胡玉潔,杜富強,謝軍麗,龔小見,李 玲,馬江雄,李 棟,湯 瑾,黃 健,范東生▲

(1貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,貴州 貴陽 550025;2貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部,貴州 貴陽 550001;3貴州威門藥業(yè)股份有限公司,貴州 貴陽 550018;4貴州師范大學(xué) 貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護重點實驗室,貴州 貴陽 550001)

胡椒屬Piper約有2000多種植物,多為灌木或攀援藤本植物,少為草本或小喬木,分布于泛熱帶地區(qū)[1-2]。我國有60余種胡椒屬植物,主要分布于我國臺灣省以及我國東南至西南部各省[3],約20種有藥用價值,具有祛風(fēng)、除濕、散寒、止痛、活血、舒筋等功效,主要用于治療風(fēng)寒濕痹、跌打損傷、風(fēng)寒咳嗽、脘腹冷痛、牙痛等病癥[4]。

石南藤Piper.wallichii(Miq.)Hand.-Mazz為胡椒屬植物,地上部分為藥用部位,作為民族藥石南藤藥材基原植物之一,收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》(2019版),具有袪風(fēng)通絡(luò)、補腎壯陽、止咳平喘、活血止痛的功效;用于治療風(fēng)寒濕痹、腰膝酸痛、陽痿、咳嗽氣喘、痛經(jīng)、跌撲腫痛[5]。石南藤化學(xué)成分復(fù)雜多樣,包括木脂素、新木脂素、生物堿和有機酸等[6-7]。毛山蒟Piper.martiniiC.DC.與石南藤非常相似,僅在于葉、雄花序長、總花梗長等稍有不同而已[8],但《中國植物志》英文版已將其并于石南藤中[9]。在貴州少數(shù)民族地區(qū),同屬植物小葉爬崖香Piper.sintenenseHatusima也被用作石南藤,具有祛風(fēng)除濕、散寒止痛、活血舒筋的功效;主要用于治療風(fēng)寒濕痹、脘腹冷痛、扭挫傷、牙痛、風(fēng)疹[10]。小葉爬崖香與石南藤在性狀方面有一定差異性,但未見對顯微鑒別和薄層色譜鑒別研究的報道。本文通過對石南藤和小葉爬崖香莖、葉切片和粉末顯微特征及薄層色譜方法進行研究,期望為二者的準確和快速鑒定提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LaiKaDMi1顯微鏡(萊卡顯微系統(tǒng)(上海)有限公司),稀甘油(分析純,西隴科學(xué)股份有限公司),硅膠GF254薄層色譜(青島海洋化工),暗箱三用紫外線分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)。

1.2 試劑

水合氯醛(分析純,阿拉丁上海有限公司),間苯三酚(分析純,上海源葉生物科技有限公司),濃鹽酸(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司),FAA固定液(每100 mL含福爾馬林5 mL、冰醋酸5 mL、70%乙醇90 mL),無水乙醇(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司),甲醇(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司),正己烷(分析純,天津市致遠化學(xué)試劑有限公司),乙酸乙酯(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司),丙酮(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司),實驗室制備futoquinol(純度>95%)。

1.3 藥材

本實驗所用藥材采集于貴州遵義、赤水和都勻等地,經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院魏升華教授鑒定為石南藤Piperwallichii(Miq.)Hand.-Mazz、毛山蒟PipermartiniiC.DC和小葉爬崖香Piper.sintenenseHatusima的干燥藤莖(表1)。

表1 不同產(chǎn)地胡椒屬植物來源信息表

2 實驗方法

2.1 石蠟切片

取莖、葉切成一定規(guī)格進行固定,按常規(guī)石蠟切片法(取材、固定、洗滌和脫水、透明、浸蠟、包埋、切片與粘片、脫蠟、染色、脫水、透明、封片),制作石蠟切片,置顯微鏡下觀察并描述各植物莖和葉組織特征[11-12]。

2.2 粉末鑒別

莖、葉粉碎,過5號篩,分別取少許置于載玻片上,以稀甘油直接制成裝片,加2～3滴水合氯醛加熱透化,制作莖、葉的粉末片,置于顯微鏡下觀察拍攝及圖像處理[12]。

2.3 薄層色譜鑒別

取樣品粉末1 g,加無水乙醇50 mL,超聲提取30 min,過濾,濾液蒸干,殘渣加5 mL甲醇完全溶解,作為供試品溶液。另取futoquinol對照品2 mg,加5 mL甲醇使溶解,作為對照品溶液。按照薄層色譜法(通則0502)試驗,分別吸取上述溶液1 mL,分別點于同一GF254薄層板上,以正己烷-乙酸乙酯-丙酮(8∶2∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,再噴以5%硫酸乙醇顯色劑,加熱至斑點顯色清晰,置日光下檢視。

3 結(jié)果

3.1 莖葉石蠟切片顯微鑒別

3.1.1 莖石蠟切片顯微特征

石南藤莖橫切面:表皮細胞1列,類圓形,緊密排列;皮層較厚,皮層內(nèi)無纖維;薄壁細胞大小差異明顯,類圓形或多角形,排列緊密,不規(guī)則;外韌型維管束12～14個,外側(cè)有半月形韌皮纖維,與束間石細胞群連接成環(huán),木質(zhì)部較小;髓部較寬,環(huán)髓纖維連接成環(huán),髓內(nèi)有維管束4～6個散在(圖1中A和B)。

