謝丹瑩,謝景昊,黃若超,陸 鑫,楊 晨,郭 爽,李和平,王月影

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生化與營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450046 ; 2. 河南省動(dòng)物生長發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450046)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,Pa)又稱綠膿桿菌,廣泛存在于土壤、水、空氣、動(dòng)物和人類呼吸道和腸道內(nèi)。Pa是一種機(jī)會(huì)性人獸共患病的病原體,可引起家禽、家畜和寵物的各種急慢性感染,如燒傷感染、中耳炎、乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎、肺炎、尿路感染、腸炎、腦膜炎和囊性纖維化等,最終發(fā)展成致死性腹瀉、菌血癥和敗血癥等疾病[1-5],給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。Pa適宜在潮濕環(huán)境中生長,也是引起環(huán)境污染和嚴(yán)重醫(yī)院感染的常見病原體[6]。Pa還是一種重要的食源性病原菌,主要毒力因子是外毒素A(Pseudomonas exotoxin A,PEA)、脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)、內(nèi)毒素蛋白(Endotoxin protein,OEP)和蛋白分解酶等,可引起患者產(chǎn)生胃腸炎和神經(jīng)癥狀[7-9]。全球范圍內(nèi)耐藥銅綠假單胞菌的檢出率介于10%～28%[10-12]。由耐藥銅綠假單胞菌引起的感染性疾病的病死率高,治療困難,給臨床治療帶來了巨大挑戰(zhàn)。銅綠假單胞菌感染的治療方法主要為抗生素聯(lián)合支持治療,而抗生素長期大量使用可導(dǎo)致耐藥菌株日益增多,增加了臨床治療銅綠假單胞菌感染的難度[13]。因此,尋找新型方式代替抗生素治療已成為研究熱點(diǎn)。

噬菌體是感染細(xì)菌的一種病毒,具有宿主特異性高、安全性高和成本低等優(yōu)點(diǎn),是替代抗生素和細(xì)菌耐藥研究中的熱點(diǎn)之一[13]。其中,銅綠假單胞菌噬菌體制劑研發(fā)已成為控制耐藥銅綠假單胞菌感染性疾病的重要手段[14]。多項(xiàng)研究證明了噬菌體治療耐藥銅綠假單胞菌的可行性[15-17]。最新的研究表明,噬菌體能有效破壞銅綠假單胞菌的生物膜[18]。但是,噬菌體治療耐藥菌感染還面臨一些局限,如宿主菌血清型特異性、噬菌體抗性等問題[19]。本試驗(yàn)利用銅綠假單胞菌臨床分離株P(guān)A31為宿主菌,從水中分離鑒定了1株銅綠假單胞菌噬菌體,根據(jù)噬菌體分類和命名指南[20],將新分離的噬菌體命名為vB_PaeM_Ty,對其形態(tài)學(xué)、生化特性和基因組學(xué)方面進(jìn)行分析,為進(jìn)一步研究噬菌體治療銅綠假單胞菌感染提供理論依據(jù)和資源儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株 銅綠假單胞菌臨床分離株P(guān)A31由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物分子藥理毒理學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)劉建華教授饋贈(zèng),分離自家兔的肝臟組織。本實(shí)驗(yàn)室保存的銅綠假單胞菌(PA31)、大腸桿菌(Escherichiacoli,No. HM68-1、39、34、33、HM79-2)、沙門菌(Salmonella,No. SJ249、JS1A、SJ16L、SJ43、S、SJ15、SQ)和糞腸球菌(Enterococcusfaecalis,No. 8a、n22、5b、22a、SJ-9)的臨床分離株,用于噬菌體裂解譜分析。

1.3 主要儀器 透射電子顯微鏡(JEM-1400),日本電子株式會(huì)社產(chǎn)品;BIO RAD凝膠成像儀,上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司產(chǎn)品;核酸電泳儀,上海天能科技有限公司產(chǎn)品。

1.4 樣本處理 以銅綠假單胞菌臨床分離株P(guān)A31為宿主菌。多位點(diǎn)采集河南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園湖水20份。將采集的湖水混合,取混合液和LB肉湯混合,再加入宿主菌液,置于搖床振蕩培養(yǎng)過夜。冷凍離心后,取上清用0.22 μm濾膜過濾,得到初始噬菌體液。

