關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；bHLH轉(zhuǎn)錄因子；DobHLH51基因；生物信息學(xué)分析；非生物脅迫；表達(dá)特性分析

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Mi-go）是蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生附生草本植物，是一種重要的藥用資源，在我國已有兩千多年的藥用歷史，早在東漢末年《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載并被奉為“上品”。因具有“滋陰清熱、益胃生津”之功效，鐵皮石斛歷來被視為石斛中的瑰寶?，F(xiàn)代藥理學(xué)分析表明，鐵皮石斛具有調(diào)節(jié)免疫力、降血糖、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、抗衰老、對胃腸道炎癥有療效等較高的藥用和保健價值。鐵皮石斛的野生資源多分布于東亞、東南亞、澳大利亞等氣候溫暖濕潤的國家或地區(qū)，在我國則主要分布在浙江、云南、貴州、廣東等地。野生鐵皮石斛繁育率低，加之過度采挖和生態(tài)環(huán)境的惡化，野生資源受到嚴(yán)重破壞：人工種植雖然解決了野生石斛資源稀缺的問題，但由于盲目引種導(dǎo)致的種苗混雜以及種植技術(shù)不規(guī)范等，其品質(zhì)難以保證。因此，培育鐵皮石斛優(yōu)良種質(zhì)對保障中藥材原料及品質(zhì)、確保臨床療效和用藥安全至關(guān)重要。

bHLH （basic/helix-loop-helix）家族是植物中第二大類轉(zhuǎn)錄因子家族，其結(jié)構(gòu)域均由60個氨基酸組成，包含兩個高度保守且功能不同的保守區(qū)域，分別位于N端和C端。其中，N端的由13～17個親水性堿性氨基酸組成的堿性區(qū)域可以特異地與DNA序列結(jié)合，進(jìn)而參與調(diào)控很多重要的轉(zhuǎn)錄過程：C端的疏水性堿性氨基酸組成螺旋一環(huán)一螺旋（HLH）區(qū)域，并通過與其他蛋白的疏水性氨基酸結(jié)合形成同源或異源二聚體調(diào)控下游基因表達(dá)。另外，這兩個結(jié)構(gòu)域之間還存在著相互聯(lián)系和相互作用，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞中許多重要基因的表達(dá)，如植物開花、種子休眠和根毛發(fā)育等的調(diào)控基因。

bHLH家族成員的作用廣泛而復(fù)雜，在植物次生代謝調(diào)節(jié)過程中也起到非常重要的作用。例如，水仙花（Chinese narcLssus）NtbHLH1與Nt-MYB6相互作用能夠直接促進(jìn)花青素的生物合成：Aa6119和Aa7162作為典型的黃花蒿（Ar-temzsza annual）bHLH轉(zhuǎn)錄因子，通過兩種機制協(xié)同并正向調(diào)控青蒿素在黃花蒿中的生物合成，一種是通過Aa6119與ADS啟動子的直接結(jié)合來促進(jìn)ADS基因的轉(zhuǎn)錄激活，另一種是通過Aa6119與Aa7162形成異源二聚體協(xié)同激活青蒿素生物合成基因和毛狀體發(fā)育基因的表達(dá)。此外，bHLH家族成員與植物響應(yīng)非生物脅迫（如低溫、干旱等）有關(guān)，當(dāng)植物感受到外界環(huán)境變化時，會將這種變化通過信號通路向下游傳導(dǎo)，從而激發(fā)非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，提高對環(huán)境的適應(yīng)能力。如花生（Arachis hypogaea）Ah-bHLH112基因的過表達(dá)提高了同源轉(zhuǎn)基因植株幼苗期和成株期的抗旱能力，推測AhbHLH112可能通過增強活性氧的清除能力，調(diào)控過氧化物酶（POD）介導(dǎo)的H202穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而參與ABA依賴的應(yīng)激反應(yīng)途徑，在干旱脅迫響應(yīng)中起積極作用；三葉橙（Trifoliate orange）的PtrbHLH66基因在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的過表達(dá)促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因植株的種子萌發(fā)和根系生長，提高了脯氨酸和ABA含量以及抗氧化酶活性，降低了丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）的積累，進(jìn)而增強了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性；水稻（Oryza sativa）的OsbHLH57基因通過正向調(diào)控海藻糖合成、ROS代謝和CBFs/DREBs -依賴性途徑提高水稻的耐寒性；在擬南芥中過表達(dá)仙人掌（FagopyrumtatarLcum）的FtbHLH2基因，能夠顯著增強轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗寒能力?？梢?，bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物非生物脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，深入研究bHLH基因功能及其表達(dá)調(diào)控機制對于提高植物的抗逆性、選育優(yōu)良種質(zhì)、提高作物產(chǎn)量等方面具有重要意義。

