文章編號：1671-3559（2024）04-0429-10DOI：10.13349/j.cnki.jdxbn.20240412.001

摘要： 針對全球藻類日益增多以及不可再生能源短缺的現(xiàn)狀，綜述藻類的資源化利用及生物制氫技術(shù)

，包括預(yù)處理方法以及發(fā)酵制氫影響因素等，目前研究成果顯示：不同預(yù)處理條件下藻類厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫結(jié)果不同，綜合運用多種預(yù)處理方法提高藻類水解效率可以獲得到更高的產(chǎn)氫量；發(fā)酵過程影響因素的優(yōu)化有利于進一步提高藻類厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的效率。指出藻類作為一種重要的厭氧發(fā)酵原料，未來的研究重點應(yīng)根據(jù)當(dāng)前藻類厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫技術(shù)存在的主要問題，采取提高制氫效率的策略。

關(guān)鍵詞： 生物制氫； 厭氧發(fā)酵； 藻類； 氫化酶

中圖分類號： X522； X524； X55

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

開放科學(xué)識別碼（OSID碼）：

Research Progresses on Hydrogen Production by

Anaerobic Fermentation of Algae

LIU Yuanyuan1， LI Suyue1， MU Hui1， YANG Xi2， ZHAO Wei3， ZHANG Yongfang1

（1. School of Water Conservancy and Environment， University of Jinan， Jinan 250022， Shandong， China;

2. Everbright Water Jinan Co.， Ltd.， Jinan 250031， Shandong， China;

3. Shandong Academy of Environmental Science Co.， Ltd.， Jinan 250013， Shandong， China）

Abstract： Based on the current situation of the increasing number of algae and non-renewable energy shortage， the resource utilization of algae and biological hydrogen production technology were reviewed， including pretreatment methods， influencing factors of fermentation hydrogen production， etc. The existing research results show that the hydrogen production results are different under different pretreatment conditions， and the comprehensive application of multiple pretreatment methods improved the hydrolysis efficiency of algae resulted in higher hydrogen production. The optimization of the factors affecting the fermentation process is conducive to further improving the efficiency of hydrogen production by algal anaerobic fermentation. It is pointed out that algae is an important raw materials for anaerobic fermentation， and the future research should be focused on the main problems of algal anaerobic hydrogen production technology and strategies to improve the hydrogen production efficiency.

Keywords： biological hydrogen production; anaerobic fermentation; algae; hydrogenase

人類社會的經(jīng)濟發(fā)展和工業(yè)化進程對大自然造成了許多干擾，水體中氮、 磷營養(yǎng)成分的增加，造成淡水、 海水的富營養(yǎng)化，為水中藻類的爆發(fā)性生長提供了有利條件。海洋中約有4 000種浮游藻類，其

收稿日期： 2023-02-08""""""""" 網(wǎng)絡(luò)首發(fā)時間：2024-04-15T14：10：18

基金項目： 國家自然科學(xué)基金項目（52070089）

第一作者簡介： 劉媛媛（1998—），女，山東煙臺人。碩士研究生，研究方向為厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫。E-mail： 1754173403@qq.com。

通信作者簡介： 張永芳（1979—），女，山東泰安人。副教授，博士，研究方向為有機廢水降解與資源化再利用。E-mail： chm_zhangyf@ujn.edu.cn。

網(wǎng)絡(luò)首發(fā)地址： https：//link.cnki.net/urlid/37.1378.N.20240412.1531.002

中約300種是可導(dǎo)致海水變色的赤潮種。赤潮是因大型藻類家族中的赤潮藻在特定環(huán)境條件下爆發(fā)性增殖或高度聚集而引起水體變色的一種有害生態(tài)現(xiàn)象，不僅對海洋生態(tài)平衡、 海洋漁業(yè)、 水產(chǎn)資源造成破壞，而且還危害人類身體健康。藻華爆發(fā)是局部的微藻擴散，發(fā)生于藻類最佳的生長條件及來自捕食的壓力減輕的情況下。當(dāng)特定的微藻類（特別是藍(lán)藻）達(dá)到很高的富集量時，會產(chǎn)生各種有害或有毒物質(zhì)，導(dǎo)致食物鏈破壞和動物死亡，甚至危害人類健康。

藻類是地球表面最原始、 最主要的光合生命形式［1］，在生態(tài)系統(tǒng)的能量流動中發(fā)揮著重要作用。人類對藻類資源的開發(fā)利用已從傳統(tǒng)的食品、 藥品、 肥料、 飼料、 食品添加劑等領(lǐng)域轉(zhuǎn)向生態(tài)恢復(fù)、 可再生能源領(lǐng)域，如清理海洋污染、 抑制溫室氣體排放、 制備生物柴油、 沼氣、 生物油、 生物氫等［2］。

