摘 要： 采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)對“黃芪補肺飲”調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激分子機制進行研究，篩選出主要活性成分（山柰酚、槲皮素、豆甾醇）和核心靶點（AKT1、MMP9、CASP3），通過基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，從分子水平推測其在“黃芪補肺飲”抗氧化應(yīng)激過程中的作用。分子對接結(jié)果顯示：活性成分與靶點均能結(jié)合形成穩(wěn)定構(gòu)象，揭示了“黃芪補肺飲”多成分、多靶點、多通路的特點與優(yōu)勢。聯(lián)合指數(shù)的體外抗氧化實驗表明：烏梅、黃芪、五味子、麥冬的最佳配比為4∶1∶1∶4，具有最高清除率及最佳協(xié)同效果。利用3D打印技術(shù)將最佳配比的“黃芪補肺飲”制成凝膠，能提高其便捷性和緩釋能力，為傳統(tǒng)食療的規(guī)?；a(chǎn)提供了新思路。

關(guān)鍵詞： 黃芪補肺飲;氧化應(yīng)激;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對接;抗氧化能力;聯(lián)合指數(shù)

中圖分類號： TS 972.161"" 文獻標(biāo)志碼： A"" 文章編號：

2095-8730（2024）03-0088-09

氧化應(yīng)激是指在內(nèi)外環(huán)境發(fā)生變化時，機體內(nèi)氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)間的動態(tài)平衡被破壞，導(dǎo)致活性氧過量而出現(xiàn)的病理狀態(tài)［1］。ZHA等［2］的研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)累積的氧化應(yīng)激會促進病程和早衰。研究表明，抑制氧化應(yīng)激對于慢性阻塞性肺疾?。?］、心血管疾?。?］、糖尿?。?］等多種慢性病患者來說都是一種有效手段。然而，迄今為止，并沒有足夠的針對氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)手段。雖然在藥物治療方面已經(jīng)有如天麻素注射液與吡咯烷酮類藥物的聯(lián)合治療［6］方式，維生素D［7］和維生素E［8］等可以有效調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的治療方法，但這些西藥不總是有效并且可能會帶來副作用［9-10］。因此尋找針對氧化應(yīng)激的安全有效的輔助調(diào)節(jié)方法迫在眉睫。

近年來，藥食同源養(yǎng)生理念備受青睞，廣泛用于預(yù)防和治療慢性疾?。?1］?！包S芪補肺飲”是中華民族食療養(yǎng)生文化瑰寶之一，由黃芪、麥冬、五味子、烏梅煎煮制成。其中，黃芪、烏梅于2021年被國家衛(wèi)生健康委員會列為藥食同源食品，而麥冬、五味子被列于可用于保健食品的中藥名單。從中醫(yī)視角看，氧化應(yīng)激是肺部疾病發(fā)病過程中的一個重要環(huán)節(jié)［12］，因此本研究借助補肺方“黃芪補肺飲”研究其抗氧化應(yīng)激效果，為開發(fā)“黃芪補肺飲”新的應(yīng)用方式提供有益參考。本方以黃芪補肺、益氣、固表，輔以五味子、烏梅、麥冬，具有調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化還原狀態(tài)的生物活性功能［13］。近年來，已有大量體內(nèi)外研究表明，黃芪、麥冬、五味子和烏梅中的活性成分可輔助調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激。如HAO等［14］發(fā)現(xiàn)黃芪中的主要活性物質(zhì)黃芪甲苷IV對大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中的由H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激具有潛在的保護作用。WU等［15］通過體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)麥冬不但可以抑制炎癥和氧化應(yīng)激，還能通過這種抑制作用改善阿霉素誘導(dǎo)的慢性心力衰竭。五味子和烏梅也已被證實具有抗氧化應(yīng)激效果［16-17］。上述研究皆表明“黃芪補肺飲”對氧化應(yīng)激有輔助調(diào)節(jié)作用，但其抗氧化應(yīng)激的具體作用機制尚不明確，關(guān)鍵活性成分和靶點仍有待確認。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子模擬，從分子層面上對“黃芪補肺飲”輔助調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的機制進行探究。

