摘要：為了解小尾寒羊的生長和發(fā)育的遺傳機制，為小尾寒羊的品種選育做基礎，本研究對GHR和GHRHR基因的多態(tài)性進行檢測，并將其多態(tài)性與生長性狀進行了關聯(lián)分析。試驗利用PCR-SSCP技術(shù)，檢測GHR和GHRHR基因在小尾寒羊群體的多態(tài)性，利用SPSS軟件分析GHRH基因的多態(tài)性與生長性狀之間的關聯(lián)性。結(jié)果表明，在小尾寒羊群體中檢測到3種GHR和GHRHR基因基因型，即DD、II、ID，GHR基因和GHRHR基因中II的基因型頻率分別為0.625 0、0.687 5，ID的基因型頻率分別為0.3 130、0.2 500，DD的基因型頻率為0.0 630、0.0 625。GHR基因個體中DD基因型個體和ID基因型個體在宰后胴體質(zhì)量、臀端高、尻長、頸長、胸深這5個性狀中均表現(xiàn)出顯著差異（Plt;0.05）；DD基因型個體和Ⅱ基因型個體在宰前活體質(zhì)量、宰后胴體質(zhì)量、臀端高、尻長、頸長這5個性狀中均表現(xiàn)出顯著差異（Plt;0.05）。GHRHR基因中，DD基因型個體和ID基因型個體在宰前活體質(zhì)量、宰后胴體質(zhì)量、體高、體長、尻高、頸長、腰角寬、腿臀圍這8個性狀中均表現(xiàn)出顯著差異（Plt;0.05）；ID基因型個體與II基因型個體在頸長和羊的宰前活體質(zhì)量這2個性狀中表現(xiàn)出顯著差異（Plt;0.05）；同樣DD基因型個體同II基因型個體在尻高、腿臀圍這2個性狀中均表現(xiàn)出顯著差異（Plt;0.05）。結(jié)果證明，GHR和GHRHR基因與小尾寒羊生長發(fā)育的相關性，可作為本土小尾寒羊遺傳雜交改良的重要功能候選基因。本研究為進一步研究小尾寒羊的遺傳特性試驗提供了理論依據(jù)，對于研究小尾寒羊的遺傳多樣性改良和培育優(yōu)良小尾寒羊品種具有重要意義。

關鍵詞：小尾寒羊；GHRHR基因；GHR基因；PCR；關聯(lián)分析；生長性狀

中圖分類號：S826.2" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）04-0187-06

收稿日期：2023-05-03

基金項目：國家自然科學基金（編號：31201777）；橫向課題（編號：橫20220047）。

作者簡介：何豫涵（2000—），男，河南周口人，碩士研究生，研究方向為動物分子育種。E-mail：heyuhan0609@163.com。

通信作者：白俊艷，博士，教授，主要從事動物分子育種研究，E-mail：junyanbai@163.com；王玉琴，博士，教授，主要從事動物分子育種研究，E-mail：wangyq6836@163.com。

生長激素受體（growth hormone receptor，GHR）基因和生長激素釋放激素受體（growth hormone releasing hormone receptor，GHRHR）基因廣泛存在于各種哺乳動物中。它們均被認為是影響動物生長發(fā)育的重要基因。動物的生長和發(fā)育是由許多信號傳導途徑上的調(diào)控因子相互協(xié)同來執(zhí)行的，動物體內(nèi)幾乎所有的激素均直接或間接地參與機體生長的調(diào)節(jié)，其中，最為關鍵的是下丘腦-垂體-肌肉生長軸［1］。生長激素（growth hormone，GH）是由腦垂體前葉合成和分泌的蛋白質(zhì)類激素，而GH發(fā)揮調(diào)控動物機體作用首先必須與靶細胞表面的生長激素受體結(jié)合。由GHR介導將信號傳遞到細胞內(nèi)從而產(chǎn)生一系列的生理反應。GHRHR響應生長激素釋放激素結(jié)合，導致儲存在分泌顆粒中的生長激素釋放，刺激生長激素細胞中生長激素的產(chǎn)生［2］。因此，組織中GHR基因和GHRHR基因堿基序列的突變均可能影響GH生理效應的正常發(fā)揮，導致動物生長發(fā)育模式的變異，從而影響細胞的代謝活動，最終影響動物的生產(chǎn)性能［3］。GHR在GH發(fā)揮生理作用的過程中有著至關重要的作用，對GH在細胞內(nèi)的表達量有重要的影響，因此在動物機體的新陳代謝、生長發(fā)育和機體免疫等方面均具有極為重要的作用［4］。

