齊佳悅,李 妍,吳明達(dá),馮憲敏,萬(wàn) 朋,駱曉峰,朱文赫,呂士杰,謝 維,高俊濤

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院,吉林 吉林 132013 ; 2. 吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林 吉林 132013)

急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)是由多種因素(包括創(chuàng)傷、肺炎、休克和敗血癥等)引起的急性的、危及生命的疾病,是臨床上發(fā)病率和死亡率極高的疾病[1,2]。ALI的特點(diǎn)是過(guò)度的炎癥反應(yīng),中性粒細(xì)胞過(guò)度浸潤(rùn),肺組織釋放促炎細(xì)胞因子,肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞損傷,引起水腫和氣體交換異常[3-5]。引起ALI的一個(gè)主要原因是內(nèi)毒素血癥和細(xì)胞毒性途徑激活,導(dǎo)致急性呼吸窘迫,最終引發(fā)多器官功能障礙綜合征[6]。急性肺損傷通常較早發(fā)生并迅速發(fā)展,這是敗血癥患者最直接的死亡原因之一[7,8]。炎癥被認(rèn)為是急性肺損傷發(fā)生的誘因[9]。雖然環(huán)境低溫與呼吸道感染易感性之間的關(guān)系已被普遍接受,但環(huán)境低溫對(duì)肺部反應(yīng)性炎癥的影響,冷應(yīng)激與肺部炎癥嚴(yán)重程度之間的關(guān)系及其可能機(jī)制尚未得到充分研究。本試驗(yàn)旨在為冷暴露與肺功能的關(guān)系提供新的理論依據(jù),同時(shí)為抗低溫機(jī)制研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;Mouse IL-6 ELISA試劑盒和Mouse TNF-α ELISA試劑盒,均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;Anti-GAPDH抗體和Anti-TLR4抗體,均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;RAPI 組織和細(xì)胞裂解液,均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒,購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluorid,PVDF)膜,購(gòu)自美國(guó)Millpore公司。

1.2 主要儀器 電子天平,德國(guó)Sartorius公司產(chǎn)品;Pathological切片機(jī),德國(guó)孚光精儀有限公司產(chǎn)品;旋渦混勻器,中國(guó)常州恩培儀器制造有限公司產(chǎn)品;TGL-16M 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī),中國(guó)上海盧湘儀離心機(jī)廠產(chǎn)品;倒置顯微鏡,日本 OLYMPUS公司產(chǎn)品;化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng),中國(guó)上海勤翔科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和處理 選用40只清潔級(jí)健康BALB/c雄性小鼠[購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(吉)2017—0007],體重35～40 g,動(dòng)物試驗(yàn)經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):20170716)。將40只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Normal control group,N組)、LPS組(Lipopolysaccharide group,L組)、冷暴露組(Cold exposure group,C組)和冷暴露+LPS 組(Cold exposure+Lipopolysaccharide group,C+L組),每組10只,其中L組和C+L組小鼠按0.5 mg/(kg·bw)鼻滴LPS,NS組和C組鼻滴等體積無(wú)菌PBS溶液,滴鼻后將C組和L組小鼠置于室溫環(huán)境下,C組和C+L組小鼠置于(4±2)℃通風(fēng)冷室,6 h后檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4 支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中總蛋白濃度和白細(xì)胞數(shù)量檢測(cè) 將各組小鼠使用乙醚進(jìn)行麻醉,麻醉后的小鼠沿中線行氣管切開(kāi)術(shù),然后將1 mL無(wú)菌注射器與無(wú)菌槍頭連接(保持連接處密封),將500 mL PBS緩緩?fù)迫霘夤軆?nèi),然后吸出,連續(xù)重復(fù)操作3次,合并3次收集的BALF。收集的BALF于4 ℃、3 000 r/min離心5 min,取上清液。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)各組BALF上清液中的總蛋白濃度,具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟要求進(jìn)行。將剩余沉淀中加入200 mL 紅細(xì)胞裂解液,1 min后加入1 mL PBS,3 000 r/min離心3 min,棄上清(如果沉淀的紅色很明顯,可以重復(fù)以上操作),沉淀用 100 mL PBS重懸,取10 mL重懸液使用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)白細(xì)胞。

1.5 BALF中促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6含量檢測(cè) BALF上清液獲取方法同1.4,采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測(cè)定BALF中 TNF-α和IL-6含量,具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。