3D打印技術(shù)作為一項重要的新型加工技術(shù)，可以設(shè)計出造型獨特、營養(yǎng)配比精準(zhǔn)、滿足個性化定制需求的新型食品，具有廣闊的發(fā)展前景。普通水凝膠物理性能較差，穩(wěn)定性相對不足，而3D打印水凝膠結(jié)合了3D打印和水凝膠的優(yōu)點，機械強度高，備受研究人員的關(guān)注［18］。YAN等［19］從中藥中提取活性多糖和羧甲基殼聚糖并將其制成3D打印凝膠。KOSHOVYI等［20］將桉樹水提取物納米乳化后與聚環(huán)氧乙烷混合制成具有克服葡萄球菌感染的3D打印凝膠。故而本項目擬采用3D打印技術(shù)，通過配方優(yōu)化將“黃芪補肺飲”制成強度適宜且穩(wěn)定性好的可食用凝膠，提高其食用便捷性，進而為其規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

黃芪、麥冬、五味子、烏梅：江蘇揚州聯(lián)誼農(nóng)副產(chǎn)品批發(fā)市場;乙醇：上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司;橄欖油、高?；参锬z、海藻酸鈉、過硫酸鉀（K2S2O8）、2，2-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）：上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SS-1022型高速多功能粉碎機：武義海納電器有限公司;DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司;Infinite F50酶標(biāo)儀：帝肯（上海）貿(mào)易有限公司;UV-6100S型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司;1-14K型離心機：北京博勱行儀器有限公司;KQ5200型超聲機：昆山市超聲儀器有限公司;LuckyBot ONE型食品3D打印機：南京威布三維科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥膳的活性成分及靶點收集

運用TCMSP數(shù)據(jù)庫分別檢索“黃芪補肺飲”中的4種藥材，以黃芪（Hedysarum multijugum maxim）、麥冬（Ophiopogon japonicus）、五味子（Schisandrae chinensis fructus）、烏梅（Mume fructus）為關(guān)鍵詞初步獲取活性成分，同時對文獻中報道的活性成分進行補充［21-22］。以口服生物利用度（Oral bioavailability， OB）≥30％和類藥性指數(shù)（Drug-likeness， DL）≥0.18為篩選條件確定活性成分。檢索活性成分對應(yīng)的靶點信息并將所得靶點在Uniprot數(shù)據(jù)庫中以“Homo sapiens”為限制條件轉(zhuǎn)換為統(tǒng)一形式。

1.2.2 篩選氧化應(yīng)激相關(guān)靶點和“黃芪補肺飲-氧化應(yīng)激”交叉靶點

以“氧化應(yīng)激”為關(guān)鍵詞分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫以及OMIM數(shù)據(jù)庫中搜索獲得氧化應(yīng)激的潛在靶點。篩選出氧化應(yīng)激和“黃芪補肺飲”的交叉靶點，并導(dǎo)入STRING 11.0，物種限定為“Homo sapien”，獲取中等置信度（大于等于0.4）的蛋白質(zhì)相互作用信息。

1.2.3 “黃芪補肺飲-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖繪制及核心靶點篩選

利用Cytoscape 3.9.1構(gòu)建“黃芪補肺飲-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，其中節(jié)點代表關(guān)鍵化合物和靶點，邊代表節(jié)點之間的相互作用關(guān)系。為了系統(tǒng)地分析該網(wǎng)絡(luò)，MCODE、Centiscape 2.2和NetworkAnalyzer插件被用于聚類分析和核心靶點篩選。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)為度截止值（Degree Cutoff）為2、節(jié)點得分截止值（Node Score Cutoff）為0.5和K值（K-Core）為2，選出網(wǎng)絡(luò)中的核心聚類模塊（Cluster）。通過Centiscape 2.2插件計算網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)介度中心性（Betweenness）、接近中心性（Closeness）和借助度中心性（Degree），得到核心靶點。

1.2.4 基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集的分析

通過DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對共同靶點進行在線基因ID轉(zhuǎn)換，并對其進行生物學(xué)過程（Biological process，BP）、細胞成分（Cellular component，CC）及分子功能（Molecular function，MF）的GO和KEGG富集分析，以校正后P值lt;0.05為條件進行“黃芪補肺飲”抗氧化應(yīng)激的生物學(xué)過程和信號通路分析。