InDel（insertion-deletion）標記是指在等位基因位點上一定數(shù)量的核苷酸插入或缺失一段相對短的核苷酸序列而產(chǎn)生的長度多態(tài)性變異。InDel具有分布廣泛、密度大、突變率低等優(yōu)點，并且易于分型，與復雜的SNP分型系統(tǒng)相比，InDel分型簡單快捷，利用PCR及電泳平臺即可方便簡潔地進行。這使InDel成為了優(yōu)秀的新一代分子標記，為家畜育種工作提供了新方法［5］。它作為分子標記的一種，可以較容易地通過生物信息學的方法獲得。本試驗選擇InDel標記探究GHRHR基因和GHR基因?qū)π∥埠蛏L發(fā)育的影響。當前世界對于生長激素受體相關基因的研究并不算少：北京油雞的GHRHR基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP）g.-1654Agt;G對于不同周齡雞體質(zhì)量、初產(chǎn)蛋日齡及產(chǎn)蛋數(shù)均有顯著影響［6］；GHR基因核苷酸多態(tài)性對澤西牛繁殖、生產(chǎn)和產(chǎn)犢健康有影響，在GHR-F279Y位點上酪氨酸編碼A突變?nèi)〈奖彼峋幋aT等位基因，會導致乳、脂肪和蛋白質(zhì)產(chǎn)量下降等［7］。以上研究證明了GHRHR基因和GHR基因?qū)游飩€體生長發(fā)育的重要影響。但對于綿羊的GHRHR和GHR基因的研究相對較少，所以本研究探討綿羊品種小尾寒羊GHR和GHRHR基因的多態(tài)性及其與生產(chǎn)性狀之間的相關關系，可為優(yōu)良綿羊品種的培育選育提供良好的數(shù)據(jù)支持，可根據(jù)需要以此來培育出可適應我國不同地區(qū)、不同氣候及不同飼養(yǎng)方式需求的優(yōu)良品種。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究采用的實驗動物是2022年3月，采自遼寧省沙地治理與利用研究所阜瑤牧業(yè)公司阜新市種羊場養(yǎng)殖的小尾寒羊（n=32），所有羊只均在相同環(huán)境下飼養(yǎng)。對頸靜脈采集的10 mL小尾寒羊血液樣本用自配4%枸櫞酸鈉抗凝劑（ACD）處理并置于冰盒中（血液與ACD的體積比為5 ∶1），-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 生長性狀指標測定

利用常規(guī)方法對小尾寒羊的生長性狀指標進行測定，測定的指標包括羊的宰前活體質(zhì)量、宰后胴體質(zhì)量、體高、體長、胸寬、胸圍、管圍、尻高、臀端高、前肢高、頭長、尻長、頸長、額寬、腰角寬、臀端寬、胸深、頭深、腹圍、腿臀圍、背高［8］。

1.2.2 基因組DNA提取

取出綿羊血樣解凍后，根據(jù)全血基因組DNA試劑盒（Thermo Scientific公司）說明書提取綿羊血液DNA，采用ND2000核酸濃度測定儀（Thermo Scientific公司）檢測DNA的濃度和純度，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。根據(jù)DNA樣品純度和濃度將DNA稀釋至100 ng/μL，分裝至EP管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設計