目前，有關(guān)鐵皮石斛bHLH轉(zhuǎn)錄因子的研究報道相對較少。Wang等于2020年從鐵皮石斛基因組中鑒定出98個bHLH基因家族成員，并將其分成18個分支。Yu等克隆了茉莉酸甲酯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子DobHLH4基因，研究發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控DoTPS10基因表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)鐵皮石斛花發(fā)育過程中芳樟醇的生物合成。張紅瑞和理雅等分別克隆了鐵皮石斛DobHLH96和DcbHLH14基因，并對這兩個基因在非生物脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，推測這兩個基因可能通過依賴于ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑響應(yīng)低溫和干旱脅迫，但響應(yīng)機制尚不明確。本研究從鐵皮石斛中克隆了DobHLH51基因編碼區(qū)（CDS）序列，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)和組織表達(dá)特異性分析，明確該基因在低溫、干旱和ABA處理下的表達(dá)特性，為深入研究DobHLH51基因功能及其在非生物脅迫應(yīng)答中的表達(dá)調(diào)控機制奠定理論基礎(chǔ)，也為通過現(xiàn)代育種技術(shù)培育優(yōu)質(zhì)抗逆的藥用鐵皮石斛優(yōu)良品種提供基因資源。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試植物材料為廣東丹霞鐵皮石斛，取樣于韶關(guān)市石斛工程開發(fā)中心。2x Taq PCR Mix、All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix、Fast-Pure Gel DNA Extraction Mini Kit購自北京蘭博利德生物技術(shù)有限公司、T4 DNA連接酶、pMD18-T載體、Real Time PCR試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司；PCR引物合成委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2試驗方法

試驗于2021-2022年在廣東省韶關(guān)市韶關(guān)學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院分子生物學(xué)與基因工程研究室進(jìn)行。

1.2.1樣品采集與處理鐵皮石斛蒴果消毒后接種于培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)6個月，選取生長狀態(tài)良好且長勢一致的幼苗（株高約5～6cm）用于脅迫處理。設(shè)低溫處理組（4℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)）、模擬干旱處理組（20%PEG-6000澆灌）和ABA處理組（100umol/L ABA澆灌），以未經(jīng)任何處理的正常條件下的無菌幼苗為對照組。各組均在處理第1、3、6、9、12、24 h取葉組織樣品，經(jīng)液氮速凍后，保存于-80℃超低溫冰箱，用于脅迫下的基因表達(dá)分析。分別采集處于花期的一年生鐵皮石斛的根、莖、葉和花器官，經(jīng)液氮速凍后超低溫保存，用于基因組織表達(dá)分析。每個樣品3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2總RNA提取與cDNA合成采用改良的CTAB法分別提取上述樣品總RNA，利用Nan-odrop微量分光光度計檢測其濃度。參照All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA。