1.2.5 分子對接

分別從PubChem及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank，PDB）獲取關(guān)鍵活性成分和靶點的3D結(jié)構(gòu)文件。使用AutoDock Tools 1.5.6軟件去水加氫，采用AutoDock Vina對關(guān)鍵活性成分和靶點進行分子對接，計算最佳結(jié)合能并利用PyMol對結(jié)合模式進行可視化分析［23］。

1.2.6 抗氧化活性試驗

1.2.6.1 “黃芪補肺飲”抗氧化物質(zhì)提取

煎水取汁是“黃芪補肺飲”的常規(guī)制作方法，其雖能提取“黃芪補肺飲”中的有效成分，但效率相對較低［24］。為了更高效地提取“黃芪補肺飲”中的有效成分，縮短提取時間，本研究對“黃芪-麥冬-五味子-烏梅”粉末進行加熱超聲，以更高效地模擬實際情況。參照任晨汐等［25］的方法，分別將黃芪、麥冬、五味子、烏梅置于60 ℃的烘箱中烘干12 h，粉碎后過0.25 mm篩，以料液比1∶10（g／mL）加入超純水，置于50 ℃、超聲功率300 W條件下提取20 min，以8 000 r／min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液為待測液。

1.2.6.2 “黃芪補肺飲”復(fù)配方式篩選

參照李小龍等［26］的方法，對黃芪、麥冬、五味子、烏梅進行混料設(shè)計中的極端頂點設(shè)計（表1），結(jié)合抗氧化試驗以及聯(lián)合指數(shù)進行“黃芪補肺飲”最佳配比優(yōu)化。

1.2.6.3 ABTS+自由基清除率的測定

參照BINSAN等［27］的方法，將7 mmol／L ABTS和2.45 mmol／L K2S2O8等體積混勻，常溫避光放置12～16 h，用95％乙醇稀釋至405 nm處吸光度為1.4，得到ABTS+溶液，分別移取10 μL質(zhì)量濃度為20、40 mg／mL的不同配比“黃芪補肺飲”水提液，與200 μL ABTS工作液充分混合，在室溫下靜置2～6 min，通過公式計算ABTS+自由基清除率［27］。選出清除率較高的“黃芪補肺飲”組別，分別移取10 μL質(zhì)量濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg／mL的不同配比“黃芪補肺飲”水提液，重復(fù)上述操作。

ABTS+自由基清除率（％）=1-A1-A2A0×100（1）

式中：A1表示移取10 μL不同質(zhì)量濃度的提取樣液，加入200 μL ABTS 工作液并混合均勻，室溫避光反應(yīng)20 min，于405 nm條件下測定上清液的吸光度值;A0表示用10 μL蒸餾水代替樣液，測定405 nm處的吸光度值;A2表示用200 μL蒸餾水代替ABTS溶液，測定405 nm處的吸光度值。

1.2.6.4 “黃芪-麥冬-五味子-烏梅”聯(lián)合指數(shù)計算

參照CHOU等［28］的方法，通過計算聯(lián)合指數(shù)（Combination Index，CI）評價協(xié)同作用。聯(lián)合指數(shù)越低，協(xié)同效果最好。基于等效作用和中值定理計算 CI 值，計算公式如下：

CI=D1（Dx）1+D2（Dx）2+…+Dn（Dx）n（2）

式中：D1，D2，…，Dn 表示n種組分聯(lián)合作用時，抑制率為50％的每個組分各自的作用濃度;（Dx）1，（Dx）2，…，（Dx）n 表示n種組分單獨作用時，抑制率為50％的作用濃度;CI=1、CIlt;1和CIgt;1分別表示受試物具有加合、協(xié)同和拮抗作用。

1.2.7 “黃芪補肺飲”3D打印凝膠的制備

參照ZHOU等［29］的方法，稱取1.0 g海藻酸鈉粉末、2.6 g高?；参锬z、適量的橄欖油，緩慢連續(xù)加入至97 mL含“黃芪補肺飲”20 mg／mL水提液中，室溫下經(jīng)300 r／min轉(zhuǎn)速機械攪拌10 min，得到均勻的混合物。3D 打印機的噴頭直徑為0.5 mm，打印速度為5 mm／s，打印溫度為25 ℃。構(gòu)建40 mm×40 mm×5 mm（長×寬×高）的3D打印立方體模型，底部三層填充密度為100％，內(nèi)層的填充密度為50％，頂層設(shè)置多個5 mm×5 mm×2 mm（長×寬×高）的立方體空隙，立方體之間的間隔為4 mm。將制備的質(zhì)地均勻的混合物通過3D打印機制成“黃芪補肺飲”3D打印凝膠。