引物設計參照Wu等的論文，由鄭州鼎國生物技術(shù)有限公司合成［9］，引物序列信息見表1。

1.2.4 PCR-SSCP技術(shù)

PCR-SSCP技術(shù)是一種用于檢測DNA序列變異的分子生物學方法。它通過PCR擴增目標DNA片段，然后將其經(jīng)過單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）電泳分離，使得具有不同突變的序列在電泳中呈現(xiàn)出不同的遷移模式，從而實現(xiàn)對樣本DNA序列變異的檢測和分析。

1.2.5 PCR擴增與凝膠電泳

GHR和GHRHR基因的PCR擴增體系均為10.0 μL：PCR Master Mix（Thermo Scientific公司）5.0 μL，DNA樣品1.0 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，ddH2O 2.4 μL。經(jīng)過溫度梯度篩選得到：GHR基因最適的退火溫度為53.2 ℃，GHRHR基因最適的退火溫度為 68.5 ℃。分別使用其最適的退火溫度進行PCR擴增。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Microsoft Excel 2019軟件對小尾寒羊GHR和GHRHR基因的基因型頻率、等位基因頻率、χ2、P值等數(shù)據(jù)進行計算。使用SPSS 26.0軟件對小尾寒羊GHR和GHRHR基因多態(tài)性與生長性狀進行關聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小尾寒羊GHR和GHRHR基因的電泳結(jié)果

由圖1可知，在小尾寒羊群里檢測到GHR基因有3種基因型，分別為II、ID及DD。

由圖2可知，在小尾寒羊群里檢測到GHRHR基因存在3種基因型，分別為II、ID、DD。

2.2 群體遺傳參數(shù)

由表2可知，GHR基因中的II的基因型頻率最高，為0.625 0，DD基因型頻率最低，僅有0.063 0；等位基因I的頻率較高，D的頻率較低。GHRHR基因中DD基因型頻率最低，為0.062 5， ID基因型頻率為0.250 0，II基因型頻率最高，為0.687 5；等位基因D頻率較低，為0.187 5，等位基因I頻率較高，為0.812 5。小尾寒羊GHR基因和GHRHR基因均不偏離哈代—溫伯格平衡（Pgt;0.05）。

2.3 小尾寒羊GHR基因與生長性狀關聯(lián)分析

由表3可知，基因型DD小尾寒羊的宰前活體質(zhì)量和宰后胴體質(zhì)量顯著高于II基因型個體（Plt;0.05）。基因型DD小尾寒羊的宰后胴體質(zhì)量顯著高于ID基因型個體（Plt;0.05）。3種基因型的小尾寒羊的體高、體長、胸寬、胸圍及管圍差異均不顯著（Pgt;0.05）。基因型DD小尾寒羊的臀端高、頸長顯著高于ID基因型個體（Plt;0.05），基因型ID小尾寒羊的尻長顯著高于DD基因型個體（Plt;0.05）。基因型DD小尾寒羊的臀端高、頸長顯著高于II基因型個體（Plt;0.05）。基因型II小尾寒羊的尻長顯著高于DD基因型個體（Plt;0.05）。3種基因型的小尾寒羊的前肢高、頭長及額寬差異均不顯著（Pgt;0.05）。3種基因型小尾寒羊的腰角寬、臀端寬、頭深、腹圍及背高差異均不顯著（Pgt;0.05）?；蛐虸D小尾寒羊的胸深顯著高于DD基因型個體（Plt;0.05）?；蛐虳D和基因型II的小尾寒羊的胸深差異不顯著（Pgt;0.05），基因型ID和基因型II的小尾寒羊的胸深差異不顯著（Pgt;0.05）。

