席培宇,郭玉琳,吳鳳嬋,李安定

(貴州省生物研究所,貴州 貴陽 550000)

0 引言

羅漢果(Siraitiagrosvenorii)是葫蘆科多年生藤本植物,其種質(zhì)資源主要集中在廣西省永?？h、龍勝縣等地,它的果實具有化痰止咳、清肺潤腸的功效,且同時富含多種維生素、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分[1-2]。此外,果實中的甜苷V(MogrosidesV)是非糖甜味物質(zhì)之一,甜度為蔗糖的300～400倍,是糖尿病人、高血壓等患者的理想糖類替代品,因此享有“神仙果”“東方神果”等美譽(yù),是衛(wèi)生部首批公布的藥食兩用中藥材[3-4]。近年來,醫(yī)藥行業(yè)及食品生產(chǎn)企業(yè)對羅漢果的需求逐年增加,帶動了全國羅漢果種植業(yè)的蓬勃發(fā)展。貴州銅仁市江口縣、榕江縣等地也開始大面積種植青皮羅漢果。

當(dāng)前,羅漢果的繁殖方式主要采用扦插或壓蔓。但是無性繁殖會隨著代數(shù)的增加導(dǎo)致種性退化,產(chǎn)生較多病毒病,導(dǎo)致產(chǎn)量大幅度下降[5]。目前利用組織培養(yǎng)技術(shù)培育脫毒的羅漢果種苗是解決羅漢果品種退化問題的重要手段之一。利用組培技術(shù)建立羅漢果不定芽誘導(dǎo)、增殖、生根培養(yǎng)體系,經(jīng)壯苗馴化后能夠培育出優(yōu)質(zhì)的羅漢果種苗[6]。本實驗以羅漢果的莖段為外植體,探究不同消毒劑、消毒時間、不同外源添加物種類及濃度配比對羅漢果莖段組織培養(yǎng)的影響,并優(yōu)化出最佳組培快繁條件,縮短培養(yǎng)周期,提高增殖效率,建立高效的羅漢果植株再生體系,為規(guī)范化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)羅漢果種苗提供理論依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為青皮羅漢果,于2022年8月取自銅仁市江口縣羅漢果種植基地,剪取健壯、無病蟲害羅漢果幼苗的植株嫩莖。

1.2 試驗方法

1.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基及絲瓜絡(luò)提取物的制備

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:MS加入25 g/L蔗糖,7 g/L瓊脂和0.5 g/L的花寶1號;芽誘導(dǎo)和芽增殖培養(yǎng)基:MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加不同種類及濃度的植物激素制備;生根培養(yǎng)基以1/2 MS加25 g/L的蔗糖,7 g/L的瓊脂,0.5 g/L的花寶1號和0.2 g/L的碳粉為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。調(diào)節(jié)pH在5.8。

絲瓜絡(luò)提取物的制備方法:將絲瓜絡(luò)與水按體積比1∶1混合后,先大火煮沸,之后文火煮15～20 min,過濾得第一次濾液和濾渣,將濾渣與水按體積比為1∶1混合后,先大火煮沸,之后文火煮15～20 min,過濾得第二次濾液;將第一次濾液和第二次濾液合并后,減壓濃縮為原體積的1/10～1/8,得到絲瓜絡(luò)提取物。

1.2.2 外植體消毒

將羅漢果幼嫩枝條用清水洗凈,用0.05%的高錳酸鉀溶液浸泡25 min,用超純水清洗干凈后,放入超凈工作臺中;將羅漢果幼嫩枝條剪成約0.5 cm的帶腋芽小段,先用滅菌水沖洗3～5遍,再分別用0.1%的升汞處理6 min、8 min、10 min,用滅菌水沖洗3～5遍后,分別用75%乙醇處理30 s、1 min,最后用滅菌水沖洗3～5遍,置于無菌濾紙上,吸干表面水分后接種于MS無添加任何激素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上,每個處理接種10瓶,每瓶接種3個帶腋芽小段,置于25 ℃±2 ℃下暗培養(yǎng)一周進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),7 d后統(tǒng)計污染率和成活率。