1.2.8 統(tǒng)計分析

重復(fù)實驗3次，采用SPSS 24.0軟件進行IC50的預(yù)測，采用CompuSyn軟件進行聯(lián)合指數(shù)的計算，采用Origin 2021作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 “黃芪補肺飲”有效成分及靶點的篩選

以O(shè)B≥30％和DL≥0.18為篩選條件，刪除重復(fù)項后，從TCMSP數(shù)據(jù)庫和相關(guān)參考文獻中共篩選出44個“黃芪補肺飲”的有效活性成分，度值（Degree）排名前10的活性成分見表2。在這44個化合物中，黃芪含有17個、五味子含有8個、烏梅含有8個、麥冬含有14個，其中3種化合物山柰酚、槲皮素、豆甾醇來源于“黃芪補肺飲”中的多種食材，可能是“黃芪補肺飲”中具有抗氧化應(yīng)激作用的關(guān)鍵活性成分。從TCMSP數(shù)據(jù)庫中收集“黃芪補肺飲”活性成分相關(guān)靶點，通過UniProt數(shù)據(jù)庫進行基因名標(biāo)準(zhǔn)化，得到293個相關(guān)靶點。

2.2 氧化應(yīng)激相關(guān)靶點以及“黃芪補肺飲-氧化應(yīng)激”交叉靶點的獲取

在DisGeNET、OMIM數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵字“Oxidative stress”，分別獲得4 954個和203個氧化應(yīng)激靶點（圖1.A）。刪除重復(fù)項后，共得到5 094個氧化應(yīng)激靶點。如圖1.B所示，氧化應(yīng)激和黃芪補肺飲共有222個交叉靶點，由此可初步推測，“黃芪補肺飲”通過“多成分-多靶點”網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激。

2.3 “黃芪補肺飲-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)分析

在Cytoscape 3.9.1中構(gòu)建“黃芪補肺飲-活性成分-靶點”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并通過Degree值分別對活性成分和靶點進行排序。其中橢圓形代表活性成分，矩形代表活性靶點，邊代表節(jié)點之間的相互作用關(guān)系。如附圖1所示，“黃芪-麥冬-五味子-烏梅”44個活性成分和293個靶點之間共涉及341個節(jié)點和1 042條邊。其中，Degree值最高的活性成分是槲皮素（MOL000098）、山柰酚（MOL000422）、豆甾醇（MOL000449），可能在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。

2.4 核心團簇及核心靶點的篩選

為了進一步可視化和分析“黃芪補肺飲-活性成分-靶點”，運用Cytoscape 3.9.1中的MCODE算法，將目標(biāo)分為5個獨立的團簇，核心團簇1由95個節(jié)點和2 495個相互作用（邊）組成;核心團簇2由33個節(jié)點和121個相互作用（邊）組成;核心團簇3由40個節(jié)點和123個相互作用（邊）組成;核心團簇4由9個節(jié)點和13個相互作用（邊）組成;核心團簇5由3個節(jié)點和3個相互作用（邊）組成，具體節(jié)點如表3所示。通過Centiscape 2.2插件計算網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)Betweenness、Closeness和Degree并進行排序（表4）。選擇排名最高的AKT1（n=91）、MMP9（n=90）、CASP3（n=89）作為核心靶點。