2.4 GHRHR基因與小尾寒羊生長性狀的關聯(lián)分析

由表4可知，小尾寒羊的DD基因型個體宰前活體質(zhì)量、宰后胴體質(zhì)量、體高和體長這4個性狀中顯著高于ID基因型個體（Plt;0.05），而在胸寬、胸圍和管圍這3個性狀中均表現(xiàn)出差異不顯著（Pgt;0.05）。DD基因型個體與II基因型個體在羊的宰前活體質(zhì)量、宰后胴體質(zhì)量、體高、體長、胸寬、胸圍和管圍這7個性狀中均表現(xiàn)出差異不顯著（Pgt;0.05）。II基因型小尾寒羊的宰前活體質(zhì)量顯著高于ID基因型個體（Plt;0.05），而在宰后胴體質(zhì)量、體高、體長、胸寬、胸圍和管圍這6個性狀中均表現(xiàn)出差異不顯著（Pgt;0.05）。

小尾寒羊DD基因型個體的尻高和頸長顯著高于ID基因型個體（Plt;0.05），而這2種基因型個體臀端高、前肢高、頭長、尻長和額寬這5種性狀均表現(xiàn)出差異不顯著（Pgt;0.05）。II基因型個體的頸長顯著高于ID基因型個體（Plt;0.05），而尻高、前肢高、額寬、臀端高、頭長和尻長這6個性狀均表現(xiàn)出差異不顯著（Pgt;0.05）。DD基因型個體的尻高顯著高于II基因型個體（Plt;0.05），而這2種基因型個體臀端高、頭長、額寬、尻長、前肢高和頸長這6種性狀均表現(xiàn)出差異不顯著（Pgt;0.05）。小尾寒羊DD基因型個體的腿臀圍顯著高于ID基因型個體（Plt;0.05），小尾寒羊ID基因型個體的胸深顯著高于DD基因型個體（Plt;0.05），而這2種基因型個體在背高、臀端寬、頭深、腹圍和腰角寬5種性狀中均表現(xiàn)出差異不顯著（Pgt;0.05）。ID基因型個體與II基因型個體在背高、頭深、臀端高、腰角寬、腿臀圍、胸深和腹圍7個性狀中均表現(xiàn)出差異不顯著（Pgt;0.05）。DD基因型個體的腿臀圍顯著高于II基因型個體（Plt;0.05），而這2種基因型個體在臀端寬、頭深、背高、腹圍、胸深和腰角寬這6種性狀中均表現(xiàn)出差異不顯著（Pgt;0.05）。

3 討論

3.1 GHR基因是動物生長發(fā)育相關的重要功能候選基因

GHR基因最早是在1976年由Tsushima在兔的肝臟細胞的細胞膜上發(fā)現(xiàn)的。近年來，所以關于GHR基因的研究不斷豐富［10］。Gencheva等研究了位于生長激素基因受體基因單核苷酸多態(tài)性對107只斷奶加利福尼亞種兔35、70、90日齡生長期個體體質(zhì)量的影響，發(fā)現(xiàn)各基因型之間存在差異，研究得出GHR基因可能是加利福尼亞兔提高生長性能的有用候選基因［11］。Cobanoglu等研究了生長激素受體基因第10外顯子特定單核苷酸多態(tài)性（SNP）區(qū)域?qū)ν炼滹曫B(yǎng)的澤西和荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀的影響，發(fā)現(xiàn)GHR基因可能是標記輔助選擇方案的潛在候選基因，以改善土耳其奶牛群體的牛奶性能和相關性狀［12］。鄭嘉輝等對GHR基因的突變情況進行了研究，結(jié)果表明突變后的GHR基因會影響蘆花雞脛長、體質(zhì)量發(fā)育［13］。Sahu等將印度綿羊的GHR基因第10個外顯子SNP位點與生長性狀進行了相關分析，發(fā)現(xiàn)GHR基因?qū)︸R德拉斯紅羊出生、6個月和9個月的體質(zhì)量有顯著影響［14］。Akhatayeva等分析表明，GHR基因與公羊、母羊的生長性狀顯著相關，包括體質(zhì)量、身高、胸深、胸圍、胸圍、大炮圍、腹圍和臀圍這幾種生長性狀［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，GHR基因與小尾寒羊的宰后胴體質(zhì)量、臀端高、尻長、頸長、胸深這5個性狀上存在顯著關聯(lián)性，其中，DD基因型個體在宰后胴體質(zhì)量、臀端高、頸長等性狀上高于ID、II基因型個體，說明I→D的轉(zhuǎn)換在促進小尾寒羊生長發(fā)育方面有重要影響作用。與Gencheva等的研究結(jié)果［11-14］一致。

