摘 要：為了研究淫羊藿苷（ICA）抑制Notch信號(hào)通路對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）成骨分化。選取8周齡SPF級(jí)健康雌性大鼠40只，手術(shù)摘除雙側(cè)卵巢建立大鼠骨質(zhì)疏松癥模型。收集BMSCs細(xì)胞進(jìn)行體外分離培養(yǎng)，取傳代第三代細(xì)胞進(jìn)行鑒定，試驗(yàn)組加入濃度為0.8 g/100 mL ICA，對(duì)照組加入同劑量的雌激素，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。收集培育的細(xì)胞上清液，檢測(cè)堿性磷酸酶（ALP）和骨鈣素（OCN）水平及Notch信號(hào)通路中相關(guān)蛋白Notch1、Jagged-1、CBF1的表達(dá)水平。結(jié)果表明，流式細(xì)胞檢測(cè)P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原，CD90、CD44、CD34、CD11陽(yáng)性率分別為98.2%，93.3%，2.6%，4.4%，確認(rèn)細(xì)胞鑒定為骨髓干細(xì)胞。與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組ALP和OCN活性明顯升高、另外Noth1、CBF1、Jagged-1蛋白表達(dá)量均較對(duì)照組降低。淫羊藿苷通過(guò)上調(diào)ALP和OCN水平及抑制Notch通路中Notch1、CBF1、Jagged-1蛋白的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠BMSCs的增殖和成骨細(xì)胞分化。

關(guān)鍵詞：淫羊藿苷；骨質(zhì)疏松癥；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）；Notch信號(hào)通路；成骨分化

中圖分類(lèi)號(hào)：R285" " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-0033（2024）04-0070-06

引用格式：周亞妮，張曉文，王丹.淫羊藿苷抑制Notch信號(hào)通路促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化研究[J].商洛學(xué)院學(xué)報(bào)，2024，38（4）：70-75.

A Study on Icariin Inhibiting Notch Signaling Pathway and Promoting Differentiation of Bone Marrow

Mesenchymal Stem Cells

ZHOU Ya-ni， ZHANG Xiao-wen， WANG Dan

（College of Health Management， Shangluo University， Shangluo" 726000， Shaanxi）

Abstract： To study the effect of icariin （ICA） on the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） by inhibiting Notch signaling pathway， a total of 40 8-week-old SPF healthy female rats were selected and bilateral ovaries were surgically removed to establish an osteoporosis model. BMSCs were isolated and cultured in vitro， and the third generation cells were identified. The experimental group was treated with 0.8 g/100 mL ICA. The supernatant of cultured cells was collected to detect the levels of alkaline phosphatase （ALP）， osteocalcin （OCN） and Notch signaling pathway-related proteins Notch1， Jagged-1 and CBF1. The results showed that the positive rates of CD90， CD44， CD34 and CD11 were 98.2%， 93.3%， 2.6% and 4.4%， respectively， and the cells were identified as bone marrow stem cells. Compared with the control group， the ALP and OCN activity of the experimental group was significantly increased， and the protein expression of Noth1， CBF1 and Jagged-1 was decreased.Icariin can promote the proliferation and osteogenic differentiation of BMSCs in ovariectomized osteoporosis rats by upregulating the levels of ALP and OCN and inhibiting the expression of Notch1， CBF1， and Jagged-1 proteins in the Notch pathway.

Key words： icariin; osteoporosis; bone marrow meservchymal stem cells （BMSCs）; Notch signaling pathway; osteogenic differentiation

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種慢性代謝性疾病，臨床上主要表現(xiàn)為骨量丟失與降低、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞及骨脆性增加。骨質(zhì)疏松癥各年齡段均可發(fā)病，導(dǎo)致骨骼脆性增加和易發(fā)生骨折，常見(jiàn)于老年人，尤其是絕經(jīng)后的女性，其發(fā)病率居所有代謝性骨病的首位，嚴(yán)重危害了中老年人的身心健康。其中，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）占骨質(zhì)疏松癥的一半以上，絕經(jīng)是引起女性骨質(zhì)疏松癥的危險(xiǎn)因素[1]。伴隨著全球老齡化的加劇，骨質(zhì)疏松癥已成為全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題，探尋防治骨質(zhì)疏松癥靶點(diǎn)明確的特效藥和探究其作用機(jī)制成為亟待解決的醫(yī)學(xué)難題[2]。淫羊藿苷（icariin，ICA）是淫羊藿中的主要活性成分，有研究表明淫羊藿苷可促進(jìn)雌激素合成，具有雌激素樣作用，且不良反應(yīng)小，在促進(jìn)動(dòng)物骨向分化能力等方面有重要作用[3-5]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是一種具有多功能分化的細(xì)胞，可分化為骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等，研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化可能是決定骨組織結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素[6]。已有研究表明，幾乎所有細(xì)胞的增殖、分化和凋亡都涉及Notch信號(hào)通路的調(diào)控，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中有Notch1通路存在，Notch通路在調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化中發(fā)揮重要作用，可能是骨再生與修復(fù)的重要靶點(diǎn)[7-11]。杜紅陽(yáng)等[12]研究表明，在地黃的作用下，正常擴(kuò)增的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中出現(xiàn)Notch1蛋白的高表達(dá)，Notch1蛋白、Jagged1蛋白和CBF1蛋白表達(dá)明顯降低。目前，關(guān)于淫羊藿苷參與Notch信號(hào)通路促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化的研究較少。本文以動(dòng)物骨質(zhì)疏松癥模型的體外試驗(yàn)為基礎(chǔ)，探討淫羊藿苷對(duì)Notch信號(hào)通路中幾個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的影響，通過(guò)闡明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化作用，為淫羊藿苷應(yīng)用于臨床骨質(zhì)疏松癥的治療提供參考。