圖1 莖橫切面顯微特征

毛山蒟莖橫切面:表皮細胞1列,類圓形,緊密排列;皮層較厚含纖維,薄壁細胞大小差異明顯,類圓形或多角形,排列緊密,不規(guī)則;韌皮部韌皮纖維較窄,與束間石細胞群連接呈環(huán);木質(zhì)部較寬大,導(dǎo)管多;外韌型維管束17～19個;髓部較窄,環(huán)髓纖維連接成環(huán),髓內(nèi)有維管束5～6個散在(圖1中C和D)。

小葉爬崖香橫切面:表皮細胞1列,類圓形,緊密排列,皮層較厚含纖維,薄壁細胞大小差異明顯,類圓形或多角形,排列緊密,不規(guī)則;皮層較窄;外韌型維管束23～26個,韌皮纖維與束間石細胞群連接呈環(huán);木質(zhì)部較窄;髓部較寬,約占1/2以上,環(huán)髓纖維連接成環(huán),髓內(nèi)有維管束8～11個散在,髓維管束大小差異明顯(圖1中E)。

3.1.2 葉石蠟切片顯微特征

石南藤葉表皮特征:葉表皮細胞存在大量非腺毛,非腺毛數(shù)量多,較短稍彎曲,壁薄(圖2中A-C)。

圖2 植物葉表皮顯微圖

毛山蒟葉表皮特征:葉表皮細胞含大量腺鱗;非腺毛多,長而彎曲,壁薄,分散,多數(shù)呈上尖下寬、基部稍圓的特征(圖2中D-F)。

小葉爬崖香葉表皮特征:葉表皮細胞含腺鱗;非腺毛短而彎曲,壁厚,基部寬呈圓鋸齒狀(圖2中G和H)。

3.2 粉末顯微鑒別

3.2.1 莖粉末顯微鑒別

石南藤莖粉末顯微特征:粉末呈黃白色。薄壁細胞類方形,壁厚,壁孔明顯;淀粉粒單?；驈?fù)粒;導(dǎo)管類型多樣,常見螺紋、環(huán)紋、網(wǎng)紋、稀有具源紋孔導(dǎo)管;石細胞類方形或不規(guī)則形,壁厚,胞腔狹窄,孔溝明顯;多細胞非腺毛較少,多碎斷;纖維長梭形,多單個散在,壁厚,紋孔明顯,偶見晶鞘纖維(圖3A)。

圖3 莖粉末顯微鑒別圖

毛山蒟莖粉末顯微特征:粉末呈黃白色。薄壁細胞橢圓形,壁略厚,壁孔清晰;淀粉粒多為復(fù)粒;導(dǎo)管類型較多,以螺紋導(dǎo)管為主;石細胞短柱形,壁厚,胞腔較大;纖維多單個散在;多細胞非腺毛多碎斷(圖3B)。

小葉爬崖香莖粉末顯微特征:粉末呈黃白色。薄壁細胞類方形,壁厚;淀粉粒多且多為單粒;導(dǎo)管以螺紋、環(huán)紋為主,偶見網(wǎng)紋;石細胞形態(tài)各異,壁厚;纖維束多單個散在,細長或呈規(guī)則長方形,壁薄;單細胞非腺毛多碎斷(圖3C)。

3.2.2 葉粉末顯微鑒別

石南藤葉粉末特征:粉末呈黃褐色。薄壁細胞橢圓形,孔壁清晰;草酸鈣方晶散在;淀粉粒單?；驈?fù)粒;螺紋、環(huán)紋、網(wǎng)紋導(dǎo)管散在;表皮細胞多邊形緊密排列,不定式氣孔;石細胞短柱形,壁較厚;多細胞非腺毛多碎斷,纖維聚集,細長壁厚(圖4A)。

圖4 植物葉粉末顯微鑒別圖

毛山蒟葉粉末特征:粉末呈黃褐色。薄壁細胞類圓形,壁孔少;含草酸鈣方晶和針晶,針晶數(shù)量多,成團或散在;淀粉粒多為復(fù)粒,偶見單粒淀粉粒散在;導(dǎo)管以螺紋、環(huán)紋為主;表皮細胞多邊形緊密排列,不定式氣孔,周圍有棕色塊集中;石細胞不規(guī)則型,數(shù)量少,非腺毛碎斷,纖維多聚集,較細長壁厚(圖4B)。

小葉爬崖香葉粉末特征:粉末呈黃褐色。薄壁細胞類圓形;草酸鈣方晶散在;淀粉粒大量存在且多為單粒;導(dǎo)管較發(fā)達,具螺紋、環(huán)紋、網(wǎng)紋導(dǎo)管;表皮細胞多邊形緊密排列,不定式氣孔;石細胞長柱型,壁較厚;非腺毛完整,較小;纖維束多單個散在,較細長壁厚略卷曲(圖4C)。

3.3 薄層色譜鑒別

石南藤和毛山蒟在與futoquinol對照品色譜相應(yīng)位置上顯相同的紫色斑點,而小葉爬崖香在該位置上未見紫色斑點(圖5)。

圖5 薄層色譜圖

4 結(jié)論

石南藤和小葉爬崖香不僅在葉、花和果實等方面有一定的差別[13-14],本研究還發(fā)現(xiàn)二者在莖、葉顯微結(jié)構(gòu)有明顯差別,如石南藤莖中髓維管束較少,大小均一,淀粉粒為單粒或復(fù)粒,非腺毛為多細胞非腺毛;而小葉爬崖香髓維管束較多,大小不等,淀粉粒多為單粒,非腺毛為單細胞非腺毛。建立了以futoquinol為對照品定容石南藤和小葉爬崖香薄層色譜鑒別方法,按照《中國藥典》2010年版四部要求對方法的耐用性進行驗證,方法重復(fù)性較好,此方法可有效的區(qū)分二者,為石南藤和小葉爬崖香的快速鑒別提供科學(xué)依據(jù)。