng)用場景下符合成本效益

WHO挑選了3個(gè)結(jié)核病流行程度不同的國家(包括格魯吉亞、印度和南非)開展tNGS檢測MTB耐藥的成本效益的模型分析。tNGS檢測成本中以試劑和耗材占比最高。格魯吉亞作為一個(gè)高耐多藥/利福平耐藥結(jié)核病負(fù)擔(dān)國家,如果將tNGS作為所有經(jīng)病原學(xué)確診結(jié)核病患者的初始耐藥檢測的方法,只有在支付意愿(willingness-to-pay,WTP)閾值3倍于該國人均國民生產(chǎn)總值的情況下才符合成本效益。當(dāng)在上述3個(gè)國家所有的利福平耐藥結(jié)核病患者中以tNGS技術(shù)取代表型藥敏試驗(yàn)時(shí),在印度無論WTP閾值高低tNGS檢測MTB耐藥均符合成本效益;南非只有在3倍于WTP閾值時(shí)才符合成本效益;而在格魯吉亞tNGS檢測MTB耐藥則完全不符合成本效益。當(dāng)tNGS技術(shù)同時(shí)檢測多種病原體或結(jié)核病患者數(shù)量很多時(shí),更傾向于符合成本效益,如果考慮開展tNGS檢測會使有效治療方案的實(shí)施提前,則成本效益會明顯增加。

目前,tNGS還屬于一項(xiàng)價(jià)格昂貴的檢測技術(shù),因此,在上述分析中顯示僅特定場景下的應(yīng)用符合成本效益。正如其他新技術(shù)的推廣使用過程一樣,隨著tNGS技術(shù)應(yīng)用的鋪開,越來越多的企業(yè)會參與到tNGS產(chǎn)品研發(fā)與注冊中,檢測產(chǎn)品的性能將不斷優(yōu)化,試劑和耗材的成本也會隨著檢測數(shù)量的大幅增加而逐步降低。因此,未來tNGS技術(shù)檢測MTB耐藥將越來越符合成本效益,并能夠適用于更多的應(yīng)用場景。此外,在WHO的上述分析中,并未將tNGS檢測縮短耐藥診斷延誤、減少抗耐藥結(jié)核病治療啟動(dòng)的延遲納入分析,因此,tNGS檢測實(shí)際的成本效益應(yīng)該會更好。

(四)技術(shù)人員對tNGS檢測MTB耐藥的技術(shù)接受程度高

WHO委托相關(guān)人員對直接操作tNGS的檢驗(yàn)技術(shù)人員和管理人員及結(jié)核病診療領(lǐng)域的國際專家進(jìn)行了訪談(共17位受訪者),對tNGS操作的接受程度進(jìn)行了定量分析,發(fā)現(xiàn)受訪人員對tNGS技術(shù)接受度高,并非?？春眉夹g(shù)的應(yīng)用前景,普遍認(rèn)為其是MTB耐藥檢測領(lǐng)域的一個(gè)“重大的進(jìn)步”。受訪人員認(rèn)可的tNGS優(yōu)點(diǎn)包括能直接應(yīng)用于臨床標(biāo)本、同時(shí)對多種藥物進(jìn)行耐藥檢測、時(shí)間快速(3～5 d),但存在技術(shù)操作復(fù)雜、需要專用設(shè)施和設(shè)備、對操作人員要求高等缺點(diǎn)。此外,受訪人員還認(rèn)可,設(shè)備安裝、人員培訓(xùn)、可靠的物流、高效準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)管理、數(shù)據(jù)存儲,以及穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)連接等將會對技術(shù)推廣帶來挑戰(zhàn),因此,認(rèn)為tNGS技術(shù)目前更適于在中心實(shí)驗(yàn)室/中心檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)開展。

目前,tNGS技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)都非常鮮明,但由于其優(yōu)點(diǎn)非常突出,一定程度上使其缺點(diǎn)也能夠被技術(shù)人員所接受。應(yīng)該看到,技術(shù)現(xiàn)有的缺點(diǎn)正是未來tNGS技術(shù)優(yōu)化的研究方向。體外診斷技術(shù)的發(fā)展方向是床旁檢測技術(shù),即現(xiàn)場快速檢驗(yàn)(point-of-care testing,POCT),提高tNGS技術(shù)操作的全自動(dòng)化程度,增加數(shù)據(jù)分析的簡便性,不斷降低設(shè)備和試劑耗材的價(jià)格,減少對設(shè)施的要求,將是tNGS真正走向臨床應(yīng)用,甚至未來替代傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)和分子檢測的必經(jīng)之路。

(五)目前符合WHO診斷性能標(biāo)準(zhǔn)的tNGS產(chǎn)品及其覆蓋的藥物

薈萃分析主要關(guān)注了不同廠家tNGS產(chǎn)品相關(guān)的已發(fā)表或尚未發(fā)表的數(shù)據(jù),并由此確定了符合WHO對結(jié)核病耐藥分子檢測要求的產(chǎn)品清單:

1.Deeplex?Myc-TB(法國GenoScreen公司):適合開展利福平、異煙肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、氟喹諾酮類藥物、貝達(dá)喹啉、利奈唑胺、氯法齊明、阿米卡星及鏈霉素的耐藥檢測。

2.NanoTB?(英國Oxford Nanopore Technolo-gies 公司):適合開展利福平、異煙肼、氟喹諾酮類藥物、利奈唑胺、阿米卡星及鏈霉素的耐藥檢測。

3.TBseq?(杭州圣庭醫(yī)療科技有限公司):適合開展乙胺丁醇耐藥檢測。

上述推薦僅參考了已公開發(fā)表的數(shù)據(jù)或是能夠獲得的相關(guān)數(shù)據(jù),在此基礎(chǔ)上形成了對特定產(chǎn)品的推薦,對未納入數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的產(chǎn)品無法客觀評判。我國在MTB耐藥檢測tNGS技術(shù)研發(fā)方面處于世界的前沿,多家公司的產(chǎn)品已通過第三方實(shí)驗(yàn)室的方式應(yīng)用于臨床,為臨床診療提供了重要參考依據(jù)。目前國內(nèi)的tNGS產(chǎn)品正處于不斷提高檢測性能和自動(dòng)化水平,降低成本,增加檢測靶標(biāo)的產(chǎn)品完善階段,相信未來在此領(lǐng)域國產(chǎn)產(chǎn)品也能夠大放異彩。

四、結(jié)語

現(xiàn)有證據(jù)支持對確診的結(jié)核病患者采用tNGS技術(shù)進(jìn)行快速診斷耐藥,以為結(jié)核病治療方案的制定提供更全面的耐藥譜,提高化療方案制定的精準(zhǔn)性。然而,目前tNGS技術(shù)還不能完全取代現(xiàn)有耐藥分子檢測技術(shù),尤其是一些快速、簡易、經(jīng)濟(jì)的分子檢測技術(shù),如WHO推薦的快檢診斷技術(shù),目前仍然具備良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。tNGS技術(shù)能在短時(shí)間內(nèi)獲得多種藥物敏感性信息的強(qiáng)大優(yōu)勢,決定了其將成為未來MTB耐藥分子診斷產(chǎn)品研發(fā)的重要方向,而其可靠性和實(shí)用性的提高取決于MTB對抗結(jié)核藥物耐藥機(jī)制研究的不斷進(jìn)步,以及產(chǎn)品檢測性能的不斷優(yōu)化。

利益沖突作者聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)黃海榮:醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