1" 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試動(dòng)物

選取SPF級(jí)飼養(yǎng)的健康雌性SD大鼠40只，8周齡，體重200～240 g，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)[SCXK（陜）2018-001]。飼養(yǎng)房控制溫度為24～25 ℃，相對(duì)濕度為45%～55%，每8～10 h換氣一次，光暗周期為12 h/12 h。

1.1.2試劑、藥物與儀器

堿性磷酸酶（ALP）活性檢測(cè)試劑盒（北京天根生化科技有限公司，批號(hào)：BC2162）、大鼠骨鈣素（OCN）活性檢測(cè)試劑盒（北京天根生化科技有限公司，批號(hào)：E30602）、兔抗鼠Notch1單克隆抗體（葛蘭素史克醫(yī)藥公司，批號(hào)：ab61537）、Jagged1單克隆抗體（葛蘭素史克醫(yī)藥公司，批號(hào)：ab10264）、CBF1單克隆抗體（葛蘭素史克醫(yī)藥公司，批號(hào)：ab12178）、DMSO（Sigma，美國(guó)）、ICA純度gt;98.0%（陜西省中醫(yī)藥研究院，藥品批號(hào)：220324-201010）、青霉素（西安利君制藥廠，藥品批號(hào)：B20190814，規(guī)格：80萬(wàn)單位）、流式細(xì)胞儀（BD，美國(guó)）、二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（Thermo，美國(guó)）、全自動(dòng)酶標(biāo)儀（上海博谷生物科技有限公司）、分光光度計(jì)、電子天平均為西安市光華分析儀器廠、微量移液器（上海市求精儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1骨質(zhì)疏松癥模型建立

根據(jù)相關(guān)造模方法[13-14]，大鼠禁食6 h后，取氯胺酮（純藥含量為100 g/2 mL），按照0.1 mL/100 g劑量，采用肌肉注射法麻醉。在下腹正中常規(guī)除毛消毒后，橫行切開(kāi)皮膚，入腹腔，游離脂肪層，依次暴露各層組織，找到卵巢，結(jié)扎并切除卵巢，逐層縫合。術(shù)后給1.5 mL/kg的劑量注射青霉素，連用3 d，以預(yù)防術(shù)后感染。模型組取陰道上皮角化細(xì)胞，做瑞氏染色法，確定建模成功。

1.2.2傳代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

參照蒲曉姝等[15]的方法，頸椎脫臼處死大鼠，在醫(yī)用酒精中浸泡10 min，用消毒器械剔除大鼠皮膚肌肉組織，取其股骨和脛骨浸泡于含雙抗的PBS中，暴露骨髓腔，處理干凈干骺端，無(wú)菌操作剪斷股骨和脛骨，置于2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中反復(fù)吹打，直至骨髓被全部沖出，得到懸液，貼壁倒入離心管中，以2 000 r/min離心10 min棄上清，接種于培養(yǎng)瓶置37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱，標(biāo)記為原代細(xì)胞。首次1 d換培養(yǎng)液一次，以后每2 d更換培養(yǎng)液一次。待原代細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)90%以上時(shí)，首次取生長(zhǎng)優(yōu)越的細(xì)胞按1：2 比例傳代培養(yǎng)得第一代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（P1代細(xì)胞），同樣方法得第二代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（P2代細(xì)胞）、第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（P3代細(xì)胞）。用倒置顯微鏡觀察各形態(tài)。

1.2.3成骨誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定

選取P3代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106 CFU/mL，

分別加入兔抗鼠CD11（anti-rat CD11）、兔抗鼠CD90（anti-rat CD90）、兔抗鼠CD44（anti-rat CD44）、兔抗鼠CD34（anti-rat CD34），流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，樣本按1×104個(gè)細(xì)胞/份收集，用Flow Jo10軟件計(jì)進(jìn)行分析。