2.5 GO富集分析

為了進一步探索“黃芪補肺飲”抗氧化應(yīng)激的潛在機制，通過DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫進行GO富集分析。按-lgP由大到小排名，取排名前5的通路進行GO富集分析。雌激素反應(yīng)（GO：0032355）、衰老（GO：0007568）、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控（GO：0001934）、細胞缺氧反應(yīng)（GO：0071456）、細胞遷移的正調(diào)控（GO：0030335）等生物學(xué)過程在參與氧化應(yīng)激的調(diào)控中起主要作用。HUANG等［30］研究發(fā)現(xiàn)，良好地調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激可以促進血管生成和組織修復(fù)。SROUGI等［31］的研究同樣證實氧化應(yīng)激能積極調(diào)節(jié)細胞遷移。細胞組分集中于線粒體膜（GO：0031966）、突觸（GO：0045202）、GABA-A受體復(fù)合物（GO：1902711）、受體復(fù)合物（GO：0043235）、突觸后膜（GO：0099055）等成分。其中，RAZA［32］、SCHEFF等［33］的研究同樣論證了調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激過程中有胞質(zhì)溶膠、突觸后膜的參與。分子功能富集在類固醇激素受體（GO：0003707）、轉(zhuǎn)錄輔因子結(jié)合（GO：0001221）、雌激素反應(yīng)元件結(jié)合（GO：0034056）、細胞外配體門控離子通道活性（GO：0005230）、蛋白酶結(jié)合（GO：0002020）等。其中，核心靶點MMP9能通過抑制線粒體損傷和氧化應(yīng)激來減弱瓣膜間質(zhì)細胞的鈣化，從而體現(xiàn)出在CAVS進展過程中線粒體代謝和氧化應(yīng)激中的潛在作用［34］。

2.6 KEGG富集分析

KEGG富集分析顯示，“黃芪補肺飲”可以影響多通道，其中與氧化應(yīng)激相關(guān)性較高的包括朊病毒?。╤sa05020）、細胞衰老（hsa04218）、糖尿病性心肌病（hsa05415）、胰腺癌（hsa05212）、膀胱癌（hsa05219）、阿爾茨海默?。╤sa05010）、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（hsa05167）、TNF信號通路（hsa04668）、神經(jīng)退行性變的途徑-多種疾?。╤sa05022）、人巨細胞病毒感染（hsa05163）、IL-17信號通路（hsa04657）、前列腺癌癥（hsa05215）、化學(xué)致癌-受體激活（hsa05207）、非酒精性脂肪肝（hsa04932）、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化（hsa05418）、乙型肝炎（hsa05161）、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化（hsa05417）、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用（hsa0493）、化學(xué)致癌作用-活性氧（hsa05208）、癌癥的發(fā)病途徑（hsa05200）等。其中，GALKIN［35］等研究發(fā)現(xiàn)TNF信號通路會引起異?；罨瑥亩鴮?dǎo)致內(nèi)表皮細胞的損傷及凋亡，而線粒體靶向抗氧化劑SkQR1可以抑制TNF信號通路，表明TNF信號通路是抑制氧化應(yīng)激的主要途徑。因此，“黃芪補肺飲”可能通過上述途徑發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激的作用。

2.7 分子對接

基于上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，分別獲得了三個關(guān)鍵活性成分和靶點。為進一步研究“黃芪補肺飲”的抗氧化應(yīng)激作用，采用AutoDock Vina軟件進行分子對接，從而探究關(guān)鍵活性成分與靶點之間的結(jié)合行為。如附表1所示，關(guān)鍵活性成分與靶點之間的結(jié)合能都低于-5 kcal／mol，表明關(guān)鍵靶點AKT1、MMP9和CASP3能夠分別與活性成分山柰酚（MOL000422）、槲皮素（MOL000098）和豆甾醇（MOL000449）穩(wěn)定結(jié)合。槲皮素與MMP9形成了以范德華力、氫鍵、Pi-陽離子、π-σ相互作用、π-π堆疊、Pi-烷基等作用力共同驅(qū)動的復(fù)合物，結(jié)合能最低（-10.7 kcal／mol），結(jié)合構(gòu)象最穩(wěn)定，表明其在“黃芪補肺飲”抗氧化應(yīng)激過程中作用顯著，具有極大的應(yīng)用潛力。此外，已有研究證實豆甾醇的抗氧化作用［36］，其同樣與本研究篩選出的核心靶點具有相當(dāng)廣譜的親和力（結(jié)合能lt;-7 kcal／mol）。MMP9是一種重要的蛋白水解酶，主要參與細胞外基質(zhì)的降解和重塑，是線粒體代謝紊亂和氧化應(yīng)激的新型生物標(biāo)志物［37］。本研究中，3種活性成分在與MMP9結(jié)合時均呈現(xiàn)出穩(wěn)定的結(jié)合構(gòu)象（結(jié)合能lt;-9 kcal／mol），顯示出較高的親和力。綜上，分子對接結(jié)果顯示，“黃芪補肺飲”的主要活性成分和靶點都能自發(fā)且穩(wěn)定結(jié)合，進一步論證了“黃芪補肺飲”抗氧化應(yīng)激的功能。

