李小讓,葉世蕓▲,韓惠超,李向東

(1貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州 貴陽 550002;2貴州得軒堂護(hù)康藥業(yè)股份有限公司,貴州 貴陽 550008)

五味消毒飲記載于清代《醫(yī)宗金鑒》,具有清熱解毒,消腫散結(jié)的功效,現(xiàn)收錄為《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》第96號方劑[1],由金銀花、蒲公英、野菊花、紫花地丁、天葵子5味中藥組成,均具有抗菌消炎的功效[2-6]。在配方上,金銀花性寒味甘,氣味芳香,能清熱解表,又可解血分熱毒,是治療瘡瘍的要藥,為君藥。野菊花味辛、苦,性微寒,能清熱瀉火,有較強(qiáng)的消腫止痛作用,是臣藥。蒲公英不僅能清火熱,還能泄降滯氣,是清熱解毒、消癰散結(jié)的佳品;紫花地丁苦辛,寒能清熱,故清熱解毒、消癰散結(jié)用于紅腫熱痛;天葵子苦辛,具有清解熱毒、消癰散結(jié)、利尿通淋的功效,后三者為輔藥。這五味藥組合在一起,可以凈化氣血,三焦同治,疏通中下焦,打通三焦熱結(jié),緩解濕氣和腫脹。臨床上常應(yīng)用于五官、內(nèi)科、外科、婦科等火毒濕熱所致的多種全身感染性疾病的治療[7-9]。五味消毒飲作為經(jīng)典名方開發(fā)的對象之一,目前關(guān)于其文獻(xiàn)報道多見臨床研究,其化學(xué)成分的分析[10]及成分含量測定[11],尚無該物質(zhì)基準(zhǔn)量值傳遞的研究,制約了其開發(fā)。

物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量研究是經(jīng)典名方開發(fā)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[12],因此本研究在前期研究優(yōu)化的煎提工藝基礎(chǔ)上,制備15批五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉,對其特征圖譜、出膏率、水分、指標(biāo)性成分含量進(jìn)行測定,進(jìn)行飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)量值傳遞的研究,為經(jīng)典名方五味消毒飲復(fù)方制劑的開發(fā)和質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

多功能煎藥機(jī)(型號:JYH-B30M3;小熊電器股份有限公司);高效液相色譜儀(e2695,美國沃特世公司);超聲波清洗儀(型號:ModeL9960D;天津科貝爾公司);電子分析天平(型號:AUW120D;日本島津);冷凍干燥機(jī)(FD-1A-5O;北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2 試藥

綠原酸對照品(批號20051641),異綠原酸-A對照品(批號21032702),蒙花苷對照品(批號20041501),異綠原酸-C對照品(批號20112402),木犀草苷對照品(批號20060803),秦皮乙素對照品(批號10103001),均購于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司;異綠原酸-B對照品(批號DST210823-037),隱綠原酸對照品(批號DST210427-035),新綠原酸對照品(批號DSTDX001503),均購于成都德思特科技開發(fā)有限公司。娃哈哈純凈水。甲醇、冰醋酸均為色譜純。

五味消毒飲中五味藥材均采購于道地產(chǎn)區(qū)及主產(chǎn)區(qū),見表1,經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定,均與2020版《中國藥典》記錄品種一致,五味藥材炮制方法與現(xiàn)代2020版《中國藥典》炮制方法基本一致[13],均符合藥典的相關(guān)規(guī)定。

表1 五味消毒飲飲片信息

2 方法與結(jié)果

2.1 五味消毒飲15批物質(zhì)基準(zhǔn)的制備及出膏率的測定

15批五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn)及對應(yīng)飲片批次片進(jìn)行Rand函數(shù)隨機(jī)排列,如表2所示。稱取金銀花11.19 g,蒲公英4.48 g,野菊花4.48 g,紫花地丁4.48 g,天葵子4.48 g,置于電煎藥壺中,加水400 mL,浸泡30 min,文火煎煮約20 min,加入黃酒100 mL,武火煎煮5 min,趁熱過300目篩,藥渣同上述方法再次進(jìn)行煎煮,合并兩次濾液,定容至720 mL。將其置于-80 ℃預(yù)凍12 h,冷凍干燥72 h,即得五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉。