煤炭、 石油、 天然氣等生化石燃料的大量使用，造成了能源短缺，且化石燃料燃燒會產(chǎn)生二氧化碳等大氣污染物，加劇了環(huán)境壓力［3］，迫使人們尋找新型環(huán)保、 可再生替代能源。氫的燃燒只產(chǎn)生水蒸氣，并且熱值較大（122 kJ/g），是甲烷熱值的2.42倍，因此氫能不僅可以滿足未來世界的能源需求，還可以減少由化石燃料燃燒產(chǎn)生的溫室氣體排放，被認(rèn)為是未來低碳或無碳能源系統(tǒng)燃料市場的重要組成部分。氫能可以來源于一次能源，也可以利用可再生的生物質(zhì)生產(chǎn)［4］，其中利用藻類進行厭氧發(fā)酵制氫可以解決碳積累和全球變暖問題，有效減少碳排放，有助于實現(xiàn)我國碳達(dá)峰、 碳中和的戰(zhàn)略目標(biāo)，還能夠解決赤潮、 藻華等生態(tài)環(huán)境問題，具有廣闊的應(yīng)用前景。本文中對藻類的資源化利用及生物制氫技術(shù)進行綜述，重點分析藻類發(fā)酵的預(yù)處理方法及產(chǎn)氫影響因素，并分析藻類厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫工藝面臨的挑戰(zhàn)與發(fā)展。

濟南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）第38卷

第4期劉媛媛，等：藻類厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫技術(shù)的研究進展

1" 藻類產(chǎn)氫的預(yù)處理

不同種類藻類的蛋白質(zhì)、碳水化合物以及脂質(zhì)成分及組成［5-6］如表1所示。微型藻類是單細(xì)胞生物，具有復(fù)雜而堅固的細(xì)胞壁，細(xì)胞壁主要由多糖和糖蛋白組成，這2種化合物的生物可降解性很低，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)主要由蛋白質(zhì)（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%～71%）、 碳水化合物（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%～57%）和脂質(zhì)（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%～22%）組成［7］。而大型藻類主的脂質(zhì)含量較低（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～5%）［8］。在厭氧消化中，水解是整個過程的控制步驟， 在這一階段， 難以降解的化合物，如木質(zhì)素、 纖維素和細(xì)胞壁發(fā)生降解。這種降解本質(zhì)上是不可溶顆粒物的溶解和有機聚合物的生物分解。水解取決于多種因素， 如底物的顆粒大小、 pH和底物膜的酶滲透性等。對于微型藻類來說， 酶攻擊底物是通過破壞細(xì)胞壁來實現(xiàn)的， 而對于大型藻類來說， 可以通過增大比表面積和破壞晶體結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)［9］。預(yù)處理可使木質(zhì)素分解破壞藻類細(xì)胞壁， 使微生物更容易接觸到纖維素， 加快細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜碳水化合物的水解，促進可發(fā)酵糖的釋放， 從而提高發(fā)酵產(chǎn)氫效率［10］。常見的預(yù)處理方法包括物理預(yù)處理、 生物預(yù)處理、 化學(xué)預(yù)處理和組合預(yù)處理等［8］。

1.1" 物理預(yù)處理

在藻類預(yù)處理方面， 物理技術(shù)在破壞細(xì)胞壁， 減小藻類粒徑、 結(jié)晶度， 增大比表面積， 縮短消化周期， 提高生物燃料生產(chǎn)效率方面非常有效， 加熱、 研磨、 超聲波、 微波等是常見的物理預(yù)處理方法。 在熱預(yù)處理過程中， 化學(xué)鍵在高溫下被破壞， 導(dǎo)致細(xì)胞成分（細(xì)胞壁、 細(xì)胞膜等）的溶解，釋放單體葡萄糖，提高產(chǎn)氫量。Yin等［11］對大型藻類海帶Saccharina japonica進行加熱預(yù)處理（121 ℃高溫高壓蒸汽爆破）30 min，產(chǎn)氫速率為7.92 mL/h，比對照組的產(chǎn)氫速率（4.97 mL/h）提高了約60%。

研磨預(yù)處理通過將生物質(zhì)粉碎成小顆粒，增大比表面積，釋放出糖，從而優(yōu)化生物能源生產(chǎn)［12］。Ortigueira等［11］、 Batista等［13］分別采用研磨（70 ℃干燥，過孔徑為0.5 mm的篩）和加熱（121 ℃高溫高壓蒸汽爆破）對微型藻類斜生柵藻Scenedesmus obliquus進行預(yù)處理，以丁酸梭菌Clostridium butyricum DSM 10702為接種物進行批量實驗，每克揮發(fā)固體含量（VS）產(chǎn)氫量分別為35.0、 113.1 mL。在更高的溫度和壓力下，微型藻類細(xì)胞釋放出貯藏的多糖，更有利于藻類產(chǎn)氫［13］，研磨預(yù)處理的能源需求大，經(jīng)濟成本高。高溫反應(yīng)促進生物質(zhì)溶解和發(fā)酵產(chǎn)氫，但溫度超過180 ℃會促進抑制劑（糠醛、 羥甲基糠醛和酚）的生成，降低生物轉(zhuǎn)化效率，目前這些副產(chǎn)物對藻類產(chǎn)氫的影響相關(guān)研究較少［12］。

微波預(yù)處理可以將生物質(zhì)中的水迅速加熱到沸騰狀態(tài)， 從而在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生壓力， 氫鍵斷開，使可用于發(fā)酵的可溶性蛋白質(zhì)和碳水化合物濃度增加。Uma Rani等［14］用微波預(yù)處理活性污泥，輻照能量從108 kJ/L增加到2 916 kJ/L時，可溶性蛋白質(zhì)量濃度從783 mg/L增加到1 846 mg/L，可溶性碳水化合物質(zhì)量濃度從322 mg/L增加到464 mg/L。

