摘要要：【目的】克隆金線蘭NPR1基因家族成員，分析其在根、莖、葉及不同植物生長調節(jié)劑處理下的表達模式?！痉椒ā坎捎肦T-PCR法克隆金線蘭NPR1基因，進行生物信息學分析，并利用實時熒光定量PCR分析其在不同組織及不同植物生長調節(jié)劑處理下的表達?！窘Y果】克隆得到兩條長度分別為1 803 bp和1 401 bp的NPR1基因序列，分別命名為ArNPR1-1和ArNPR1-2。ArNPR1基因在金線蘭不同部位表達具有組織特異性，其在莖中表達較低，在根、葉表達較高。ArNPR1基因對不同植物生長調節(jié)劑SA、MeJA處理的響應模式存在差異；SA處理后12 h和24 h，ArNPR1基因的表達量均上調；MeJA處理后12 h，ArNPR1基因的表達量上調，隨著處理時間的延長，表達量下調?！窘Y論】成功克隆2個金線蘭NPR1基因，明晰了其在不同組織及SA、MeJA處理下的表達特征，為后續(xù)基因功能驗證與應用奠定基礎。

關鍵詞：金線蘭；NPR1；生物信息學分析；表達分析

中圖分類號：S567.239" " " " " " " " " " 文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " 文章編號：2095-5774（2024）05-0403-08

Cloning of NPR1 Gene and Expression Analysis of Resistance Response in

Anoectochilus Roxburghii

Liu Bingqi1，Yan Peipei2，Wang Peiyu2，Li Zunwen2，Wu Mingjun3，Li Hansheng4，

Lin Minshui5，Jiang Jinlan2，Ye Wei2*

（1College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing，Jiangsu 210095，China;

2 Sanming Academy of Agricultural Sciences/ Fujian Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and Innovative Utilization for Mountainous Areas，Sanming，Fujian 365509，China;

3 Shaxian Agriculture and Rural Bureau， Sanming，Fujian 365509，China;

4 Sanming University， Sanming，Fujian 365500，China;

5 Yongan Forestry Bureau， Sanming， Fujian 366038， China ）

Abstract：【Objective】Cloning members of the NPR1 gene family in Anoectochilus roxburghii and analyzing their expression patterns in roots，stems，and leaves，and under different plant growth regulator treatments. 【Method】The NPR1 gene of Anoectochilus roxburghii was cloned using RT-PCR，and bioinformatics analysis was performed. Real time fluorescence quantitative PCR was used to analyze its expression in different tissues and under different plant growth regulator treatments.【Result】Two NPR1 gene sequences with lengths of 1 803 bp and 1 401 bp were cloned and named ArNPR1-1 and ArNPR1-2，respectively. The expression of ArNPR1 gene in different parts of Anoectochilus roxburghii had tissue specificity，with lower expression in the stem and higher expression in the roots and leaves. The response patterns of ArNPR1 gene to different plant growth regulators SA and MeJA treatments varied；The expression level of ArNPR1 gene was upregulated at 12 and 24 hours after SA treatment；After 12 hours of MeJA treatment，the expression level of ArNPR1 gene was upregulated，and with the prolongation of treatment time，the expression level was downregulated.【Conclusion】This experiment successfully cloned two NPR1 genes from Anoectochilus roxburghii and analyzed their expression in different tissues and under SA and MeJA treatments，providing a basis for gene function validation and utility in the future.

Key words：Anoectochilus roxburghii；NPR1；Bioinformatics analysis；Expression analysis

金線蘭（Anoectochilus roxburghii）是蘭科（Orchidaceae）開唇蘭屬植物，富含金線蓮苷［1］，具有抗炎、降血糖、保護肝臟的功效［2］，在廣東，福建等地區(qū)用藥歷史悠久，是閩臺特色中草藥，備受青睞，稱為“藥王”［3］。