表2 五味消毒飲15批物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)飲片批次

稱重計(jì)算出膏率,根據(jù)公式計(jì)算煎液的出膏率[出膏率(%)=總粉量/總飲片量×100%],照2020年版《中國藥典》四部水分測定法(通則0832第二法)測定15批五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實(shí)物的水分[水分(%)=凍干粉中含水量/凍干粉總重×100%],見表3。

表3 15批物質(zhì)基準(zhǔn)的出膏率及水分

結(jié)果顯示,15批次五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉的出膏率在58.74%～63.75%之間,其均值為50.94%,均未出現(xiàn)離散數(shù)據(jù)(平均值的70%～130%外),15批次出膏率均在此范圍內(nèi),沒有出現(xiàn)較大偏差,暫定五味消毒飲出膏率范圍應(yīng)在35.66%～66.22%。15批五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉的水分范圍13.11%～16.96%之間,水分的均值為14.70%,均未出現(xiàn)離散數(shù)據(jù)(平均值的70%～130%外),暫定五味消毒飲水分范圍10.29%～19.11%。

2.2 五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜方法的建立

2.2.1 色譜條件

Waters2695色譜柱(磚石-C18),流動相甲醇(A)-0.5%醋酸水(B),梯度洗脫(0～10 min,10%～32%A,90%～68%B;10～21 min,32%A,68%B;21～25 min,32%～46%A,68%～54%B;25～31 min,46%～48%A,54%～52%B;31～43 min,48%～80%A,52%～20%B;43～45 min,80%～10%A;20%～90%B;45～55 min,10%A;90%B),流速1 mL·min-1,檢測波長為320 nm,柱溫25 ℃,進(jìn)樣體積10 μL。

2.2.2 供試品溶液的制備

五味消毒飲基準(zhǔn)樣品供試溶液:取五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉0.25 g,加10 mL 50%甲醇,超聲30 min,冷卻,定容,離心(10000 r·min-1)15 min,取上清液過0.45 μm微孔濾膜,即得。

陰性供試品溶液:分別取未加入金銀花、蒲公英、野菊花、紫花地丁、天葵子的五種物質(zhì)基準(zhǔn),按上述供試品溶液制備方法,即得。

2.2.3 對照品溶液的制備

取對照品適量,加甲醇分別配制成綠原酸1.90 mg·mL-1、木犀草苷0.09 mg·mL-1、異綠原酸-A 0.43 mg·mL-1、異綠原酸-B 0.29 mg·mL-1、異綠原酸-C 0.40 mg·mL-1、秦皮乙素0.30 mg·mL-1、蒙花苷0.10 mg·mL-1、新綠原酸0.07 mg·mL-1、隱綠原酸0.10 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.4 經(jīng)典名方溫經(jīng)湯指紋圖譜方法學(xué)考察

2.2.4.1 精密度考察

取五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn)供試品溶液1份,按2.2.1項(xiàng)下色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣6次,隱綠原酸(4號峰)面積最大且分離度好,為參照峰,得出各共有峰相對保留時間和相對峰面積。特征峰相對保留時間RSD值在0.00%～0.60%之間,相對峰面積RSD值在0.00%～2.75%之間,表明儀器精密度良好。

2.2.4.2 重現(xiàn)性考察

取五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn)供試品溶液1份,平行進(jìn)樣6次,特征峰相對保留時間RSD值在0.00%～0.43%之間,相對峰面積RSD值在0.00%～2.43%之間,表明方法的重復(fù)性良好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性考察