超聲預(yù)處理是利用超聲波對生物質(zhì)的快速壓縮過程，在細(xì)胞壁中形成空腔或微泡隨后破裂，破壞細(xì)胞膜，改善微生物獲取可發(fā)酵糖，提高生物產(chǎn)氫率。Park等［15］在超聲波能量為200 J/mL時對小球藻Chlorella vulgaris進行預(yù)處理，與未處理的樣品相比，超聲處理樣品的生物氣產(chǎn)量提高了90%。超聲預(yù)處理適用于濕生物質(zhì)，小球藻所含的水有利于聲波在固-液界面之間的傳播。Passos等［16］采用不同預(yù)處理方法處理微型藻類綠藻和硅藻，熱預(yù)處理后甲烷產(chǎn)量顯著提高（72%），其次是水熱預(yù)處理（28%）和微波預(yù)處理（21%）。從技術(shù)經(jīng)濟角度來看，熱預(yù)處理可以提高藻類糖化和發(fā)酵的效率，是目前最具可行性和吸引力的技術(shù)，未來的研究工作應(yīng)集中在熱預(yù)處理技術(shù)在藻類工業(yè)化產(chǎn)氫方面的應(yīng)用［12］。

1.2" 化學(xué)預(yù)處理

化學(xué)預(yù)處理是指將酸、 堿、 氧化劑等應(yīng)用于生物質(zhì)，促進細(xì)胞壁分解、 聚合物溶解和厭氧發(fā)酵過程［10］。酸預(yù)處理既可以用作酶解前處理，也可以水解生物質(zhì)， 通過化學(xué)鍵斷裂釋放木質(zhì)素單體和單糖［17-18］。酸預(yù)處理效果取決于酸的種類、 濃度、 固液比和溫度等， 通常在高溫、 高壓下進行， 常使用無機酸， 如硫酸、 硝酸、 鹽酸和磷酸等。稀酸預(yù)處理產(chǎn)生的抑制劑比濃酸預(yù)處理的少， 且濃酸具有腐蝕性， 一般采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%～2%的稀酸。 Liu等［19］采用氯化氫的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的鹽酸溶液對小球藻Chlorella vulgaris ESP6預(yù)處理20 min，產(chǎn)氫量為1 424 mL/L，未經(jīng)處理的對照組的產(chǎn)氫量僅為470 mL/L。

堿預(yù)處理可使木質(zhì)素皂化、 碳水化合物中酯鍵斷裂，降低聚合度和結(jié)晶度［10， 20］，使生物質(zhì)的孔隙度和內(nèi)表面積增大，殘留的堿還有助于防止發(fā)酵產(chǎn)酸過程中pH減小。NaOH和KOH是常用的堿。藍(lán)藻Dunaliella tertiolecta對生物降解具有較高的抗性，Cai等［20］采用NaOH的濃度為6 mol/L的溶液對藍(lán)藻預(yù)處理30 min，在pH為7.5、 溫度為35 ℃的條件下進行批量實驗，每克VS的產(chǎn)氫量為（94±4）mL，未經(jīng)處理的對照組每克VS的產(chǎn)氫量為（28±2）mL，堿預(yù)處理后還原糖去除率提高（大于95%），產(chǎn)氫量顯著增加。

Yin等［21］分別采用H2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%和NaOH的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的溶液對大型藻類海帶Saccharina japonica預(yù)處理30 min，產(chǎn)氫速率分別為6.82、 3.64 mL/h，對照組的產(chǎn)氫率為4.97 mL/h，表明酸預(yù)處理對藻類厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫效果顯著優(yōu)于堿預(yù)處理。在添加酸或堿的體系中生成了NaCl，Na+影響微生物細(xì)胞膜的滲透壓，因此影響了發(fā)酵過程。高濃度的Na+會改變藻類中有機物的代謝途徑，有利于乳酸的產(chǎn)生，同時抑制丁酸的生成，引起毒性抑制，且堿預(yù)處理組的抑制效果最明顯［22］，因此，酸預(yù)處理在加速半纖維素溶解和脫木質(zhì)素方面比堿預(yù)處理更有效。

氧化預(yù)處理是利用氧化劑的強氧化性和溶解性來溶解生物質(zhì)。 與酸、 堿預(yù)處理不同的是，氧化劑分解過程中不形成抑制性化合物，如H2O2可以打破糖苷鍵， 將復(fù)雜的碳水化合物分解為單糖。Roy等［23］采用H2O2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的溶液對小球藻預(yù)處理2 h， 每克VS的產(chǎn)氫量為63 mL， 明顯小于酸預(yù)處理組的產(chǎn)氫量760 mL， 原因可能是藻類生物質(zhì)中可發(fā)酵糖的過度氧化， 導(dǎo)致底物的氫轉(zhuǎn)化效率降低。 氧化預(yù)處理的弱勢在于氧化劑用量較大， 成本昂貴。