1.5 噬菌體的分離純化 采用點(diǎn)滴法鑒定噬菌體。取600 μL 1×1010CFU/mL宿主菌液(OD600 nm=0.4)與10 mL半固體LB瓊脂培養(yǎng)基混勻,傾入LB瓊脂培養(yǎng)基上,滴加10 μL初始噬菌體液,37 ℃過夜培養(yǎng)。若形成透亮、清晰的噬菌斑,證明成功分離出噬菌體;反之,則無。根據(jù)參考文獻(xiàn)[21]報(bào)道的方法略作修改,采用雙層瓊脂平板法純化噬菌體。將初始噬菌體液倍比稀釋,分別取各梯度稀釋液100 μL與600 μL宿主菌液混合于離心管中,倒入10 mL半固體LB瓊脂培養(yǎng)基,混勻后傾入LB瓊脂培養(yǎng)基上,過夜培養(yǎng),直到形成透亮的噬菌斑。挑取單個(gè)噬菌斑于1 mL SM懸浮培養(yǎng)液中,5 000×g離心10 min,倍比稀釋后同上采用雙層瓊脂平板法純化5～7次,直到形成大小、形態(tài)一致的噬菌斑。根據(jù)最后一次純化結(jié)果,按公式(1)計(jì)算噬菌體的效價(jià)。

效價(jià)(PFU/mL)=噬斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×10

(1)

1.6 噬菌體的裂解譜分析 以 PA31和實(shí)驗(yàn)室保存的Escherichiacoli、Salmonella、Enterococcusfaecalis臨床分離株作為宿主菌,通過點(diǎn)滴法分析噬菌體的裂解譜。分別吸取400 μL菌液,加入10 mL半固體LB瓊脂培養(yǎng)基,上下顛倒2～3次后迅速倒入到LB瓊脂培養(yǎng)基,滴加8 μL噬菌體液,靜置15 min,然后37 ℃過夜培養(yǎng),觀察是否形成噬菌斑。

1.7 噬菌體的透射電鏡觀察 根據(jù)參考文獻(xiàn)[22]報(bào)道的方法濃縮噬菌體,取0.5 mL 1×1010CFU/mL宿主菌液(OD600 nm=0.4)和1 mL 1×1012PFU/mL的噬菌體液,放入搖床180 r/min振蕩培養(yǎng)至液體清亮。10 000×g離心10 min,取上清用0.22 μm濾膜過濾。加入DNase Ⅰ、RNase A和NaCl混勻冰浴1 h。8 000×g離心10 min,取上清,加入體質(zhì)比為10%的PEG 8000,4 ℃過夜培養(yǎng)。8 000×g 離心10 min,棄上清,加入SM懸浮培養(yǎng)液和等體積氯仿,5 000×g離心15 min,棄上清,得到的沉淀物即為濃縮后的噬菌體顆粒,送至河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,用2%磷鎢酸負(fù)染10 min,在透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 噬菌體生物學(xué)特性分析

問題3 一般地，一元二次方程ax2+bx+c=0(a≠0)的根與二次函數(shù)f(x)=ax2+bx+c(a≠0)的圖象有何聯(lián)系呢？

1.8.1 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection,MOI)測定 根據(jù)參考文獻(xiàn)[23]報(bào)道的方法略作修改。取100 μL 1×1010CFU/mL宿主菌液(OD600 nm=0.4),將噬菌體效價(jià)稀釋為108、109、1010、1011和1012PFU/mL,以MOI分別為0.01、0.1、1、10和100的比例將宿主菌液與噬菌體液混合,加入等體積的LB肉湯,恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)6 h,10 000×g 離心10 min,取上清用0.22 μm濾膜過濾,雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價(jià),以培養(yǎng)末期噬菌體效價(jià)最高的MOI為最佳MOI。

1.8.2 噬菌體的一步生長曲線繪制 將1×1010CFU/mL宿主菌液與1×1012PFU/mL噬菌體液按照最佳感染復(fù)數(shù)進(jìn)行配比,室溫孵育100 min,每隔10 min取樣,采用雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價(jià),以效價(jià)為縱坐標(biāo),培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制一步生長曲線,判斷潛伏期和裂解期,并按公式(2)計(jì)算裂解量。