1.2.3 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

將預(yù)培養(yǎng)一周的無菌莖段分別接種在MS+絲瓜絡(luò)提取物(1.0 mg/L,2.0 mg/L,3.0 mg/L)的培養(yǎng)基上,每個處理接種10瓶,每瓶接種2個莖段,置于25 ℃±2 ℃,光照12 h/d,強(qiáng)度1000 lx的溫室中培養(yǎng),21 d后統(tǒng)計腋芽成活率,篩選出最佳芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.2.4 不定芽繼代增殖培養(yǎng)

切取誘導(dǎo)出的不定芽分別接種到繼代增殖培養(yǎng)基中MS+絲瓜絡(luò)提取物(0.8 mg/L,1.0 mg/L,1.2 mg/L)+NAA(0.08 mg/L,0.1 mg/L,0.12 mg/L),置于25 ℃±2 ℃培養(yǎng)室培養(yǎng),每日光照12 h,光照強(qiáng)度1000 lx,21 d后統(tǒng)計芽增值率,篩選出最佳芽增殖培養(yǎng)基。

1.2.5 生根培養(yǎng)

將生長健壯的芽苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中,25 ℃±2 ℃培養(yǎng)室培養(yǎng),每日光照16 h,光照強(qiáng)度1000 lx。生根培養(yǎng)基 :1/2 MS+IBA(0.05 mg/L,0.1 mg/L,0.15 mg/L)+NAA(0.05 mg/L,0.1 mg/L,0.15 mg/L),3～4周后統(tǒng)計生根率,篩選出最佳生根培養(yǎng)基。

1.2.6 煉苗與移栽

待組培苗長出4～5根主根,3～5片新葉,高約10 cm時將瓶蓋逐漸打開,往培養(yǎng)瓶里加少量滅菌水保濕,溫室煉苗3～5 d后將組培苗拿出來,用滅菌水把根部殘留的培養(yǎng)基洗干凈,并適當(dāng)修剪葉片和根長,后將組培苗接種在3種經(jīng)過滅菌處理的不同組合基質(zhì)中,煉苗在大棚中進(jìn)行,自然光照和自然溫度。3種基質(zhì)組合分別為A:蛭石+珍珠巖(2∶1)、B:蛭石+珍珠巖+苔蘚(2∶1∶1)、C:蛭石+珍珠巖+苔蘚+樹皮(1∶1∶1∶1)。其中苔蘚覆蓋在表面用于保濕,移栽后需加強(qiáng)通風(fēng)換氣保濕,3個基質(zhì)組合,每個處理16株組培苗,4周后觀察并統(tǒng)計移栽苗的生長情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

污染率=(污染個數(shù)/外植體總數(shù))×100%,成活率=(成活個數(shù)/外植體總數(shù))×100%,芽誘導(dǎo)率=(新萌芽數(shù)/外植體總數(shù))×100%,增殖系數(shù)=新誘導(dǎo)不定芽數(shù)/接種莖段芽數(shù),生根率=生根個數(shù)/接種數(shù),用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒試劑及消毒時間對外植體處理效果的影響

由表1可知,在相同時間0.75%乙醇處理下,隨著0.1%氯化汞消毒時間的增加,芽成活率整體呈先升后降的趨勢,污染率整體呈下降趨勢。在0.1%氯化汞消毒8 min和75%乙醇消毒30 s時,芽成活率最高,為81.4%;在0.1%氯化汞消毒10 min和75%乙醇消毒60 s時,芽成活率、污染率均最低,分別為35.7%和6.7%。這說明隨著消毒時間進(jìn)一步延長,對外植體內(nèi)部結(jié)構(gòu)可能造成損傷,導(dǎo)致成活率降低;而污染率與消毒劑處理時長呈正相關(guān),處理的時間越長,污染率越低。研究結(jié)果表明,0.1%氯化汞溶液消毒8 min和75%乙醇消毒30 s處理的莖芽成活率最高。