3.2 GHRHR基因是動物生長發(fā)育相關的重要功能候選基因

GHRHR基因在細胞增殖、生長激素合成與分泌等方面發(fā)揮重要作用，目前關于該基因影響生長發(fā)育的研究日趨增多。Johansson等研究表明，GHRHR基因可能是至今為止所發(fā)現(xiàn)的影響人類身高正常變異的最重要基因之一，GHRHR基因突變的患者會表現(xiàn)出明顯的矮小癥［16］。劉艷麗等將奶山羊GHRHR基因變異與其生長性狀進行關聯(lián)分析，研究發(fā)現(xiàn)GHRHR基因P3位點基因型與關中奶山羊的體長、體高和胸圍存在顯著性關聯(lián)；而在西農(nóng)薩能奶山羊群體中，GHRHR基因多態(tài)性顯著影響個體的體高和體長生長性狀，這些結(jié)果表明GHRHR基因是影響奶山羊生長性狀的候選基因［17］。Liu等對北京油雞GHRHR基因多態(tài)性的研究結(jié)果表明，GHRHR基因多態(tài)性對7、9、11、13、17周齡雞體質(zhì)量和32、36、40周齡雞開產(chǎn)日齡及產(chǎn)蛋數(shù)有顯著影響，GHRHR基因啟動子區(qū)的3個SNP位點可作為潛在的遺傳標記用于改善雞的生長和繁殖性狀［6］。Zhao等的研究結(jié)果表明，GHRHR基因的6個SNPs顯著影響中國大別山黃牛體高、臀高、胸圍、臀寬等體型性狀，因此GHRHR基因可作為大別山黃牛育種的分子標記［18］。Wu等研究發(fā)現(xiàn)，GHRHR基因多態(tài)性顯著影響蘭州大尾羊群體的體質(zhì)量，即GHRHR的1個分子標記可用于肉羊生長相關性狀的標記輔助選擇［9］。上述研究均表明，GHRHR基因可能對于動物的生長發(fā)育有著重要的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，GHRHR基因的不同基因型個體在宰前活體質(zhì)量、宰后胴體質(zhì)量、體高、體長、尻高、頸長、腰角寬、腿臀圍等生長性狀中均表現(xiàn)出顯著差異，試驗結(jié)果驗證了GHRHR基因的多態(tài)性可影響小尾寒羊的生長發(fā)育性狀。

4 結(jié)論

GHRHR基因和GHR基因的不同基因型小尾寒羊的生長性狀存在顯著差異。GHR基因與小尾寒羊的宰后胴體質(zhì)量、臀端高、尻長、頸長、胸深這5個性狀上存在顯著關聯(lián)性，其中，DD基因型個體在宰后胴體質(zhì)量、臀端高、頸長等性狀上高于ID、II基因型個體。GHRHR基因的不同基因型個體在宰前活體質(zhì)量、宰后胴體質(zhì)量、體高、體長、尻高、頸長、腰角寬、腿臀圍等生長性狀中均表現(xiàn)出顯著差異。GHR和GHRHR基因與小尾寒羊生長發(fā)育具有相關性，可作為本土小尾寒羊遺傳雜交改良的重要功能候選基因。

參考文獻：

［1］楊樹猛，卡召加，王蘭英，等. 甘南歐拉羊GHR基因第10外顯子SSCP多態(tài)性與生長性狀關聯(lián)研究［J］. 中國草食動物科學，2015，35（1）：1-4.