裂解量(PFU/mL)=裂解末期噬菌體效價(jià)÷初始宿主菌液濃度

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1.8.3 溫度對噬菌體穩(wěn)定性的影響 將600 μL 1×1012PFU/mL噬菌體液置于不同溫度(45、60、70和90 ℃)中水浴1 h,在60 min內(nèi)每隔10 min取樣,采用雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價(jià),繪制溫度對噬菌體影響的曲線。

1.8.4 pH對噬菌體穩(wěn)定性的影響 取100 μL 1×1012PFU/mL噬菌體液與不同pH(pH=2～12)的SM懸浮培養(yǎng)液混合,37 ℃恒溫孵育1 h,采用雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價(jià),以pH為橫坐標(biāo),噬菌體效價(jià)為縱坐標(biāo),繪制pH對噬菌體影響的曲線。

1.9 噬菌體基因組提取和核酸類型鑒定 按照病毒DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作,將0.5 mL噬菌體液經(jīng)12 000×g離心5 min,棄掉沉淀,在上清中加入蛋白酶K、溶液V和無水乙醇,12 000×g離心2 min,棄掉上清液,沉淀加入漂洗液,12 000×g離心2 min,重復(fù)2次。最后沉淀加入洗脫液,靜置5 min,離心得到噬菌體的基因組。取60 μL噬菌體的基因組,平均分成3份,分別加入DNase Ⅰ、RNase A和Mung Bean Nuclease各2 μL,37 ℃處理1 h,用0.1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其核酸類型。

1.10 噬菌體的全基因組分析 將提取的噬菌體的全基因組送至派森諾生物科技有限公司進(jìn)行全基因組測序。利用Illumina NovaSeq平臺(tái)進(jìn)行測序,測序數(shù)據(jù)通過A5-MiSeq(https://arxiv.org/abs/1401.5130)和SPAdes(http://cab.spbu.ru/files/release3.12.0/manual.html)進(jìn)行拼接,通過GeneMarkS(http://topaz.gatech.edu/GeneMark/)預(yù)測基因組編碼的蛋白質(zhì)。Rfam數(shù)據(jù)庫(http://rfam.xfam.org/)預(yù)測非編碼RNA。采用Diamond軟件(http://github.com/bbuchfink/diamond)完成蛋白質(zhì)編碼基因的序列比對,在NCBI數(shù)據(jù)庫中用BLASTp對開放閱讀框(Open reading frames,ORFs)進(jìn)行功能注釋,利用SnapGene 4.24軟件進(jìn)行全基因組分析。將噬菌體全基因序列和主要衣殼蛋白基因序列在NCBI進(jìn)行對比,下載同源性較高的噬菌體基因組序列,用MEGA 11.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體的分離純化 以 PA31為宿主菌,分離得到1株銅綠假單胞菌噬菌體,在雙層瓊脂平板上形成圓形、清晰的噬菌斑,直徑為1～2 mm(圖1),效價(jià)為1×1012PFU/mL。

圖1 噬菌體的噬菌斑觀察Fig.1 Plaque observation of phages

2.2 噬菌體的裂解譜分析 噬菌體分離株對Pseudomonasaeruginosa、Escherichiacoli、Salmonella和Enterococcusfaecalis臨床分離株的裂解結(jié)果顯示,除宿主菌PA31和Escherichiacoli-39、Enterococcusfaecalis-8a菌株外,其他受試細(xì)菌平板上均未出現(xiàn)明顯清晰的噬菌斑(表1),表明分離的噬菌體具有較強(qiáng)的宿主特異性。

表1 噬菌體分離株的裂解譜Table 1 Lysis spectrum of isolated phage

2.3 噬菌體的透射電鏡觀察 透射電子顯微鏡觀察噬菌體的形態(tài),結(jié)果顯示,該噬菌體頭部呈類矩形狀,大小為50 nm×20 nm;尾部呈“尾鞘”樣結(jié)構(gòu),長度在100 nm左右(圖2),根據(jù)形態(tài)判斷該噬菌體為有尾病毒目(Caudovirales)、肌尾病毒科(Myoviridae),根據(jù)噬菌體分類和命名指南[20],將該噬菌體命名為vB_PaeM_Ty。