植物擁有復雜的免疫系統(tǒng)，是否成功免疫取決于非特異性預先形成和誘導的防御機制以及特異性誘導的免疫反應。非表達病程相關蛋白（Non-expresser of pathogenesis related genes 1，NPR1）在免疫反應功效中起著不可或缺的作用，廣泛參與免疫防御反應，是植物防御信號中的一個重要調節(jié)因子［4］。已有研究表明NPR1 是水楊酸（SA，Salicylic acid）和茉莉酸/乙烯（JA/ET，Jasmonates/Ethylene）反應之間串擾的關鍵要素［5］，其在建立系統(tǒng)獲得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）中起著重要作用［6］。NPR1是SAR的正調節(jié)因子，是參與SAR建立的關鍵基因。NPR1編碼一個錨蛋白重復序列（ankyrin-repeat sequence）的蛋白，屬轉錄調控蛋白，主要調控TGA轉錄因子（TF，TGACG motif-binding factor），從而激活病程相關蛋白基因（Pathogenesis-related gene，PR基因）的表達。

NPR1基因首次在擬南芥中被克隆，目前共鑒定出6個AtNPR1s基因［7］，NPR1基因也存在于其他植物，如水稻（Oryza sataval）［8］、小麥（Triticum aestivum）［9］、煙草（Nicotiana tabacum）［10］等，在雙子葉植物和單子葉植物中過表達擬南芥（Arabidopsis thaliana）NPR1或其同源物可以增強其對多種病原體的抗病性［11］。水稻OsNPR1/NH1在擬南芥中過表達時，顯著增加對病原體的抗性，也導致植株對昆蟲的敏感增加；小麥NPR1直系同源物的過表達增強了抗病性［12］；已有報道均表明NPR1基因在植物免疫方面起著重要作用。

目前已在各種物種中鑒定出NPR1基因，如黃瓜（Cucumis sativus）［13］，胡蘿卜（Daucus carota）［14］，煙草［10］等。已知蘭科植物僅見蝴蝶蘭（Phalaenopsis amabilis）［15］、文心蘭（Oncidium Gower Ramsey）［16］NPR1基因的克隆分析報道，而金線蘭NPR1基因克隆尚未見報道。然而，隨著更多物種NPR1蛋白被發(fā)現，其功能的復雜性和可變性也在增加。因此，本研究對金線蘭NPR1基因家族成員進行克隆，分析其在不同植物生長調節(jié)劑處理與不同組織部位的表達情況，對探究金線蘭抗性機制及培育金線蘭抗性品種具有重要意義。

1 材料與方法

1.1試驗材料

供試的金線蘭無菌苗為 ‘紅霞’，保存于三明市農業(yè)科學研究院藥用植物研究所，培養(yǎng)與繼代參照羅慶國等［17］的方法。

1.2樣品采集處理

將金線蘭幼苗植株清洗消毒處理后移栽至基質土，置于12 h/12 h人工氣候箱，晝夜交替培養(yǎng)3 d。對金線蘭分別噴施100 μmol/L SA、50 μmol/L茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MeJA），并于處理0 h、12 h、24 h時收集葉片，用液氮速凍處理；采集根、莖、葉組織分別液氮處理；每個處理設置3個重復，每個重復10株；液氮速凍后保存于-80℃超低溫冰箱備用。

1.3引物設計

DNAMAN 9.0設計金線蘭Actin內參基因（ArACT）及ArNPR1基因家族成員的引物序列，如表 1所示。以下引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.4" 金線蘭NPR1基因全長克隆

在蛋白質家族pfam數據庫（pfam.xfam.org）下載 NPR1基因家族的種子文件（PF12313），于轉錄組（編號SRX25007209）組裝的cDNA推導的蛋白序列進行隱馬克夫模型（Hidden Markov models，HMMs）搜索，利用所得的候選NPR1序列片段設計特異性引物，擴增得到ArNPR1基因家族成員，提交至NCBI（ncbi.nlm.nih.gov），獲取登錄號。使用MEME工具（http：//meme-suite.org/tools/meme）和NCBI CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在線分析金線蘭NPR1蛋白的保守基序和保守結構域。