1.6 肺組織的濕干重比(Wet to dry weight ratio,W/D)檢測(cè) 取小鼠左肺并用濾紙吸干其表面水分,電子天平精確稱(chēng)重,記錄為濕重。然后將肺組織置于56 ℃烘箱中,3次稱(chēng)量恒重后,記錄為干重,計(jì)算肺組織W/D,用以反映肺組織的水腫程度。

1.7 肺組織的組織病理學(xué)觀察 肉眼觀察各組肺組織水腫和出血點(diǎn)等變化,取右肺中葉,置于4%中性甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋和切片,蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin,H.E.)染色,置于光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織的組織病理學(xué)變化。

1.8 肺組織中Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)蛋白表達(dá)量檢測(cè) 采用 Western blot法檢測(cè)小鼠肺組織中TLR4蛋白的相對(duì)表達(dá)量。于冰上取小鼠肺組織,剪碎后加入組織蛋白裂解液研磨,冰浴裂解 30 min,11 500 r/min(4 ℃,離心半徑12 cm)離心20 min,吸取上清蛋白液,BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取40 mg蛋白樣品經(jīng)12% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的吐溫-三羥甲基氨甲烷緩沖鹽溶液(Tris buffer saline with tween,TBST)封閉2 h,加入相應(yīng)一抗4 ℃孵育過(guò)夜。洗去多余一抗,將PVDF膜浸泡于辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的二抗孵育液中,37 ℃搖床孵育2 h。使用電化學(xué)發(fā)光(Enhanced chemiluminescence,ECL)底物液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影,通過(guò)Image-ProPlus測(cè)量蛋白條帶的光密度。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”方式表示。采用 SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,使用單因素方差分析法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠BALF中總蛋白濃度和白細(xì)胞數(shù)量比較 與N組比較,C組總蛋白濃度和白細(xì)胞數(shù)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),L組和C+L組總蛋白濃度和白細(xì)胞數(shù)量均極顯著升高(P<0.01);與C組比較,C+L組總蛋白濃度和白細(xì)胞數(shù)量均極顯著升高(P<0.01);與L組比較,C+L組總蛋白濃度和白細(xì)胞數(shù)量均明顯升高(P<0.05)(表1)。

2.2 各組小鼠BALF中TNF-α和IL-6含量比較 與N組比較,C組TNF-α和IL-6無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),L組和C+L組TNF-α和IL-6含量均極顯著升高(P<0.01);與C組比較,C+L組TNF-α和IL-6含量均極顯著升高(P<0.01);與L組比較,C+L組TNF-α和IL-6含量均明顯升高(P<0.05)(表2)。

表2 各組小鼠BALF中TNF-α和IL-6含量比較Table 2 Comparison of TNF-α and IL-6 level in BALF of mice in each group (pg/mL,n=10)

2.3 各組小鼠肺組織W/D比較 與N組比較,C組肺組織W/D無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),L組和C+L組肺組織W/D均明顯升高(P<0.05);與C組比較,C+L組肺組織W/D明顯升高(P<0.05);與L組比較,C+L組肺組織W/D明顯升高(P<0.05)(表3)。

表3 各組小鼠肺組織W/D比較Table 3 Comparison of lung W/D of mice in each group (n=10)

2.4 各組小鼠肺組織的組織病理學(xué)觀察 與N組比較,C組H.E.染色結(jié)果正常,兩者沒(méi)有明顯的差異,L組和C+L組肺組織發(fā)生組織病理學(xué)改變;與C組比較,C+L組出現(xiàn)了炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺水腫、肺泡出血和肺泡間隔增厚,肺泡結(jié)構(gòu)受損的情況;與L組比較,C+L組肺損傷更為嚴(yán)重(圖1)。

圖1 各組小鼠肺組織的組織病理學(xué)觀察(H.E.染色,200×)Fig.1 Histopathological observation of lung tissues of mice in each group(H.E.staining,200×)A:正常對(duì)照組; B:冷暴露組; C:LPS組; D:冷暴露+LPS組(a:炎性細(xì)胞浸潤(rùn); b:肺泡間隔增厚; c:肺水腫; d:肺泡出血)A:Normal control group; B:Cold exposure group; C:LPS group; D:Cold exposure+LPS group(a:Inflammatory cell infiltration; b:Alveolar septal thickening; c:Pulmonary edema; d:Alveolar hemorrhage)

2.5 各組小鼠肺組織中TLR4蛋白表達(dá)量比較 與N組比較,C組肺組織中TLR4蛋白表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),L組和C+L組肺組織中TLR4蛋白表達(dá)量均明顯升高(P<0.05);與C組比較,C+L組肺組織中TLR4蛋白表達(dá)量極顯著升高(P<0.01);與L組比較,C+L組肺組織中TLR4蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.05)(圖2和表4)。