圖2 透射電鏡觀察噬菌體形態(tài)(150 000 ×)Fig.2 Observation of phage morphology by transmission electron microscope(150 000 ×)

2.4 vB_PaeM_Ty的最佳MOI 在MOI為1.0時(shí),vB_PaeM_Ty效價(jià)最高,達(dá)到1.32×1011PFU/mL;MOI為0.01時(shí),vB_PaeM_Ty效價(jià)最低,為1.00×109PFU/mL(表2)。因此,vB_PaeM_Ty的最佳MOI為1.0。

2.5 vB_PaeM_Ty的一步生長曲線 vB_PaeM_Ty的一步生長曲線見圖3,vB_PaeM_Ty與宿主菌孵育20 min內(nèi),噬菌體效價(jià)變化不明顯,之后隨時(shí)間延長效價(jià)開始逐漸升高,60 min時(shí)效價(jià)達(dá)到高峰,此時(shí)噬菌體效價(jià)為1.42×1012PFU/mL,隨后效價(jià)趨于穩(wěn)定。結(jié)果表明,噬菌體的潛伏期為20 min,裂解期為40 min,根據(jù)公式計(jì)算裂解量約為142 PFU/mL。

2.6 溫度對vB_PaeM_Ty穩(wěn)定性的影響 由圖4可知,不同溫度條件下,隨著時(shí)間的延長,vB_PaeM_Ty的效價(jià)均呈下降趨勢,而且溫度越高時(shí)vB_PaeM_Ty效價(jià)下降越快;在45、60和70 ℃靜置60 min,vB_PaeM_Ty活性較穩(wěn)定,90 ℃條件下隨培養(yǎng)時(shí)間延長噬菌體效價(jià)在逐漸下降,60 min時(shí)效價(jià)下降至3.0×102PFU/mL。結(jié)果表明,vB_PaeM_Ty對溫度的耐受能力較好。

圖4 溫度對vB_PaeM_Ty穩(wěn)定性的影響Fig.4 Influence of temperature on vB_PaeM_Ty stability

2.7 pH對vB_Pae_Ty穩(wěn)定性的影響 由圖5可知,vB_PaeM_Ty在pH 3～12時(shí)效價(jià)較穩(wěn)定;pH為7時(shí),噬菌體效價(jià)最高,約為3.7×108PFU/mL,裂解能力最高;pH為2時(shí),噬菌體vB_PaeM_Ty效價(jià)最低,約為1.0×105PFU/mL。

圖5 pH對vB_PaeM_Ty穩(wěn)定性的影響Fig.5 Influence of pH on vB_PaeM_Ty stability

2.8 vB_Pae_Ty的核酸類型和全基因組功能分析 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖6,噬菌體vB_PaeM_Ty的基因組核酸為線性雙鏈DNA(Double strand DNA,dsDNA)。vB_PaeM_Ty的基因組長50 051 bp,GC含量為47.23%,編碼74個(gè)ORFs。噬菌體vB_PaeM_Ty全基因組核酸序列提交至GenBank,登錄號(hào)為OQ555403。對vB_PaeM_Ty的全基因組進(jìn)行非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(Non-Redundant Protein Sequence Database,NR)注釋后,得到71個(gè)相應(yīng)的編碼蛋白,基因的進(jìn)化譜系:非同源組(Evolutionary genealogy of genes:non-supervised orthologous groups,eggNOG)注釋后得到8個(gè)相似蛋白,京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)注釋后得到6個(gè)相似蛋白,蛋白注釋數(shù)據(jù)庫(SwissProt)注釋后得到6個(gè)相似蛋白,基因本體(Gene Ontology,GO)注釋后得到11個(gè)相似蛋白。SnapGene 4.24軟件繪制的全基因組分析結(jié)果見圖7。通過BLASTp進(jìn)行功能預(yù)測,有25個(gè)體現(xiàn)功能和結(jié)構(gòu)的蛋白(表3),其他均為假定蛋白;其中結(jié)構(gòu)蛋白有尾刺蛋白(Tail protein)和衣殼蛋白(Capsid protein)等,DNA相關(guān)蛋白有DNA結(jié)合蛋白(DNA binding protein)和DNA聚合酶(DNA polymerase)等,裂解細(xì)菌的蛋白有內(nèi)溶素(Endolysin)和果膠裂解酶(Pectate lyase)等。