1.3" 生物預(yù)處理

生物預(yù)處理是利用微生物和酶破壞生物質(zhì)細(xì)胞壁并釋放細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)， 提高生物產(chǎn)氫率， 作用機制［24］如圖1所示。酶相對廉價， 對環(huán)境友好， 能提高藻類生物質(zhì)的厭氧生物降解［25］。酶的選擇取決于組成細(xì)胞壁的主要化合物，如纖維素、 半纖維素、 果膠、 糖蛋白等。Yun等［26］采用食物垃圾發(fā)酵廢液（含粗水解細(xì)胞外酶）對小球藻進行酶解預(yù)處理，每克細(xì)胞干重（DCW）的產(chǎn)氫量最高為43.1 mL，對照組的產(chǎn)氫量僅為30.3 mL，此外，粗水解細(xì)胞外酶的添加使藻類水解滯后期縮短，藻類水解更徹底，產(chǎn)氫率更高。Wieczorek等［27］采用Onozuka R-10酶（SERVA Electrophoresis， Cat.Nr.1641）與Macerozyme R-10酶（SERVA Electrophoresis， Cat.Nr.28302）聯(lián)合預(yù)處理小球，每克VS的產(chǎn)氫量為135 mL，高于單酶Onozuka R-10處理的（39 mL）和Macerozyme R-10處理的（62 mL）， 與單酶處理相比， 2種酶混合預(yù)處理可使生物質(zhì)釋放出更多的碳水化合物（如葡萄糖）， 產(chǎn)氫量更高。 與物理或化學(xué)預(yù)處理相比， 生物預(yù)處理具有底物和反應(yīng)特異性、 能量需求低、 不產(chǎn)生有毒化合物和產(chǎn)氫量大等潛在優(yōu)勢［22］， 但也存在預(yù)處理條件苛刻、 作用周期長等關(guān)鍵技術(shù)問題， 需要仔細(xì)控制反應(yīng)條件， 提高其在經(jīng)濟上的可行性［28］。

1.4" 組合預(yù)處理

單一預(yù)處理存在較多限制因素， 如： 物理預(yù)處理能源利用效率低； 化學(xué)預(yù)處理使用的酸、 堿等試劑具有毒性和腐蝕性， 反應(yīng)器需要特殊材料建造， 成本較高； 生物預(yù)處理易受外界溫度、 pH等環(huán)境條件影響造成酶失活， 不易控制［29］。 采用不同預(yù)處理方法的組合可以更有效地分解生物質(zhì)［8］。 熱化學(xué)預(yù)處理是常見的組合預(yù)處理方法， 可以提高酸、 堿對生物質(zhì)的水解效率。 Roy等［30］采用HCl的濃度為200 mmol/L的溶液在溫度121 ℃時對小球藻進行熱預(yù)處理， 每克VS的產(chǎn)氫量為958 mL， 高于僅采用HCl（濃度為50 mmol/L）預(yù)處理的產(chǎn)氫量760 mL。 在酸-熱預(yù)處理條件下， 小球藻淀粉水解成不同含量的可溶性糖（纖維二糖、 葡萄糖等）， 在濃度為200 mmol/L的HCl的作用下， 小球藻淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖的轉(zhuǎn)化效率達(dá)到100%， 產(chǎn)氫效果好。 Yang等［31］采用NaOH的質(zhì)量濃度為8 g/L的溶液在溫度100 ℃下對微型藻類柵藻Scenedesmus預(yù)處理8 h， 在pH為6.3、 溫度為37 ℃的條件下進行批量實驗， 每克VS的產(chǎn)氫量為45.54 mL， 是未經(jīng)預(yù)處理的產(chǎn)氫量（16.99 mL）的3倍， 也明顯大于僅采用NaOH預(yù)處理的產(chǎn)氫量（16.89 mL）。 與對照組相比， 堿預(yù)處理可使藻類水解滯后期縮短， 但熱預(yù)處理對藻類水解滯后期和產(chǎn)氫量都有明顯影響， 預(yù)處理溫度越高， 藻類水解滯后期越短， 產(chǎn)氫量越大， 產(chǎn)氫菌能夠快速適應(yīng)新的環(huán)境。

圖2為采用不同方法預(yù)處理的藻類掃描電子顯微鏡圖像［32］。 從圖中可以看出： 用于熱-酸預(yù)處理的酸的濃度越高，細(xì)胞的增溶作用越明顯［圖2（b）、 2（c）］； 經(jīng)H2O2氧化處理的藻類仍能看到很多的完整細(xì)胞［圖3（d）］； 物理預(yù)處理的藻類的細(xì)胞碎片最少［圖2（e） 、 2（f）］。上述結(jié)果說明， 熱-酸聯(lián)合預(yù)處理對細(xì)胞的分解作用最強，其次是化學(xué)預(yù)處理，物理預(yù)處理效果最差。通過表2中不同預(yù)處理方法對藻類發(fā)酵產(chǎn)氫效果的對比可知，熱預(yù)處理效果最好，產(chǎn)氫量是研磨預(yù)處理的約3.2倍，斜生柵藻暴露在更高的溫度和壓力下可釋放出貯藏的多糖［33-34］。結(jié)合表中數(shù)據(jù)及上述分析，組合預(yù)處理的效果比物理、 化學(xué)預(yù)處理的好，熱-酸、 熱-堿等組合預(yù)處理能提高酸、 堿對生物質(zhì)的水解效率，使產(chǎn)氫量顯著增加［19］。