取五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn)供試品溶液1份,分別在0 h、2 h、4 h、8 h、10 h、12 h、24 h進(jìn)行測定,特征峰相對保留時間RSD值在0.00%～1.07%之間,相對峰面積RSD值在0.00%～2.89%之間,說明待測樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 15批五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn)的指紋圖譜考察

2.2.5.1 指紋圖譜研究

將15批五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn)指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012版),以S1色譜圖為參照圖譜,采用中位數(shù)法,Mark峰匹配后生成對照圖譜。15批五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜疊加圖見圖1,相似度見表4,從結(jié)果可知,15批五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn)的特征圖譜相似度分別為0.998、0.999、1.000、1.000、1.000、1.000、0.999、0.999、1.000、1.000、0.993、1.000、1.000、0.999、0.999,均大于0.9,表明相似度良好,表明五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn)的制備工藝穩(wěn)定,不同批次間的差異較小,見表4。

表4 15批五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn)指紋圖譜相似度

2.2.5.2 指紋圖譜的峰歸屬

在320 nm波長下,確定10個共有峰,根據(jù)對照品指認(rèn)出9個色譜峰,分別是1號峰(新綠原酸)來自金銀花、野菊花;2號峰(秦皮乙素)來自紫花地丁;3號峰(綠原酸)來自金銀花、蒲公英、野菊花;4號峰(隱綠原酸)、5號峰(木犀草苷)、6號峰(異綠原酸-A)、7號峰(異綠原酸-B)、8號峰(異綠原酸-C),均來自金銀花、野菊花;9號峰(蒙花苷)來自野菊花,見圖2和圖3。

圖2 混合對照品圖譜與五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn)HPLC圖譜

注:1.金銀花陰性;2.紫花地丁陰性;3.野菊花陰性;4.蒲公英陰性;5.金銀花單煎;6.蒲公英單煎;7.野菊花單煎;8.紫花地丁單煎;9.天葵子單煎;10.五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn);11.天葵子陰性。

2.2.6 五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn)指標(biāo)性成分的含量測定

2.2.6.1 色譜條件

同“2.2.1”項(xiàng)。

2.2.6.2 供試品溶液的制備

同“2.2.2”項(xiàng)。

2.2.6.3 線性關(guān)系考察

取混合對照品儲備液適量,加甲醇配制成不同質(zhì)量濃度的對照品溶液。綠原酸質(zhì)量濃度為1.90 mg·mL-1、0.95 mg·mL-1、0.475 mg·mL-1、0.2375 mg·mL-1、0.11875 mg·mL-1、0.059375 mg·mL-1,隱綠原酸質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.025 mg·mL-1、0.0125 mg·mL-1、0.00625 mg·mL-1、0.003125 mg·mL-1,木犀草苷質(zhì)量濃度為0.09 mg·mL-1、0.045 mg·mL-1、0.0225 mg·mL-1、0.01125 mg·mL-1、0.005625 mg·mL-1、0.0028125 mg·mL-1,異綠原酸-A質(zhì)量濃度為0.43 mg·mL-1、0.215 mg·mL-1、0.1075 mg·mL-1、0.05375 mg·mL-1、0.026875 mg·mL-1、0.0134375 mg·mL-1,異綠原酸-B質(zhì)量濃度為0.29 mg·mL-1、0.145 mg·mL-1、0.0725 mg·mL-1、0.03125 mg·mL-1、0.015625 mg·mL-1、0.0078125 mg·mL-1,異綠原酸-C質(zhì)量濃度為0.4 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.025 mg·mL-1、0.0125 mg·mL-1,蒙花苷質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.025 mg·mL-1、0.0125 mg·mL-1、0.00625 mg·mL-1、0.003125 mg·mL-1,新綠原酸質(zhì)量濃度為0.32 mg·mL-1、0.16 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.01 mg·mL-1,秦皮乙素質(zhì)量濃度為0.3 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1、0.075 mg·mL-1、0.0375 mg·mL-1、0.01875 mg·mL-1、0.009375 mg·mL-1的一系列線性對照品溶液。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),9種指標(biāo)性成分峰面積為縱坐標(biāo),得到9種待測成分的回歸方程以及相關(guān)系數(shù)值,見表5。