［2］Dettori M L，Pazzola M，Paschino P，et al. Association between the GHR，GHRHR，and IGF1 gene polymorphisms and milk yield and quality traits in Sarda sheep［J］. Journal of Dairy Science，2018，101（11）：9978-9986.

［3］馬 曉，胡 毅，熊 鋼，等. 生長激素受體及其基因研究進展［J］. 湖南農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），2010，36（增刊1）：58-62.

［4］唐賢飛. GH和GHR基因?qū)F州地方黃牛生長性能的影響［J］. 畜禽業(yè)，2021，32（9）：47，49.

［5］楊 潔，赫 佳，王丹碧，等. InDel標記的研究和應用進展［J］. 生物多樣性，2016，24（2）：237-243.

［6］Liu W，Yu Y，Li G，et al. Single-nucleotide polymorphisms in the promoter of the growth hormone-releasing hormone receptor gene are associated with growth and reproduction traits in chickens［J］. Animal Genetics，2012，43（5）：564-569.

［7］Komisarek J，Michalak A，Walendowska A. The effects of polymorphisms in DGAT1，GH and GHR genes on reproduction and production traits in Jersey cows［J］. Animal Science Papers and Reports，2011，29 （1）：29-36.

［8］He L B，Kang Z H，Kang Y X，et al. Goat CMTM2：mRNA expression profiles of different alternative spliced variants and associations analyses with growth traits［J］. 3 Biotech，2020，10（3）：1-10.

［9］Wu M L，Zhao H D，Tang X Q，et al. Novel InDels of GHR，GHRH，GHRHR and their association with growth traits in seven Chinese sheep breeds［J］. Animals，2020，10（10）：1883.

［10］Tsushima T. Technics of growth hormone receptor assay［J］. Nippon Rinsho，1976，34（3）：461-465.

［11］Gencheva D G，Velikov K P，Veleva P M. Association analysis of nucleotide polymorphisms in growth hormone （GH） and its receptor （GHR） with body weight in Californian rabbits［J］. World Rabbit Science，2022，30（1）：95-102.

［12］Cobanoglu O，Kul E，Gurcan E K，et al. Determination of the association of GHR/AluI gene polymorphisms with milk yield traits in Holstein and Jersey cattle raised in Turkey［J］. Archives Animal Breeding，2021，64（2）：417-424.

［13］鄭嘉輝，冷奇穎，張為露，等. 矮小體型蘆花雞GHR基因突變類型分析及其與正常體型蘆花雞發(fā)育差異研究［J］. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2021，29（10）：1978-1989.

［14］Sahu A R，Eichitra V J，Rajendran R，et al. Association analysis of novel SNPs in exon 10 of the growth hormone receptor gene with growth traits in Indian sheep［J］. Veterinarski Arhiv，2020，90（6）：593-602.

［15］Akhatayeva Z，Li H X，Mao C，et al. Detecting novel Indel variants within the GHR gene and their associations with growth traits in Luxi Blackhead sheep［J］. Animal Biotechnology，2022，33（2）：214-222.

［16］Johansson A，Jonasson I，Gyllensten U. Extended haplotypes in the growth hormone releasing hormone receptor gene （GHRHR） are associated with normal variation in height［J］. PLoS One，2009，4（2）：e4464.

［17］雷初朝，藍賢勇，等. 2個奶山羊品種GHRHR基因多態(tài)性及其與生長發(fā)育性狀關系研究［C］//中國動物遺傳育種研究進展——第十五次全國動物遺傳育種學術(shù)討論會論文集. 楊凌：中國畜牧獸醫(yī)學會，2009：401.

［18］Zhao S P，Jin H，Xu L，et al. Polymorphisms of the growth hormone releasing hormone receptor gene affect body conformation traits in Chinese Dabieshan cattle［J］. Animals，2022，12（13）：1601.