表3 vB_PaeM_Ty的全基因組ORFs預(yù)測和功能分析Table 3 Genome-wide ORFs prediction and functional analysis of vB_PaeM_Ty

圖6 vB_PaeM_Ty基因組的凝膠電泳分析Fig.6 Gel electrophoresis analysis of vB_PaeM_Ty genomeM:DL15 000 DNA Marker; 1:DNase I酶切; 2:RNase A酶切;3:Mung Bean Nuclease酶切; C:陰性對照(全基因組)M:DL15 000 DNA Marker; 1:Digestion with DNase I; 2:Digestion with RNase A; 3:Digestion with Mung Bean Nuclease; C:Negative control (whole genome)

圖7 vB_PaeM_Ty全基因組結(jié)構(gòu)示意圖Fig.7 Schematic representation of whole genome structure of vB_PaeM_Ty

2.9 vB_PaeM_Ty的系統(tǒng)發(fā)育樹分析 通過BLASTn比對全基因組序列,vB_PaeM_Ty與假單胞菌噬菌體K4的同源性最高,有92%的覆蓋率和97.36%的同源性;與假單胞菌噬菌體O4全基因序列有91%的覆蓋率和97.58%的同源性。根據(jù)全基因組和主要衣殼蛋白(ORF67)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)現(xiàn)vB_PaeM_Ty與噬菌體K4、O4和IME180有較為密切的同源關(guān)系(圖8)。除假單胞菌屬噬菌體外,vB_PaeM_Ty與克雷伯菌噬菌體(Klebsiellaphage)、弧菌噬菌體(Vibriophage)、埃文氏噬菌體(Erwiniaphage)和檸檬酸桿菌噬菌體(Citrobacterphage)在同一分支(圖9)。

圖8 噬菌體vB_PaeM_Ty全基因組系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Complete genome phylogenetic tree of phage vB_PaeM_Ty●:噬菌體vB_PaeM_Ty的全基因組序列●:Complete genome sequence of phage vB_PaeM_Ty

圖9 以噬菌體vB_PaeM_Ty衣殼蛋白構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 Phylogenetic tree construction based on the capsid protein of phage vB_PaeM_Ty▲:噬菌體vB_PaeM_Ty推定的主要衣殼蛋白▲:Putative main capsid protein of phage vB_PaeM_Ty

3 討論

銅綠假單胞菌感染給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,其也是引起環(huán)境污染和嚴(yán)重醫(yī)院感染的常見菌株。隨著抗生素的濫用,多重耐藥菌頻繁出現(xiàn),如何防治多重耐藥菌,開發(fā)高效、廣譜的噬菌體制劑替代抗生素,已成為目前研究的熱點(diǎn)。目前,國內(nèi)外關(guān)于銅綠假單胞菌噬菌體的研究數(shù)量相對較少。噬菌體有較強(qiáng)的宿主特異性,不同國家和地區(qū)的流行株也有差異。因此分離新的噬菌體,建立廣泛的噬菌體庫,可為噬菌體的臨床應(yīng)用提供重要的儲(chǔ)備資源。

噬菌體作為細(xì)菌的特異性病毒,只特異性裂解特定病原菌,被視為安全的生物抗菌劑[24],對耐藥菌株治療有良好效果[25]。噬菌體在治療銅綠假單胞菌感染中也展現(xiàn)出良好的效果,且具有可靠的安全性[26]。本試驗(yàn)從水中分離得到1株銅綠假單胞菌噬菌體vB_PaeM_Ty,根據(jù)形態(tài)判斷該噬菌體為有尾病毒目(Caudovirales)、肌尾病毒科(Myoviridae)。通過裂解譜分析,發(fā)現(xiàn)噬菌體vB_PaeM_Ty僅能裂解宿主菌PA31和大腸桿菌-39、糞腸球菌-8a,表明vB_PaeM_Ty具有較強(qiáng)的宿主特異性。