2" 藻類發(fā)酵產(chǎn)氫的影響因素

2.1" 溫度

溫度是影響微生物發(fā)酵過程的關(guān)鍵因素， 對微生物的生長速率、 底物水解速率和產(chǎn)氫速率具有顯著影響。 在厭氧發(fā)酵過程中， 根據(jù)微生物適宜的生長溫度不同， 可將發(fā)酵溫度區(qū)間分為15～27 ℃（低溫）、 30～45 ℃（中溫）、 50～60 ℃（嗜熱）和高于60 ℃（極端嗜熱）等［37］。中溫制氫在熱力學(xué)上是有利的。Ortigueira等［11］采用大型藻類斜生柵藻Scenedesmus obliquus在不同溫度下進行厭氧發(fā)酵， 在底物質(zhì)量濃度為10～50 g/L、 溫度為37 ℃時， 每克VS的產(chǎn)氫量為5.4～34.8 mL， 溫度升高到58 ℃時，產(chǎn)氫量減小為0.7～15.3 mL。斜生柵藻的主要成分是葡萄糖和淀粉，溫度為37 ℃時對葡萄糖底物的發(fā)酵更有效，而溫度為58 ℃時對木糖、 木聚糖等底物的發(fā)酵效率更高。Park等［38］采用未經(jīng)熱處理的污泥分別在溫度為25、 35、 45、 55 ℃時對大型藻類海帶Saccharina japonica進行分批實驗， 處理溫度為35 ℃時的總產(chǎn)氫量最高（253.8 mL）， 45 ℃時的總產(chǎn)氫量最低， 兩者相差約1.7倍。此外， 處理溫度為25 ℃時的產(chǎn)氫集中在發(fā)酵時間的36～72 h， 45 ℃時的產(chǎn)氫集中在12～60 h， 55 ℃時的產(chǎn)氫集中在36～48 h，35 ℃時的海藻產(chǎn)氫發(fā)生在12 h之前，此時藻類水解停滯期最短，產(chǎn)氫量最大。Nguyen等［39］研究海帶Saccharina japonica厭氧發(fā)酵和微生物電解池聯(lián)合制氫工藝， 當(dāng)處理溫度從25 ℃升高到40 ℃， 最大電流密度從1.1 mA/cm2增加到2.1 mA/cm2， 產(chǎn)氫量從（285.2±9.4） mL/L增加到（449.7±18.4）mL。 結(jié)果表明， 處理溫度為25～40 ℃時，升高溫度對電解池階段產(chǎn)氫是有利的，較高的溫度有利于底物水解，加快生物膜中質(zhì)子的傳輸速率，促進產(chǎn)氫，但是，厭氧發(fā)酵階段在35 ℃時產(chǎn)氫最優(yōu)，當(dāng)溫度升高到40 ℃時，產(chǎn)甲烷菌活性增加，會消耗氫以生成甲烷。

2.2" pH

目前大部分的藻類厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫研究都是在酸性或中性的初始條件下進行的［40］，藻類可以在pH為4.0～10.0的環(huán)境中生長。pH是影響氮酶、 氫酶等產(chǎn)氫酶活性的因素之一，不同pH時細(xì)胞代謝途徑不同，會產(chǎn)生各種具有抑制產(chǎn)氫作用的副產(chǎn)物［41］，因此選擇最適pH方可獲得最大產(chǎn)氫量。在海帶Saccharina japonica厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的分批實驗中，由于揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）的產(chǎn)生，培養(yǎng)基的pH逐漸減小到5.4， 因此需要控制培養(yǎng)液的pH以提高產(chǎn)氫量。Park等［42］分別以檸檬酸鹽、 磷酸鹽和三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽為緩沖液將pH分別控制在4.0～5.5、 6.0～7.5和8.0～8.5，研究pH對產(chǎn)氫量的影響，結(jié)果表明，pH為7.5時產(chǎn)氫量最高可達(dá)434.9 mL/L，pH為4時產(chǎn)氫量幾乎為0，pH過小時微生物的代謝途徑發(fā)生改變，中間產(chǎn)物生成途徑轉(zhuǎn)移（乙酸轉(zhuǎn)變成丁酸），導(dǎo)致產(chǎn)氫量降低。Nguyen等［39］研究海帶Saccharina japonica厭氧發(fā)酵和微生物電解池聯(lián)合制氫工藝，初始pH從5增大到8，電流密度增大，每克VS的產(chǎn)氫量從（223.0±10.6） mL顯著增大到（455.5±12.9） mL，pH為9時每克VS的產(chǎn)氫量下降到（370.1±9.6）mL。聯(lián)合反應(yīng)器中的發(fā)酵菌和胞外產(chǎn)電菌都易受酸、 堿環(huán)境的影響，而反應(yīng)器在微堿性環(huán)境（pH=8）中效果更好。雖然酸性環(huán)境（pH較小）對產(chǎn)氫反應(yīng)的熱力學(xué)是有利的，但酸性過大會抑制發(fā)酵菌的活性，導(dǎo)致厭氧發(fā)酵階段VFAs產(chǎn)量較低，而電解池需要VFAs作為底物，最終將導(dǎo)致微生物電解池性能較差。此外，在微堿性條件下厭氧發(fā)酵階段的化學(xué)需氧量（COD）去除率也是最大的。