1.2.3基因克隆與陽性茵斑鑒定根據(jù)NCBI（https：//www.ncbi. nlm. nih. gov）數(shù)據(jù)庫已知的云南鐵皮石斛bHLH51同源序列（基因ID：LOC110107930）設(shè)計DobHLH51基因特異性擴增弓I物（F：5＇-ATGAAGAACTCTTCAAATTTCT -3';R：5'-CTAAACAGACATATTGAAATAG-3'）.PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，膠回收連接至pMD18-T線性載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli） DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選單克隆菌液進(jìn)行PCR鑒定后，選取陽性克隆送至委托公司測序驗證。

1.2.4生物信息學(xué)分析在NCBI數(shù)據(jù)庫提交克隆的DobHLH51基因的氨基酸編碼序列，通過Blastp比對篩選相似性高的其他物種同源序列，利用MEGA11軟件的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。利用DNAMAN軟件對DobHLH51及其同源蛋白進(jìn)行氨基酸多序列比對：利用NCBI-CDD在線預(yù)測DobHLH51蛋白結(jié)構(gòu)域；運用ExPASy ProtParam預(yù)測蛋白理化性質(zhì)；使用SOPMA進(jìn)行蛋白二級結(jié)構(gòu)分析，采用ProtScale進(jìn)行親疏水性分析：采用SWISS -MOD-EL預(yù)測分析蛋白三級結(jié)構(gòu)，采用PDBsum對蛋白三級結(jié)構(gòu)合理性評估；使用TMHMM和SignalP5.0預(yù)測蛋白跨膜區(qū)和信號肽，利用NetPhos 3.1在線軟件預(yù)測蛋白磷酸化位點。通過PlantCARE網(wǎng)站預(yù)測啟動子順式作用元件。

1.2.5組織表達(dá)特性分析從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載未經(jīng)任何處理的8個鐵皮石斛組織的表達(dá)數(shù)據(jù)，分別是花蕾、花柱、唇瓣、萼片、葉、莖、灰白根和綠根尖?；虮磉_(dá)量用FPKM（fragments perkilobase per million mapped reads）表示，并用TBtools軟件進(jìn)行可視化處理，分析DobHLH51基因在不同組織器官中的表達(dá)情況。

1.2.6不同脅迫處理下的轉(zhuǎn)錄組分析將經(jīng)低溫、干旱或ABA處理不同時間的鐵皮石斛樣品的cDNA模板送至深圳華大基因科技有限公司完成高通量測序。去除所得原始測序序列中的接頭和低質(zhì)量Rawreads．以保證信息分析質(zhì)量，最終得到Cleanreads；利用Qubit 2.0將Clean reads與鐵皮石斛基因組參考序列進(jìn)行比對，并使用Cufflinks進(jìn)行組裝從而獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，基因表達(dá)量以FPKM表示，分析鐵皮石斛DobHLH51基因在低溫、干旱和外源ABA處理下的表達(dá)模式。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

采用WPS 2019軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使用SPSS21.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，用Duncan's法進(jìn)行多重比較，使用GraphPad Prism 9.5軟件作圖。

2結(jié)果與分析

2.1DobHLH51基因克隆與序列分析

由圖1、圖2可見，以廣東丹霞鐵皮石斛葉組織cDNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴增，克隆到目的條帶。測序獲得DobHLH51基因CDS序列全長為768bp，編碼255個氨基酸。與參考序列對比，共有13個堿基差異，包括5個同義替換、5個非同義替換和3個堿基缺失。基因結(jié)構(gòu)和染色體定位結(jié)果顯示．DobHLH51基因定位于2號染色體，含有2個外顯子和1個內(nèi)含子。