噬菌體vB_PaeM_Ty的潛伏期較短,只有20 min,可見其能較快發(fā)揮殺滅宿主菌的作用。vB_PaeM_Ty裂解量約為142 PFU/mL,說明其裂解能力較強(qiáng),具有開發(fā)為抗菌制劑的潛力。vB_PaeM_Ty在45、60和70 ℃放置60 min效價(jià)保持較高,在90 ℃ 放置60 min時(shí)仍具有活性。銅綠假單胞菌噬菌體PL39在80 ℃ 放置10 min完全失活[24];溫度耐受性較好的銅綠假單胞菌噬菌體vB_PaeM_TG2在85 ℃放置1 h完全失活[27]。vB_PaeM_Ty在pH 3～12范圍內(nèi)活性穩(wěn)定,與銅綠假單胞菌噬菌體的PsCh、PsIn、Ps25、Ps12on-D和PSJ-1的研究結(jié)果類似[28,29]。表明vB_PaeM_Ty具有良好的耐熱性能和酸堿耐受性,這些為其臨床應(yīng)用提供了便利。

噬菌體vB_PaeM_Ty的DNA測序結(jié)果顯示,其與銅綠假單胞菌噬菌體K4有較為親近的同源關(guān)系。噬菌體K4 基因組長度為 50 358 bp,編碼 77 個(gè)蛋白和1個(gè) tRNA-Arg,Paundecimvirus屬成員,能夠顯著抑制牛奶和午餐肉等樣品中宿主菌的生長,有效控制食品中銅綠假單胞菌的污染[30,31]。提示本試驗(yàn)分離的vB_PaeM_Ty可能具有治療銅綠假單胞菌感染的潛力。本試驗(yàn)功能預(yù)測分析發(fā)現(xiàn),74個(gè)ORFs中25個(gè)為功能蛋白,其余為假定蛋白。其中,ORF56和ORF73分別編碼內(nèi)溶素和果膠裂解酶。內(nèi)溶素是噬菌體感染細(xì)菌后期編碼的肽聚糖水解酶,其在裂解宿主細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖,釋放子代病毒粒子方面發(fā)揮重要作用,尤其是對dsDNA噬菌體[32,33]。研究表明,內(nèi)溶素對腸球菌、金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌等革蘭陽性病原菌具有良好的殺菌作用[34-36]。果膠裂解酶是解聚酶的一種,可通過消除機(jī)制裂解 β-1,4糖苷鍵,降解細(xì)菌多糖成分,清除和抑制生物被膜的形成。Rice等[37]研究發(fā)現(xiàn),尾刺蛋白中存在果膠裂解酶結(jié)構(gòu)域,成功分離并表征了果膠裂解酶,驗(yàn)證了該酶在治療細(xì)菌感染方面的潛力。因此,內(nèi)溶素和果膠裂解酶在噬菌體殺滅細(xì)菌中具有重要作用,也有助于探究噬菌體-細(xì)菌的感染機(jī)制,這些特征為其開發(fā)為噬菌體制劑并應(yīng)用于臨床提供了理論依據(jù)。

目前,噬菌體治療細(xì)菌感染仍有許多重要問題需要解決,如噬菌體宿主譜窄、細(xì)菌抗性產(chǎn)生快、保存條件嚴(yán)格等問題。因此,分離篩選更多的寬譜噬菌體,構(gòu)建噬菌體庫,通過雞尾酒療法提高噬菌譜,或?qū)κ删w裂解細(xì)菌機(jī)制、裂解酶、“穿孔素-內(nèi)溶素”雙組份裂解系統(tǒng)、尾端吸附機(jī)制、噬菌體-宿主互作等進(jìn)行研究具有重要意義[24,38-40]。綜上所述,本試驗(yàn)分離篩選到的噬菌體vB_PaeM_Ty,是1株烈性噬菌體,耐高溫環(huán)境,且耐酸堿,包含多種功能相關(guān)蛋白,為銅綠假單胞菌噬菌體的文庫構(gòu)建和臨床應(yīng)用等后續(xù)研究提供了重要的理論依據(jù)。