2.3" 碳氮質(zhì)量比

基質(zhì)的碳氮質(zhì)量比（碳氮比）是厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的一個重要指標(biāo)。碳氮比過大會阻礙厭氧發(fā)酵細(xì)菌的生長和代謝， 導(dǎo)致底物利用和產(chǎn)氫不足； 碳氮比過小，說明基質(zhì)含有過量的氮源（蛋白質(zhì)）， 可能導(dǎo)致氨抑制， 不利于產(chǎn)氫［43］。微型藻類生物質(zhì)的最主要的成分是蛋白質(zhì)， 其次是碳水化合物和脂類， 這一組成特點使得微型藻類的碳氮比很小， 可能會阻礙發(fā)酵過程。研究人員采用高碳氮比基質(zhì)與微型藻類共發(fā)酵產(chǎn)氫來緩解這一問題［44］。Xia等［45］研究了小球藻與木薯淀粉混合生物質(zhì)的產(chǎn)氫能力， 以純木薯淀粉為原料時， 每克總揮發(fā)固體含量（TVS）的產(chǎn)氫量為（155.0±14.2） mL， 產(chǎn)氫速率為（8.73±1.62） mL/h， 原因是底物中氮源不足， 產(chǎn)氫菌的生物活性和生長受到嚴(yán)重抑制。 當(dāng)添加小球藻至碳氮比為25.3時， 每克TVS的產(chǎn)氫量為（276.2±11.4） mL， 產(chǎn)氫速率為（25.46±1.16） mL/h，表明氮源增加可以有效提高產(chǎn)氫菌的生物活性和生長速率，從而提高產(chǎn)氫量。當(dāng)碳氮比為15.6時，每克TVS的產(chǎn)氫量下降為（266.0±1.1） mL，而產(chǎn)氫速率增加到（31.96±1.42） mL/h， 其原因是， 小球藻的增加提供了更多的氮源，從而促進細(xì)胞生長，提高產(chǎn)氫速率。氫主要由是碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生的，木薯淀粉的減少導(dǎo)致還原糖含量減少，最終導(dǎo)致產(chǎn)氫量降低。當(dāng)碳氮比降低至8.4時，每克TVS的產(chǎn)氫量顯著降低至（179.4±1.0） mL，產(chǎn)氫速率變化不大，氮源過多、碳源不足是導(dǎo)致產(chǎn)氫量降低的主要原因。大型藻類碳水化合物含量高，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)含量低，將微型藻類與大型藻類共發(fā)酵，可以有效提高產(chǎn)氫量。Xia等［46］采用不同比例的海帶Laminaria digitata與螺旋藻Arthrospira platensis進行厭氧共發(fā)酵實驗，當(dāng)海帶與螺旋藻的質(zhì)量比為0∶100時，碳氮比為4.4，每克VS產(chǎn)氫量為（43.0±1.2）mL，碳水化合物的含量低導(dǎo)致了產(chǎn)氫量較低。當(dāng)海帶與螺旋藻的質(zhì)量比為90∶10時，碳氮比為26.2，每克VS的產(chǎn)氫量提高為（83.9±3.6）mL，這是由于螺旋藻含有豐富的蛋白質(zhì)，因此可以在發(fā)酵過程中作為氮源，促進厭氧發(fā)酵菌的活性和生長。此外，蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生氨，氨溶解于水中，中和了多余的H+，對pH減小有緩沖作用，有利于產(chǎn)氫。當(dāng)海帶與螺旋藻的質(zhì)量比為100∶0時，碳氮比為28.6，每克VS的產(chǎn)氫量為（83.5±3.8）mL，高碳氮比使碳水化合物轉(zhuǎn)化為VFAs導(dǎo)致pH顯著減小，厭氧發(fā)酵細(xì)菌活性降低，氫化酶穩(wěn)定性降低，因此產(chǎn)氫量減少。

2.4" 納米顆粒

納米顆粒不僅可以為藻類厭氧發(fā)酵過程中的酶和輔酶提供必需的微量元素（如Fe、 Ni、 Co、 Mn等），提高微生物活性［47］，而且可以對發(fā)酵過程中的酶起到固定化作用，固定化后酶的穩(wěn)定性提高，活性增強，還可以促進纖維素的水解，溶解細(xì)胞壁釋放內(nèi)容物，從而提高生物產(chǎn)氫量。氫化酶是厭氧發(fā)酵過程中的關(guān)鍵酶，主要有［Fe-Fe］氫化酶和［Ni-Fe］氫化酶2種類型［6］，［Fe-Fe］氫化酶主要催化H+還原生成氫分子，也可以催化氫分子的氧化。［Ni-Fe］氫化酶催化耗氫反應(yīng)，消耗的氫分子被氧化為H+。圖3為2種酶活性位點圖。由圖可以看出，［Fe-Fe］酶活性位點有1個與多肽連接的蛋白質(zhì)亞基，這一獨特結(jié)構(gòu)使其比其他產(chǎn)氫酶的效率提高了100倍［48］。Zaidi等［49］研究了幾種納米顆粒（鎳、 鈷、 氧化鐵、 氧化鎂）對滸苔Enteromorpha厭氧發(fā)酵產(chǎn)生物氣的影響，與對照組相比，添加氧化鐵、 鎳、 鈷和氧化鎂納米顆粒對生物氣產(chǎn)量的累計增幅分別為28%、 26%、 9%和8%。鎳、 鐵是［Fe-Fe］氫化酶和［Ni-Fe］氫化酶的基本成分， 在氫的生成中起著不可或缺的作用。 由于納米顆粒的比表面積和量子尺寸較大， 有利于氫化酶之間的電子轉(zhuǎn)移， 增強了電子吸附， 加速了鐵氧還蛋白氧化還原酶向氫化酶的末端電子轉(zhuǎn)移， 因此提高了氫化酶活性， 促進產(chǎn)氫。Zaidi等［49］采用微波輻照（家用微波爐，功率為1 180 W）與氧化鐵納米顆粒（球形，平均尺寸小于100 nm，添加量為10 mg/L）聯(lián)合預(yù)處理綠藻Enteromorpha，微波預(yù)處理組生物氣產(chǎn)量為302 mL，微波預(yù)處理氧化鐵納米顆粒組生物氣產(chǎn)量為328 mL， 在初始階段， 聯(lián)合預(yù)處理生物氣的增加歸功于微波預(yù)處理提高了裂解速率， 從而提高了生物氣產(chǎn)量。 后期由于納米顆粒的作用， 內(nèi)層細(xì)胞壁進一步溶解， 纖維素水解產(chǎn)生低聚糖（纖維素二糖、 纖維素糊精等）， 細(xì)胞壁溶解釋放的生物聚合物（蛋白質(zhì)、 碳水化合物和脂類）隨后轉(zhuǎn)化為氨基酸、 單糖、 多肽和揮發(fā)性脂肪酸， 促進產(chǎn)氫， 納米顆粒的參與提高了微波預(yù)處理的效率。 Zhao等［50］研究了納米零價鐵（NZVI）對干湖藻類與食物垃圾共消化制氫的影響， 其中NZVI的鐵以Fe2+的形式被釋放到厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中， 增強了氫化酶活性， 促進產(chǎn)氫。 與對照組相比， 每克VS加入10 mg NZVI的體系的產(chǎn)氫量為40.04 mL， 增幅為29.20%。 當(dāng)每克VS的NZVI添加量增加到20、 40 mg時， 每克VS的產(chǎn)氫量分別下降為14.77、 5.37 mL， 原因可能是大量的NZVI對發(fā)酵系統(tǒng)中產(chǎn)氫微生物的毒性增加， 導(dǎo)致細(xì)胞直接接觸NZVI后細(xì)胞膜被破壞， 從而抑制微生物產(chǎn)氫。