1.2.4誘導(dǎo)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的檢測(cè)

參考劉飛祥等[16]的方法，采用CCK-8法檢測(cè)誘導(dǎo)后BMSCs的增殖，繪制生長(zhǎng)曲線。取指數(shù)生長(zhǎng)期的P3代細(xì)胞，按照每孔1×104個(gè)細(xì)胞密度接種于6塊96孔板中，試驗(yàn)組和對(duì)照組1～10 d共計(jì)10 d，每天加入CCK-8試劑，孵育1 h后，將96孔板放入酶標(biāo)儀中，以最佳波長(zhǎng)為450 nm時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)重復(fù)3次，取其均值并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.5藥物干預(yù)措施及含藥血清的制備

將培養(yǎng)好的P3代細(xì)胞濃度為1×105 CFU/mL

接種于24孔培養(yǎng)板中，分為對(duì)照組與試驗(yàn)組。根據(jù)本課題組前期研究，利用不同濃度的淫羊藿苷與雌激素作為對(duì)照，得出濃度為0.8 g/100 mL的ICA是促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化能力的最佳濃度[17]。本研究中，對(duì)照組加入含DMSO的DMEM培養(yǎng)基，試驗(yàn)組設(shè)定ICA濃度為0.8 g/100 mL，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。收集培養(yǎng)0～10 d后的細(xì)胞上清液，置于超低溫冰箱保存，待測(cè)。

1.2.6成骨標(biāo)志物堿性磷酸酶和骨鈣素水平的檢測(cè)

采用ELISA法檢測(cè)成骨標(biāo)志物堿性磷酸酶和骨鈣素水平。取培養(yǎng)7 d后的P3代細(xì)胞，置于4 ℃溫度的PBS液封閉30 min。以1 000 r/min離心10 min。參照試劑說(shuō)明，利用比色法檢測(cè)堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和骨鈣素（osteocalcin，OCN）水平。

1.2.7Notch通路相關(guān)蛋白（Notch1、Jagged-1、CBF1蛋白）的表達(dá)水平的檢測(cè)

采用Western bloting法檢測(cè)Notch通路相關(guān)蛋白（Notch1、Jagged-1、CBF1蛋白）的表達(dá)水平。將BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)10 d后，利用D-Hanks溶液清洗細(xì)胞，加入蛋白裂解液，在4 ℃下保持30 min后，再以1 500 r/min離心10 min，濾掉細(xì)胞碎渣，保留上清液，用BCA法測(cè)蛋白濃度。通轉(zhuǎn)膜、清洗等，然后加入一抗稀釋液（分別含Notch1、Jagged-1、CBF1）置于4 °C 冰箱孵育過(guò)夜，再加入PBS溶液，置于搖床上，65 r/min，清洗3次，每次10 min，加二抗稀釋液，室溫孵育1 h，加入PBS液清洗3次。3 min后在暗室中進(jìn)行曝光顯影、保存圖片，備用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，運(yùn)用SPSS20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。Plt;0.05，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2" 結(jié)果與分析

2.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

將細(xì)胞置于37 ℃，5%CO2 的孵箱培養(yǎng)2 d后，首次換掉一半液體，得到P1代細(xì)胞，在倒置顯微鏡下可見(jiàn)貼壁細(xì)胞較少且形成集落，伸出偽足呈逗點(diǎn)狀或短棒狀，有少量多形性細(xì)胞，部分雜質(zhì)細(xì)胞呈類(lèi)圓形，如圖1（a）所示。培養(yǎng)4 d后，得到P2代細(xì)胞，可見(jiàn)細(xì)胞形狀拉長(zhǎng)，梭形細(xì)胞較P1代增多，胞核為橢圓形，核仁清晰，伸出長(zhǎng)短不一的突起，貼壁較好，成堆出現(xiàn)，如圖1（b）所示。培養(yǎng)7 d后，得到P3代細(xì)胞，可見(jiàn)大量長(zhǎng)梭形細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底部，胞核為卵圓形，細(xì)胞間排列更為緊密，形成單層，如圖1（c）所示。

2.2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞純度的鑒定

流式細(xì)胞檢測(cè)P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原，結(jié)果如圖2所示，CD90、CD44、CD34、CD11陽(yáng)性率分別為98.2%，93.3%，2.6%，4.4%。由此可見(jiàn)，CD44、CD90為陽(yáng)性，CD34、CD11為陰性，從而與造血干細(xì)胞相鑒別。

2.3 淫羊藿苷對(duì)去卵巢大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響

2.3.1淫羊藿苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

由圖3可見(jiàn)，試驗(yàn)組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增長(zhǎng)趨勢(shì)呈S形，第3～6 天生長(zhǎng)最為快速，第6天到達(dá)最高峰。對(duì)照組細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)趨勢(shì)并不明顯。第6天后試驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量明顯大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。