1.5" 金線蘭NPR1進化樹分析

利用MEGA 11，將所獲得的ArNPR1基因家族成員的蛋白序列與不同物種蛋白序列采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ；Bootstrap=500）構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，使用Evolview完善進化樹。擬南芥AtNPR1、AtNPR2、AtNPR3、AtNPR4、AtBOP1、AtBOP下載于TAIR（arabidopsis.org），其他近似物種序列包括大豆（Glycine max）GmNPR1-1、GmNPR1-2、葡萄（Vitis vinifera）VvNPR1.2、湖北海棠（Malus hupehensis）MhNPR1、白毛果楊（Populus trichocarpa）PtNPR1、PtNPR2、PtNPR4、PtBOP1、PtBOP2、高粱（Sorghum bicolor）SbNPR1、SbNPR2、SbNPR3、SbBOP1、SbBOP2、甜菜（Beta vulgaris）BvNIM1、煙草NtNPR1、可可（Theobroma cacao）TcNPR1、文心蘭OgNPR1-1、OgNPR1-2、臺灣蝴蝶蘭PaNPR1、小蘭嶼蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris）PeNPR1、小果野蕉（Musa acuminata AAA Group）MaNPR1-A、MaNPR1-B、粳稻（Oryza sativae Japonica Group）OsNPR1、OsBOP2秈稻（Oryzae sativa Indica Group）OsNPR1/NH1下載于NCBI數據庫。

1.6" 金線蘭NPR1基因表達分析

利用TRIzol法提取金線蘭組織RNA，用反轉錄試劑盒（Hieff qPCR SYBR Green Master Mix）將RNA反轉錄為cDNA。利用ABI QuantStudio 3熒光定量 PCR 儀進行熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測。反應體系（20.0 μL）：cDNA 1.0 μL，上下引物各1.0 μL，SYBRⅡ 10 μL，ddH2O補足至20.0 μL。擴增程序：94℃預變形 3 min，94℃變性 30 s，56℃退火30 s，72℃延長1 min，40 個循環(huán)72℃反應10 min。以Actin為內參，每個處理設置3個重復。不同處理的相對表達量采用2-△△Ct計算，利用SPSS軟件進行分析，用單因素ANOVA計算樣品的差異顯著性，用Origin 2021繪制多因子柱狀圖。

2 結果與分析

2.1" 金線蘭NPR1基因全長克隆

克隆得到兩條長度分別為1 803 bp和1 401 bp的核酸序列，分別編碼600個和466個氨基酸。開放閱讀框分別為1 686 bp和1 392 bp，分別編碼561個和463個氨基酸。NCBI的 blastn比對結果顯示，2條核酸序列與鐵皮石斛、蝴蝶蘭NPR1序列具有較高一致性（表 2）。將2條序列命名為ArNPR1-1和ArNPR1-2，提交NCBI，獲得登錄號PQ148128和PQ189702。利用MEME和NCBI CDD進行保守基序與保守結構域預測，結果顯示ArNPR1-1、ArNPR1-2蛋白均有6個保守基序（motif 1-6）（圖1 A）。保守結構域預測ArNPR1-1、ArNPR1-2均有NPR1-like-C、BTB-POZ、ANKYR結構域（圖1 B），是典型的NPR1家族蛋白。

2.2" 金線蘭NPR1進化樹分析

為探究ArNPR1基因家族成員與其他物種NPR1基因家族成員的進化關系，利用MEGA對不同物種NPR1蛋白序列與ArNPR1-1、ArNPR1-2共同構建系統(tǒng)進化樹，如圖 2所示。結果表明2個ArNPR1蛋白與文心蘭、蝴蝶蘭、高粱的親緣關系較為接近，且聚類在NPR1支，表明所克隆ArNPR1基因為NPR1類型。

2.3 金線蘭NPR1基因表達分析

利用qRT-PCR檢測ArNPR1-1、ArNPR1-2基因在金線蘭不同組織及植物生長調節(jié)劑SA、MeJA處理下的表達模式，結果如圖 3所示。在不同的組織部位，ArNPR1-1、ArNPR1-2基因在莖的相對表達量較低，而在根、葉較高（圖3 A）。ArNPR1-1、ArNPR1-2基因在不同處理中均有響應表達。噴施SA處理，ArNPR1-1、ArNPR1-2基因在處理后12 h、24 h的相對表達量上升，說明ArNPR1基因受到SA的誘導表達（圖3 B）。噴施MeJA，ArNPR1-1、ArNPR1-2基因的相對表達量均在12 h顯著上升，分別為0 h的8倍、2.8倍，至24 h下降（圖3 C）。