2.2DobHLH51蛋白生物信息學(xué)分析

蛋白結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，DobHLH51蛋白含有bHLH家族保守結(jié)構(gòu)域（cl00081）和ACT結(jié)構(gòu)域（cd04873），屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子亞家族（圖3A）；DobHLH51分子式為相對分子量為28.03kDa，理論等電點為9.71，不穩(wěn)定指數(shù)達(dá)58.01，在第27位亮氨酸（Leu）處具有親水性最大值（1.567），在第74位精氨酸（Arg）處具有親水性最小值（-3.033），親水性平均值為-0.334（圖3B），說明DobHLH51屬于親水性不穩(wěn)定蛋白。DobHLH51蛋白二級結(jié)構(gòu)由41.57%a-螺旋、1.96%折疊、11.76%延伸鏈和44.71%無規(guī)則卷曲組成（圖3C），主要以a-螺旋和無規(guī)則卷曲為主；其三級結(jié)構(gòu)（圖3D）與墨蘭bHLH30轉(zhuǎn)錄因子相似度高達(dá)81.82%，且該模型符合立體化學(xué)的規(guī)則，蛋白構(gòu)象合理可靠（圖3E）。此外，DobHLH51蛋白無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)；但含有52個蛋白磷酸化位點，其中包括38個絲氨酸（Ser）、12個蘇氨酸（Thr）及2個酪氨酸（Tyr）位點（圖4）。

2.3DobHLH51蛋白的同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析

以DobHLH51蛋白為目的序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中篩選出9個不同物種的同源性較高的序列進(jìn)行比對分析，其中同源性最高的是黃石斛（Den-drobium catenaturn）bHLH蛋白，相似度為97.66%；其次是金釵石斛（Dendrobium nobile）和鼓槌石斛（Dendrobium chrysotoxum）的bHLH蛋白，相似度分別為96.47%和94.12%。多重序列比對結(jié)果（圖5）顯示，DobHLH51氨基酸序列與其他物種bHLH蛋白的氨基酸序列同源性較高，均在N端第56～114個氨基酸殘基位置含有bHLH蛋白結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹分析結(jié)果（圖6）顯示，DobHLH51與黃石斛和金釵石斛bHLH的聚類關(guān)系最近，與同源序列比對分析結(jié)果一致。

2.4DobHLH51基因組織表達(dá)特性分析

轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果（圖7A）表明，DobHLH51基因在鐵皮石斛不同組織器官中的相對表達(dá)量存在明顯差異，在莖中的相對表達(dá)量最高，在根組織（綠根尖和灰白根）中的表達(dá)量次之，在葉中的表達(dá)量最低。qRT-PCR分析結(jié)果（圖7B）進(jìn)一步驗證了DobHLH51基因在鐵皮石斛不同組織中的表達(dá)存在差異，同樣以莖中的表達(dá)量最高，是葉的3.45倍：其次是根中的，相對表達(dá)量是葉的1.6倍；在花中的表達(dá)量最低。推測該基因可能在鐵皮石斛莖的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

2.5DobHLH51在低溫、干旱及ABA處理下的表達(dá)特性分析

PlantCARE分析顯示，DobHLH51基因起始密碼子上游2kb啟動子中含有脫水、干旱、低溫及ABA響應(yīng)等順式作用元件（表1），因此，對DobHLH51基因在低溫、干旱和ABA處理下的表達(dá)特性進(jìn)行分析。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果（圖8）顯示，DobHLH51基因表達(dá)量對3種處理的響應(yīng)整體上均隨著時間的延長呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，其中低溫和干旱處理12h表達(dá)量達(dá)到最高，而ABA處理6h表達(dá)量就達(dá)到峰值，表明DobHLH51基因明顯受到低溫、干旱和ABA誘導(dǎo)，提示該基因可能在非生物脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮重要功能。qRT-PCR分析結(jié)果（圖9）進(jìn)一步驗證了DobHLH51基因在低溫、干旱和ABA處理下均可被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，其中低溫處理后DobHLH51表達(dá)量先下降后升高，處理24h達(dá)到峰值，是處理前的43倍：干旱處理后DobHLH51表達(dá)量持續(xù)升高，處理12h達(dá)到最高值，是處理前的5.3倍：ABA處理6h DobHLH51表達(dá)量最高，是處理前的19.4倍。