表1 不同消毒試劑及消毒時間對外植體處理效果的影響

2.2 不同激素對羅漢果芽誘導(dǎo)的影響

將預(yù)培養(yǎng)一周的無菌帶腋芽莖段分別接種于含不同濃度絲瓜絡(luò)提取物的培養(yǎng)基中進(jìn)行芽誘導(dǎo)培養(yǎng),見表2。由表2可知,隨著絲瓜絡(luò)提取物濃度的增多,芽誘導(dǎo)率是先上升后下降,當(dāng)絲瓜絡(luò)提取物濃度為2.0 mg/L時,芽誘導(dǎo)率最高,為92%,且長勢較好(圖1(b));當(dāng)濃度≤1.0 mg/L時,芽細(xì)小,葉片淡綠色且生長緩慢(圖1(a));當(dāng)濃度為≥3.0 mg/L時,會導(dǎo)致葉片發(fā)黃甚至褐化死亡(圖1(c))。本研究結(jié)果表明,絲瓜絡(luò)提取物濃度為2.0 mg/L時,是誘導(dǎo)芽的最佳濃度。

圖1 絲瓜絡(luò)提取物不同濃度對羅漢果芽誘導(dǎo)的影響

表2 不同絲瓜絡(luò)提取物濃度對芽誘導(dǎo)的影響

2.3 不同激素對羅漢果芽增殖的影響

切取誘導(dǎo)出來的新芽苗接種到繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)。從表3得出,絲瓜絡(luò)提取物、NAA濃度均影響新生芽個數(shù),當(dāng)絲瓜絡(luò)提取物濃度相同時,培養(yǎng)基中NAA的濃度影響芽苗的增殖能力,NAA濃度為0.08 mg/L時,芽增值率較低(圖2(a));NAA濃度為0.12 mg/L時,容易分化產(chǎn)生愈傷組織(圖2(c))。本研究結(jié)果表明,MS+絲瓜絡(luò)提取物1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L時,新生芽個數(shù)最多,芽莖粗壯,葉片大且綠,是誘導(dǎo)芽增殖的最佳培養(yǎng)基,如圖2(b)所示。

圖2 不同濃度NAA對芽增值的影響

表3 不同絲瓜絡(luò)提取物濃度和植物激素對芽增值的影響

2.4 不同激素對羅漢果生根培養(yǎng)的影響

將繼代培養(yǎng)后長勢比較好的羅漢果芽苗接種到生根培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3～4周。從表4得出,羅漢果的生根率都會受到生長素IBA和NAA的影響,當(dāng)IBA(NAA)濃度相同時,隨著NAA(IBA)濃度的增加,根誘導(dǎo)率先增加后減少,當(dāng)IBA和NAA濃度均為0.1mg/L時根誘導(dǎo)率高達(dá)93%,且主根較粗,苗長勢較好,具體表現(xiàn)如圖3。所以優(yōu)化出的最佳生根培養(yǎng)基是1/2 MS+ 0.1 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA。

圖3 不同植物激素組合對羅漢果生根的影響

表4 不同激素對羅漢果生根的影響

2.5 不同基質(zhì)對羅漢果組培苗煉苗的影響

所述幾種基質(zhì)組合對羅漢果組培苗生長的影響不同。適應(yīng)4周后,結(jié)果如表5。由表5可知,大部分組培苗長勢較好,其中以組合B的基質(zhì)配比為最好,成活率高達(dá)100%,苗的莖葉由嫩綠變深綠,且比較健壯。由此可見,珍珠巖+蛭石+苔蘚的基質(zhì)組合可以同時起到較好的疏水、保水及透氣的作用,有助于羅漢果組培苗的生長,煉苗過程如圖4。