表5 含量測定方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.6.4 精密度考察

取五味消毒飲凍干粉樣品,按“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液,同“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件,分別連續(xù)進(jìn)樣測定6次,結(jié)果顯示9種待測成分峰面積RSD值在0.33%～2.73%之間(表5),表明儀器精密度良好。

2.2.6.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取五味消毒飲凍干粉樣品,制備6份供試品溶液,按“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液,同“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件下測定,結(jié)果顯示9種待測成分的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值在0.52%～1.67%(表5),表明方法重復(fù)性良好。

2.2.6.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取五味消毒飲凍干粉樣品,按“2.2.2”制備供試品溶液,同“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件,分別于室溫條件下放置0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h后分別測定,結(jié)果顯示9種待測成分的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值在0.8%～2.89%之間(表5),溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6.7 加樣回收率考察

取五味消毒飲凍干粉樣品6份,按“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液,按比例加入對照品適量,進(jìn)樣測定,計(jì)算9種待測成分的加樣回收率,回收率結(jié)果均符合2020版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn),結(jié)果顯示9種待測成分的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值在0.35%～2.87%之間(表5),表明方法重復(fù)性良好。

2.2.7 15批物質(zhì)基準(zhǔn)指標(biāo)成分含量的測定及量值傳遞關(guān)系研究

2.2.7.1 指標(biāo)成分含量的測定

按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件將基準(zhǔn)樣品進(jìn)樣,計(jì)算樣品中綠原酸、木犀草苷、異綠原酸-A、異綠原酸-B、異綠原酸-C、秦皮乙素、蒙花苷、新綠原酸、隱綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù),各批次指標(biāo)性成分含量測定結(jié)果見表6。

表6 15批五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn)中指標(biāo)成分含量(mg/g)

2.2.7.2 指標(biāo)成分含量的量值傳遞關(guān)系研究

紫花地丁、野菊花飲片中秦皮乙素、蒙花苷含量的測定按照《中華共和國人民藥典》記載的方法。根據(jù)指標(biāo)性成分秦皮乙素、蒙花苷及對應(yīng)批次飲片的含量測定結(jié)果,進(jìn)行轉(zhuǎn)移率計(jì)算,按照以下公式計(jì)算,飲片到物質(zhì)基準(zhǔn)的轉(zhuǎn)移率=物質(zhì)基準(zhǔn)中指標(biāo)成分總量/飲片中指標(biāo)成分總量。

結(jié)果見表7,經(jīng)計(jì)算2個測定指標(biāo)的轉(zhuǎn)移率均值依次為55.23%、11.79%。各個轉(zhuǎn)移率數(shù)值均未出現(xiàn)離散數(shù)據(jù),在均值70%～130%范圍內(nèi)。說明秦皮乙素、蒙花苷2種成分在物質(zhì)基準(zhǔn)制備過程中轉(zhuǎn)移率穩(wěn)定可控。

表7 15批五味消毒飲飲片指標(biāo)成分的含量及轉(zhuǎn)移率

3 討論

五味消毒飲原方記載為[14]:“金銀花三錢,野菊花、蒲公英、紫花地丁、紫背天葵子各一錢二分。水二盅,煎八分,加無灰酒半鐘,再滾二、三沸時熱服。渣,如法再煎服,被蓋出汗為度”。對其處方劑量進(jìn)行考證,明清時期,1兩約為37.3克的折算方法,1錢為3.73克[15]。參考國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布古代經(jīng)典名方關(guān)鍵信息表,清代的一盅為100 mL。故擬定處方為:金銀花11.19 g,蒲公英4.48 g,野菊花4.48 g,紫花地丁4.48 g,天葵子4.48 g。其中無灰酒,其色黃,甘而溫,和血良,為黃酒[16]。加入水和酒的量為200 mL、100 mL。