2.3.2淫羊藿苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后堿性磷酸酶和骨鈣素活性的影響

如圖4（a）所示，在淫羊藿苷作用下，試驗(yàn)組較對(duì)照組的堿性磷酸酶活性明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。如圖4（b）所示，與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組骨鈣素活性水平明顯高于對(duì)照組（Plt;0.05）。以上兩項(xiàng)均表明淫羊藿苷具有明顯促進(jìn)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力。

2.3.3淫羊藿苷對(duì)Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

運(yùn)用West blot法檢測(cè)淫羊藿苷對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)，檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組Noth1、Jagged-1、CBF1蛋白表達(dá)均有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。

3" 討論與結(jié)論

骨質(zhì)疏松癥是中老年人的常見(jiàn)病和多發(fā)病，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是最為常見(jiàn)的一種。研究表明，由于女性絕經(jīng)后雌激素水平驟然下降，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥可引發(fā)脂代謝及骨代謝紊亂[18]。另有動(dòng)物研究表明，雌激素缺乏和脂代謝異常會(huì)導(dǎo)致骨髓微環(huán)境異常，脂肪細(xì)胞會(huì)影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和分化，雌激素是骨質(zhì)疏松骨修復(fù)的主要來(lái)源[19]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是細(xì)胞治療及組織工程最為理想的細(xì)胞，臨床上骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于治療一些骨損傷疾病有較好的前景[20]。本研究采用去卵巢法建立大鼠骨質(zhì)疏松模型，模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)，體外培養(yǎng)中取生長(zhǎng)良好的P3代細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，這與龍燕鳴等[21]的研究結(jié)果基本一致。已有研究表明，全骨髓貼壁法具有良好的優(yōu)越性，認(rèn)為是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)最常用的方法[12-15]，因此本文也采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。本課題組前期通過(guò)不同濃度的ICA誘導(dǎo)后，發(fā)現(xiàn)0.8 g/100 mL淫羊藿苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖作用最強(qiáng)[17]，故本研究采用淫羊藿苷濃度為0.8 g/100 mL進(jìn)行試驗(yàn)誘導(dǎo)。Notch信號(hào)通路主要由Jagged 配體、Notch1受體及CBF1轉(zhuǎn)錄因子等組成，在細(xì)胞增殖、分化等過(guò)程中都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，尤其在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中表現(xiàn)尤為突出[22]。已有研究顯示，Notch 信號(hào)經(jīng)過(guò)受體與配體激活后引發(fā)一系列化學(xué)反應(yīng)，表現(xiàn)在當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞核后，再與Jagged1配體、CBF1結(jié)合，使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化受到抑制，主要在Notch信號(hào)通路Notch1受體進(jìn)入細(xì)胞核后發(fā)揮作用[23-25]。Tian 等[26]通過(guò)淫羊藿苷動(dòng)物試驗(yàn)研究進(jìn)一步表明，在藥物處理后CBF1蛋白表達(dá)量有明顯優(yōu)勢(shì)，提示淫羊藿苷通過(guò)上調(diào)CBF1蛋白表達(dá)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。細(xì)胞堿性磷酸酶（ALP）的活力和骨鈣素（OCN）活性是骨細(xì)胞分化的重要標(biāo)志，也是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化的試驗(yàn)指征[27]。本研究選取傳代的第三代（P3）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以淫羊藿苷為靶標(biāo)進(jìn)行藥理作用研究，試驗(yàn)組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在增長(zhǎng)期呈S形生長(zhǎng)，比對(duì)照組生長(zhǎng)趨勢(shì)明顯，同時(shí)發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷的處理明顯上調(diào)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中ALP、OCN的水平，研究表明淫羊藿苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化有促進(jìn)作用，這與李從文等[28]的研究結(jié)果基本一致。本研究利用West blot法檢測(cè)Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷顯著降低了成骨誘導(dǎo)相關(guān)指標(biāo)中Notch1、Jagged1和CBF1的表達(dá)，說(shuō)明淫羊藿苷對(duì)細(xì)胞成骨分化的調(diào)節(jié)作用可能是由抑制Notch通路實(shí)現(xiàn)的，這與武坤等[29]的研究結(jié)果基本一致。本課題組也考慮成骨分化的過(guò)程可能涉及到信號(hào)通路等多種調(diào)控因素。在今后的骨分化研究中，將進(jìn)一步驗(yàn)證淫羊藿苷對(duì)Notch信號(hào)通路中其他蛋白或相關(guān)細(xì)胞因子成分的調(diào)控作用，探索淫羊藿苷對(duì)其骨分化過(guò)程中其他相關(guān)信號(hào)通路，例如NF-κB通路、RANK通路的影響。本研究可為淫羊藿苷應(yīng)用于臨床骨質(zhì)疏松癥的治療提供參考。

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