圖4 煉苗的過程

表5 不同基質(zhì)組合對組培苗煉苗移栽成活率及生長的影響

3 討論

植物組織培養(yǎng)可以保持母本的優(yōu)良性狀,縮短繁殖周期,提高繁殖效率,而前期外植體消毒是影響成活率的關(guān)鍵因素。本試驗中,先用0.05%的高錳酸鉀溶液浸泡25 min進(jìn)行初步消毒,0.1%氯化汞處理時間6 min,乙醇處理時間30 s時,污染率最高,說明滅菌時間短導(dǎo)致滅菌不徹底;而當(dāng)0.1%氯化汞處理時間為10 min時,乙醇處理時間為60 s時,污染率達(dá)最低,但成活率也最低,說明滅菌時間過長對外植體內(nèi)部組織造成了一定傷害;當(dāng)0.1%氯化汞處理時間為8 min,乙醇處理時間為30 s時,成活率最高;成活率與0.1%氯化汞處理時間呈先上升后下降的趨勢,整體趨勢與唐凝[7]試驗結(jié)果相同,唐凝發(fā)現(xiàn)用0.1% 氯化汞處理6 min時,成活率最高,達(dá)85%,與本試驗結(jié)果不一致,可能與外植體的幼嫩程度相關(guān)。

細(xì)胞分裂素在組織培養(yǎng)中可以有效促進(jìn)細(xì)胞分化、分裂、形成不定芽,對不定芽的誘導(dǎo)和發(fā)育起重要作用[9]。本試驗前期嘗試過用6-BA進(jìn)行羅漢果的芽誘導(dǎo)及芽增值,但發(fā)現(xiàn)效果不如絲瓜絡(luò)提取物,故本試驗采用絲瓜絡(luò)提取物進(jìn)行芽誘導(dǎo)及增值試驗。絲瓜絡(luò)為葫蘆科植物絲瓜的干燥成熟果實的維管束,為多孔結(jié)構(gòu),通常用作洗碗或者中藥,本實驗創(chuàng)造性的將絲瓜絡(luò)提取物用于羅漢果組培育苗,發(fā)現(xiàn)絲瓜絡(luò)提取物對羅漢果芽誘導(dǎo)、芽增殖具有很好的促進(jìn)作用,能夠在短時間內(nèi)培育出更優(yōu)質(zhì)的種苗,對于羅漢果離體再生培育體系具有重要意義。植物激素配比可以有效提高不定芽的增殖效率[9],低濃度的NAA可以促進(jìn)不定芽的生長。本試驗中,采用不同濃度的NAA和絲瓜絡(luò)提取物進(jìn)行配比,研究結(jié)果表明,MS+1.0 mg/L絲瓜絡(luò)提取物+ 0.1 mg/L NAA時,芽的增殖系數(shù)最高,為芽增殖培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基。

此外,本試驗中,通過芽增殖培養(yǎng)的芽苗在1/2 MS+1.0 mg/L IBA +1.0 mg/L NAA +0.2 mg/L碳粉的培養(yǎng)基中生根率較高,達(dá)93%。生根苗在不同種類及配比的基質(zhì)中生長狀況不一樣,本試驗中絕大多數(shù)組培苗生長狀況良好,其中以組合B的基質(zhì)配比為最好,成活率最高,苗的莖葉顏色加深,且比較健壯。由此可見,珍珠巖+蛭石+苔蘚的基質(zhì)組合可以同時起到較好的疏水、保水及透氣的作用,有助于羅漢果組培苗的生長,且移栽前在溫室煉苗3～5 d有助于提高組培苗移栽后的成活率。

4 結(jié)論

本試驗以青皮羅漢果莖段作為外植體,用0.05%的高錳酸鉀溶液浸泡消毒25 min,0.1%的升汞消毒8 min,75%的乙醇消毒30 s,成活率達(dá)81%;此外,篩選出最佳芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L絲瓜絡(luò)提取物濃度,誘導(dǎo)率達(dá)到92%;篩選出芽增值最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L絲瓜絡(luò)提取物濃度+0.1 mg/L NAA,增殖系數(shù)達(dá)2.43;生根培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA+0.2 mg/L碳粉,生根數(shù)在5～9條之間,生根率高達(dá)93%;最佳煉苗基質(zhì)組成為:蛭石∶珍珠巖∶苔蘚體積比=2∶1∶1,移栽成活率達(dá)100%。

本試驗的目的是提供一種羅漢果莖段的組培快速育苗方法,利用本試驗方法可快速獲得羅漢果優(yōu)質(zhì)種苗,解決羅漢果傳統(tǒng)育苗受到合格繁殖材料的限制問題,同時為貴州羅漢果產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支撐。