本研究在五味消毒飲藥材選擇方面均采購于道地產(chǎn)區(qū)及主產(chǎn)區(qū),并對15批次飲片按照2020版《中國藥典》進(jìn)行質(zhì)量檢查,均符合要求。前期實(shí)驗(yàn)以出膏率和有效成分的含量為指標(biāo),對浸泡時間、煎煮方式、煎煮時間、不同目數(shù)過濾方式進(jìn)行了考察,確定藥材浸泡時間為30 min;煎煮方式為電火;煎煮時間:五味消毒飲單方劑加水400 mL,煎至320 mL,加100 mL黃酒煎煮,電煎藥壺從400 mL煎煮至320 mL需文火20 min,對于“滾二三沸”暫定武火5 min;300目數(shù)的濾布過濾?？紤]到五味消毒飲的穩(wěn)定性,故五味消毒飲選擇冷凍干燥[17]。對供試品制備的超聲提取法的不同溶劑100%水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、100%甲醇進(jìn)行考察,得出50%甲醇作為提取溶劑時最佳。

本研究通過特征圖譜結(jié)合出膏率及指標(biāo)性成分含量進(jìn)行測定五味消毒飲的飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)的相關(guān)性及關(guān)鍵質(zhì)量屬性的傳遞性研究。結(jié)果表明:(1)特征圖譜顯示15批五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn)的相似度均大于0.9,相似度良好,表明五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn)的制備工藝穩(wěn)定,不同批次間的差異較小,可檢出10個色譜峰,并指認(rèn)出9個峰,其中7個特征峰來源于金銀花,8個特征峰來源于野菊花,1個特征峰來源于紫花地丁,1個特征峰來源于蒲公英。(2)出膏率顯示15批次五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉在58.73%～63.75%之間,其均值為50.94%,均未出現(xiàn)離散數(shù)據(jù)(平均值的70%～130%外),出膏率高可能與其提取溶劑黃酒有關(guān),黃酒作為中藥材的炮制加工品,是良好的有機(jī)溶媒,藥物的有效成分如脂類、揮發(fā)油、苷類及部分生物堿等易溶于其中,因此加黃酒提取所得的出膏率較高,同時可能與其本身的粘稠相關(guān)[18]。(3)秦皮乙素來自紫花地丁,蒙花苷來自野菊花,是2020版中國藥典規(guī)定的野菊花含量測定的指標(biāo)成分[19],因此將這兩個成分作為含量測定指標(biāo)成分探索五味消毒飲的量值轉(zhuǎn)移規(guī)律,飲片-物質(zhì)基準(zhǔn)的指標(biāo)性成分含量及轉(zhuǎn)移率結(jié)果顯示秦皮乙素、蒙花苷的轉(zhuǎn)移率分別為40.39%～76.45%,8.41%～16.44%,均值分別為55.23%,11.79%,在均值70%～130%范圍內(nèi),均未出現(xiàn)離散數(shù)據(jù)。但蒙花苷的轉(zhuǎn)移率較低,有研究報道[20-21],蒙花苷為熱不穩(wěn)定性成分,在制備五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn)的過程中采用電火加熱煎煮的方式制備,且煎煮時間較長,可能造成蒙花苷由飲片到物質(zhì)基準(zhǔn)的轉(zhuǎn)移率較低。

因此,15批五味消毒飲物質(zhì)基準(zhǔn)對應(yīng)實(shí)物(凍干粉)與標(biāo)準(zhǔn)煎液(按古籍記載制備)具有質(zhì)量一致性,具備可信度和科學(xué)性,可作為五味消毒飲復(fù)方制劑研發(fā)的質(zhì)量基準(zhǔn)物質(zhì)。提示在后續(xù)制劑開發(fā)的過程中需注意溫度和加熱時間對熱不穩(wěn)定成分的影響。