2.5" VFAs

大部分的VFAs是在水解過程的酸化階段產(chǎn)生的，包括乙酸、 丙酸、 異丁酸、 丁酸、 乳酸和乙醇等，其濃度和組成可用于監(jiān)測發(fā)酵制氫系統(tǒng)。在厭氧消化過程中，累積的VFAs或過量的二氧化碳導(dǎo)致發(fā)酵體系pH減?。?1］。研究［52］發(fā)現(xiàn)，pH影響基質(zhì)代謝效率、 蛋白質(zhì)合成和代謝副產(chǎn)物的釋放，對代謝反應(yīng)的進行起著至關(guān)重要的作用。Subhash等［53］以經(jīng)過溫度為121 ℃、 H2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的溶液的熱-酸聯(lián)合預(yù)處理的脫油藻類生物質(zhì)作為原料進行厭氧發(fā)酵制氫， 初始pH為6，預(yù)處理海藻的液體和固體部分VFAs的產(chǎn)量分別為3 906、 1 854 mg/L，產(chǎn)氫量分別為217、 112 mL/g，反應(yīng)結(jié)束后pH分別為3.6、 3.8。相比之下，未經(jīng)預(yù)處理的海藻的VFAs的產(chǎn)量為1 583 mg/L，產(chǎn)氫量為66 mL/g，反應(yīng)結(jié)束后pH為3.9，可見預(yù)處理后VFAs產(chǎn)量和產(chǎn)氫量均有提高，液體部分產(chǎn)氫效果更好，且VFAs的產(chǎn)量與產(chǎn)氫量具有一致性。pH的變化是微生物的產(chǎn)酸發(fā)酵所致，VFAs的組成和濃度與厭氧環(huán)境中有機組分轉(zhuǎn)化為酸性中間體有關(guān)，可為確定細(xì)菌代謝途徑的類型提供有效信息。Sun等［54］研究VFAs對小球藻厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的影響，結(jié)果表明，不同接種物與底物的質(zhì)量比（ISR）的VFAs隨產(chǎn)氫量的增加而增加，當(dāng)ISR為0.3～3.0時，VFAs濃度為21.83～65.07 mmol/L， 其中乙酸占VFAs總質(zhì)量的59.34%～65.14%，每克VS的產(chǎn)氫量最大為7.13 mL。產(chǎn)VFAs過多導(dǎo)致pH減小，一旦超出產(chǎn)氫的最適pH范圍就會抑制產(chǎn)氫。Xia等［46］研究微型藻類螺旋藻和大型藻類海帶共發(fā)酵產(chǎn)氫，海藻每克VS的添加量分別為5、 20、 40 L時，每克VS的產(chǎn)氫量分別為（73.9±2.4）、 （85.0±2.6）、 （60.6±3.7） mL，VFAs產(chǎn)量分別為1.76、 4.16、 6.97g/L，反應(yīng)結(jié)束時pH分別為5.32、 4.68、 4.52。過量海藻導(dǎo)致VFAs過量，pH顯著減小，厭氧發(fā)酵菌活性降低，氫化酶穩(wěn)定性降低，導(dǎo)致產(chǎn)氫量減少。

3" 藻類產(chǎn)氫工藝的挑戰(zhàn)與發(fā)展

氫能作為一種清潔可再生能源，可以在一定程度上替代化石燃料，但與其他燃料相比，生產(chǎn)成本仍然昂貴。研究人員致力于開發(fā)應(yīng)用各種技術(shù)，以提高藻類厭氧發(fā)酵制氫效率，降低成本。目前，藻類生物制氫工藝還存在許多問題需要解決，才能實現(xiàn)其經(jīng)濟可行性和可持續(xù)發(fā)展。