3討論與結(jié)論

bHLH家族作為植物第二大類轉(zhuǎn)錄因子，已在多種植物中被鑒定和克隆出來，并借助擬南芥、水稻等模式植物進(jìn)行了功能研究，發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。鐵皮石斛中共鑒定出98個bHLH基因家族成員，但對其響應(yīng)非生物脅迫方面的作用及機制鮮少報道。本研究克隆了鐵皮石斛DobHLH51基因，其CDS全長768bp，編碼255個氨基酸，除含有bHLH保守結(jié)構(gòu)域外，還具有ACT結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合特定的小分子配體來提供變構(gòu)調(diào)節(jié)，以發(fā)揮傳感器蛋白功能。DobHLH51為親水性不穩(wěn)定蛋白，其三級結(jié)構(gòu)與墨蘭bHLH30同源性高達(dá)81.82%，且在進(jìn)化上與黃石斛和金釵石斛bHLH親緣關(guān)系最近，表明DobHLH51蛋白序列和結(jié)構(gòu)在蘭科植物中進(jìn)化相對保守。此外，DobHLH51肽鏈中含有52個磷酸化位點，其中38個Ser位點，推測該蛋白發(fā)生磷酸化時可能以Ser磷酸化為主，從而在多種生物學(xué)進(jìn)程和分子功能上發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

以往的研究顯示，bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物不同發(fā)育日寸期和不同組織器官中的表達(dá)具有日寸空特性，對植物的形態(tài)建成和生長發(fā)育起著重要作用。本研究克隆的DobHLH51基因在鐵皮石斛不同組織器官中的表達(dá)水平也存在明顯差異，在莖中的表達(dá)量最高，提示該基因在鐵皮石斛營養(yǎng)器官形成、養(yǎng)分吸收和運輸?shù)冗^程中發(fā)揮重要功能。此外，bHLH基因及其參與的信號通路在植物響應(yīng)低溫、干旱、高鹽等脅迫時發(fā)揮重要調(diào)控作用。如葡萄（Vitis vinifera）VvbHLH1通過增加轉(zhuǎn)基因擬南芥中黃酮類化合物的積累并增強其ABA信號傳導(dǎo)，提高了轉(zhuǎn)基因植株對非生物脅迫的耐受性；密羅木（Myrothamnus flabellifolia）MfbHLH38基因通過依賴于ABA的信號途徑提高保水能力、調(diào)節(jié)滲透平衡、減輕脅迫引起的氧化損傷等以增強轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對干旱和鹽脅迫的耐受性。本研究發(fā)現(xiàn)，DobHLH51基因啟動子區(qū)含有低溫、干旱和脫水響應(yīng)以及ABA應(yīng)答元件，且可被低溫、干旱和ABA處理誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)：但其在低溫和干旱脅迫下的表達(dá)模式一致，與ABA誘導(dǎo)下表達(dá)模式不同，提示該基因響應(yīng)低溫和干旱脅迫可能通過不依賴于ABA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，但具體的調(diào)控機制尚需進(jìn)一步研究。

值得關(guān)注的是．有研究發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子主要通過ICE-CBF途徑結(jié)合并激活靶基因的表達(dá)，提高活性氧清除能力及聯(lián)合光信號、激素信號等機制來增強植物的抗寒能力。本研究克隆的DobHLH51啟動子中含有能夠被CBFs特異結(jié)合的LTR元件，該元件是植物低溫響應(yīng)過程中的關(guān)鍵因子，推測DobHLH51基因可能通過CBFs介導(dǎo)的ICE-CBF信號途徑參與低溫應(yīng)答過程，但具體響應(yīng)機制尚未可知。因此，需要對DobHLH51基因響應(yīng)干旱和低溫脅迫的分子調(diào)控機制進(jìn)行深入研究。今后本課題組將通過基因過表達(dá)和基因敲除實驗對DobHLH51基因的功能做進(jìn)一步分析和驗證，以期為闡明該基因在鐵皮石斛抗逆中的作用機制奠定基礎(chǔ)。