圖2 各組小鼠肺組織TLR4蛋白表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of TLR4 protein in lung tissues of mice in each group

表4 各組小鼠肺組織TLR4蛋白表達(dá)量比較Table 4 Comparison of TLR4 protein expression in lung tissue of mice in each group (n=5)

3 討論

ALI可導(dǎo)致炎癥介質(zhì)大量合成和釋放,最終造成肺實(shí)質(zhì)性損傷。BALF中炎癥因子的水平,如TNF-α和IL-6等促炎因子的釋放,是評(píng)價(jià)肺部炎癥反應(yīng)程度的重要標(biāo)志[10,11]。TNF-α是ALI最重要的啟動(dòng)因子之一,能夠刺激肺組織中氧自由基和蛋白溶解酶的大量合成和釋放,并可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)聚集和粘附,導(dǎo)致肺泡和毛細(xì)血管損傷,故其可反映肺組織損傷的嚴(yán)重程度[12-14]。IL-6是強(qiáng)有力的促炎細(xì)胞因子,能夠放大肺部的炎癥反應(yīng)[15-17]。冷暴露會(huì)加重LPS誘導(dǎo)的肺損傷程度。

促炎反應(yīng)在急性肺損傷發(fā)生過(guò)程中的重要性毋庸置疑。LPS 誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生,如TNF-α和IL-6等表達(dá)水平的激增,這可能使得中性粒細(xì)胞滲入到肺組織中,啟動(dòng)局部炎癥反應(yīng)。肺泡-毛細(xì)血管屏障因中性粒細(xì)胞的過(guò)度積累遭到破壞,使得毛細(xì)血管的通透性增加,從而使富含蛋白質(zhì)的液體進(jìn)入支氣管血管周?chē)g質(zhì),導(dǎo)致肺水腫。另外,白細(xì)胞在急性肺損傷的發(fā)病過(guò)程中也起著尤為重要的作用,其能引發(fā)炎癥,參與形成肺損傷。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,小鼠BALF中總蛋白濃度、白細(xì)胞數(shù)量以及肺組織W/D在LPS刺激后顯著上升,其中C+LPS組上升更加顯著,肺組織H.E.染色的結(jié)果也驗(yàn)證了以上說(shuō)法,說(shuō)明冷暴露加重了小鼠肺損傷的程度。

ALI導(dǎo)致肺部發(fā)生炎癥期間,氣道上皮細(xì)胞(Airway epithelial cells,AECs)廣泛表達(dá)不同Toll樣受體,包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6(細(xì)胞外TLRs)以及TLR3、TLR7、TLR8和TLR9(細(xì)胞內(nèi)TLRs)[18-20],從而激活下游信號(hào)通路。其中,關(guān)于TLR4的研究結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果一致。本試驗(yàn)中,與正常對(duì)照組比較,LPS組TLR4蛋白表達(dá)量顯著增加;與LPS組比較,冷暴露+LPS組TLR4蛋白表達(dá)量顯著增加。組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,冷暴露組已經(jīng)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),LPS組出現(xiàn)肺泡間隔增厚和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),而冷暴露+LPS組中出現(xiàn)更為嚴(yán)重的肺泡間隔增厚和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),直至出現(xiàn)肺水腫和肺泡出血的嚴(yán)重病理改變,表明冷暴露加重了LPS誘導(dǎo)肺損傷的損傷程度。上述結(jié)果說(shuō)明,TLR4參與了ALI的發(fā)展過(guò)程,冷暴露可能通過(guò)TLR4信號(hào)通路了加重LPS誘導(dǎo)的小鼠肺損傷。

TLR4信號(hào)傳導(dǎo)與ALI產(chǎn)生的先天免疫和急性炎癥有關(guān)[21]。LPS作為一種有效的炎癥細(xì)胞毒性誘導(dǎo)劑,可能對(duì)包括心臟、肝臟、脾臟和肺臟在內(nèi)的器官造成很多損害[22,23]。研究表明,TLR4是參與LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子,其中TLR4作為L(zhǎng)PS受體在ALI的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起主要作用[24],可促使肺損傷進(jìn)一步加重。本試驗(yàn)中冷暴露加重了急性肺損傷的程度,而且提高了TLR4表達(dá),由此可見(jiàn),冷暴露加重LPS誘導(dǎo)的肺損傷程度與TLR信號(hào)通路密切相關(guān)。