3.1" 藻類產(chǎn)氫面臨的主要問題

1）藻類的生長。藻類生物量的生化組成取決于其生長條件，特別是培養(yǎng)基的營養(yǎng)含量［55］。例如，使用養(yǎng)豬場廢水有助于增加藻類的碳水化合物含量［56］，廢水濃度中的氮、 磷含量顯著增加有利于提高藻類的蛋白質(zhì)含量。工業(yè)廢水中含有重金屬、 碳?xì)浠衔铩?有機酸、 氨和尿素等污染物，可能影響藻類的生長，因此在選擇用于藻類生長的廢水時應(yīng)慎重考慮。

2）藻類的預(yù)處理。與大型藻類厭氧發(fā)酵有關(guān)的一個問題是含有藻酸鹽、 瓊脂、 角叉菜膠等碳水化合物。這些化合物的單體共聚潛力很強，使厭氧微生物的發(fā)酵過程變得困難，最終導(dǎo)致產(chǎn)氫減少。為了加強可發(fā)酵糖的分解，可以采用各種處理方法，如物理預(yù)處理、 化學(xué)預(yù)處理、 生物預(yù)處理和組合預(yù)處理等。物理預(yù)處理需要大量能量投入，能源利用效率低；化學(xué)預(yù)處理過程中使用了大量的化學(xué)物質(zhì)，需要對化學(xué)品的使用和管理進行環(huán)境評估；生物預(yù)處理對環(huán)境條件要求嚴(yán)格，優(yōu)化預(yù)處理過程有助于提高糖的高效回收，提高藻類產(chǎn)氫的可持續(xù)性。

3）抑制劑的去除。在藻類厭氧發(fā)酵過程中，糖發(fā)酵經(jīng)常生成抑制劑如糠醛、 羥甲基糠醛和酚等，影響制氫并降低工藝效率，因此，為了提高產(chǎn)氫率，需要通過適當(dāng)?shù)墓に嚭蛥?shù)優(yōu)化來消除或減少抑制劑的生成，或是從工藝中去除形成的抑制劑。

4）氫氣的分離和富集。氫氣在反應(yīng)器頂空的積聚會導(dǎo)致分壓過高，影響反應(yīng)器的性能。為了保證安全，一般通過去除惰性氣體來降低分壓。由于發(fā)酵系統(tǒng)中還存在二氧化碳和氮氣等氣體，因此從氣體混合氣體中分離和富集生物產(chǎn)氫是必不可少的［57］。

5）納米顆粒的選擇。納米顆粒能夠改善與生物質(zhì)糖化和生物制氫相關(guān)的酶的催化效果， 顯著提高生物制氫產(chǎn)量。 納米顆粒的類型和使用的濃度不當(dāng)， 可能對生物生長和發(fā)酵產(chǎn)生不利影響， 因此需要對納米顆粒的毒性進行分析， 以便選擇合適的納米顆粒和最佳的用量， 從而提高生物產(chǎn)氫率。

6）內(nèi)源性底物分解。目前內(nèi)源性底物分解代謝產(chǎn)氫具體機制尚不清楚。由于內(nèi)源性底物分解代謝產(chǎn)氫是不可持續(xù)的，因此內(nèi)源性底物分解代謝產(chǎn)氫尚待優(yōu)化。隨著分子生物工程的發(fā)展，內(nèi)源性底物分解代謝的潛力可望被進一步挖掘。

3.2" 藻類產(chǎn)氫的發(fā)展

1）藻類的成本低是制氫的關(guān)鍵特性之一。為了降低成本，藻類可以用廢水來養(yǎng)植。此外，快速生長的藻類菌株也能夠提高藻類生產(chǎn)效率。

2）篩選碳水化合物含量高的藻類生物質(zhì)，并研究其中糖類的發(fā)酵可能性。

3）厭氧發(fā)酵排出的富含COD的廢水還可以作為微生物燃料電池（MFCs）和微生物電解電池（MECs）的基質(zhì)。MFCs具有外電，可以氧化陽極端的有機物并還原陰極端的質(zhì)子來發(fā)電。MECs通過供應(yīng)外部電壓來調(diào)動電子在陰極還原質(zhì)子產(chǎn)氫。這些集成系統(tǒng)可以有效提高產(chǎn)氫量。

4）選擇合適的催化劑可以顯著提高生物制氫率。納米顆粒已經(jīng)廣泛用于催化制氫過程中的各種反應(yīng)，因此開發(fā)高效、環(huán)境可持續(xù)和高性價比的催化劑是今后的研究重點。

5）為了進一步了解與底物利用有關(guān)的染色體基因在產(chǎn)氫過程中的作用，需要在分子水平上進行更深入的研究。

6）目前在利用重組藻株緩解氫化酶氧敏問題方面已經(jīng)取得了一些研究成果，因此，可以更多地研究重組技術(shù)來降低與藻類菌株相關(guān)的成本。

7）生物反應(yīng)器的優(yōu)化設(shè)計是提高生物制氫工藝效率的關(guān)鍵。在設(shè)計生物反應(yīng)器時，必須考慮藻類的生化需求和工藝參數(shù)的易操作性。

藻類厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫正處于發(fā)展階段，要解決生物制氫過程中存在的問題，生產(chǎn)足夠量的氫氣以供實用，還有很多課題需要研究。為了緩解全球能源問題，氫能的開發(fā)利用恰逢其時，選擇合適的藻類生物質(zhì)，優(yōu)化實驗條件，簡化工藝，降低生物制氫成本，才能更好地實現(xiàn)氫能的廣泛應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯：于海琴）