3 討論

NPR1是植物防御系統(tǒng)的重要調控因子［18］，處于植物抗病反應信號途徑的關鍵節(jié)點，常作為轉錄激活子發(fā)揮作用從而提高植物抗病性。本試驗通過克隆得到兩條金線蘭ArNPR1-1、ArNPR1-2基因序列，并對其進行生物信息學分析，NPR1蛋白包含BTB/POZ結構域、ANK錨蛋白重復序列以及NPR1-like-C 3個結構域［19-21］，本試驗發(fā)現ArNPR1-1 、ArNPR1-2蛋白均有NPR1-like-C、BTB-POZ、ANKYR結構域，這3個結構域在金線蘭中較為保守，ArNPR1-2蛋白還有DUF3420結構域，也說明ArNPR1-1與ArNPR1-2蛋白結構存在差異。BTB、ANKYR結構域與TGA蛋白互作相關［10］，因此NPR1基因對提升植物抗性可能具有重要意義，多重序列比對發(fā)現其呈現較高的保守性，預示著功能的相似。系統(tǒng)進化樹分析顯示ArNPR1蛋白與文心蘭、蝴蝶蘭、高粱親緣關系較接近。其中ArNPR1-1與OgNPR1-1、OgNPR1-2、PaNPR1、PeNPR1聚為一支，有研究發(fā)現，SAR誘導后，文心蘭OgNPR1-1、OgNPR1-2會產生與擬南芥相同的系統(tǒng)性抗性［16］，推測ArNPR1-1可能參與SAR的負調控［22］；而ArNPR1-2與SbNPR3聚為一支，可能是因為NPR1基因的保守性。

有研究表明，NPR1基因還參與器官發(fā)育，而擬南芥AtNPR5基因具有調控葉片生長發(fā)育功能［23］，這與本試驗中金線蘭根莖葉部位qRT-PCR分析結果：ArNPR1-1、ArNPR1-2基因相對表達量在不同組織存在明顯差異，且在莖的相對表達量較低，而在根、葉較高結果相吻合，也與NPR1基因在玉米中表達具有相似性［24］，而擬南芥AtNPR1無組織表達特異性，這可能是因為NPR1基因家族成員發(fā)生了進化，且在不同物種中的組織表達具有差異。

植物的抗病性主要受2種激素（SA、JA）的調控，且植物中研究最多的誘導防御反應之一是SAR，SAR在局部感染病原體后觸發(fā)，引起過敏性壞死，并且對廣泛的植物病原體有效。SA誘導的SAR不僅促使編碼發(fā)病機制相關PR蛋白的基因在內的大量基因的上調，其也在植物防御起重要作用，病原體則通過攻擊NPR1及其輔助調節(jié)因子去抑制SAR有效防御途徑，從而削弱植物抗病性［25］。SAR的激活可以抑制植物中的JA信號傳導，這與SA存在拮抗關系［5］，而NPR1基因、SA、抗性三者關系緊密。NPR1在SA下游信號傳遞具關鍵作用，由此通過SAR途徑來提高植物抗性［26］。本試驗的基因表達分析表明，SA處理能誘導ArNPR1基因的上調表達。有研究表明，外源施加MeJA后可誘導野生型擬南芥對灰霉菌（B.cinerea）的抗性。本試驗發(fā)現ArNPR1基因在MeJA誘導下，相對表達量隨著時間延長先上升而后下降，這與在文心蘭中NPR1基因均能響應SA、MeJA表達的試驗結論一致［16］，但是否SA、MeJA處理提高了金線蘭的抗逆性還需進一步分析。

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（責任編輯：馮" "新）

收稿日期：2024-09-06

基金項目：福建省科技計劃項目（2023S0018、2023N0047、2024N5008）；福建省省級財政林業(yè)專項資金（閩財資環(huán)指［2020］10號）；三明市科技計劃項目（2023-N-6、2023-N-19）

作者簡介：*為通訊作者，葉煒（1980-），男，副研究員，博士，主要從事園藝植物生物技術研究，E-mail：yewei922@qq.com。

劉冰琪（2002-），女，碩士研究生，主要從事園藝植物生物技術研究，E-mail：2098134008@qq.com