2.8 抗氧化指標(biāo)測定

2.8.1 黃芪、麥冬、五味子和烏梅的抗氧化能力

在ABTS+自由基清除試驗中，烏梅、黃芪、五味子、麥冬的 IC50 值分別是0.269 mg／mL、1.176 mg／mL、0.874 mg／mL和0.602 mg／mL。其中，烏梅的ABTS+自由基清除能力最強，而黃芪的ABTS+自由基清除能力最弱。

2.8.2 “黃芪補肺飲”的配比優(yōu)化

為了選出“黃芪補肺飲”自由基清除能力的最佳配比，參照表1進行不同配比“黃芪補肺飲”的ABTS+自由基清除實驗，結(jié)果表明，第1、8、9、10、12組的清除率在40 mg／mL時就已經(jīng)超過90％，明顯高于其他組（在20mg／mL時，ABTS+自由基清除率分別為60％、72％、94％、95％和95％，在40 mg／mL時，ABTS+自由基清除率分別為96％、97％、95％、98％和95％）。所以進一步將第1、8、9、10、12組的樣液稀釋50倍，繼續(xù)測定ABTS+自由基清除率。如圖2所示，第1、10、12組顯示出較高的ABTS+自由基清除率。

2.8.3 不同“黃芪補肺飲”復(fù)配體系的協(xié)同作用評價

眾所周知，食材按照不同比例進行復(fù)配可能會出現(xiàn)不同的相互作用（協(xié)同、加合、拮抗）。因此，本研究基于聯(lián)合指數(shù)探究“黃芪補肺飲”按不同比例復(fù)配后的ABTS+清除效果，以期選出“黃芪補肺飲”的最佳配比［38-40］。對第1、10、12組進行聯(lián)合指數(shù)的計算，發(fā)現(xiàn)CI值均小于1（第1、10、12組的CI值分別為0.375、0.714、0.261），表明第1、10、12組復(fù)配體系皆為協(xié)同作用。第12組的ABTS+自由基清除率最高，且協(xié)同效果最好，所以第12組是“黃芪補肺飲”的最佳配比。

2.9 “黃芪補肺飲”凝膠3D打印

最佳配比“黃芪補肺飲”的3D凝膠打印樣品見圖3。在橄欖油濃度優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)橄欖油濃度降低為1～2 mL時，由于凝膠強度過高，在打印過程中出現(xiàn)堵塞噴嘴的情況，導(dǎo)致凝膠細絲擠出時連續(xù)性差、成品外觀出現(xiàn)毛刺和缺陷。當(dāng)橄欖油濃度升高為4～5 mL時，打印凝膠出現(xiàn)坍塌，自支撐能力差。隨著橄欖油濃度的增加，擠出流暢度呈上升趨勢但自支撐能力呈下降趨勢。濃度過高不利于自支撐性，濃度過低不利于擠出性?？紤]到擠出性和自支撐性之間的矛盾，發(fā)現(xiàn)橄欖油濃度為3 mL時凝膠強度適宜，在打印過程中未出現(xiàn)堵塞3D打印機噴嘴的情況，凝膠細絲能夠連續(xù)擠出且速度適宜。打印樣品效果圖光滑平整，外壁基本垂直，外觀上幾乎沒有缺陷，在打印完成后也能自我支撐并保持一定高度，具有良好的穩(wěn)定性。

綜上所述，基于前期預(yù)實驗，確定以1.0 g海藻酸鈉粉末、2.6 g高?；参锬z、3 mL的橄欖油混合97 mL含20 mg／mL的“黃芪補肺飲”為配方的3D打印凝膠的打印效果較好，有大規(guī)模投入市場的可能性。

3 結(jié)論

“黃芪補肺飲”由黃芪、麥冬、五味子、烏梅煎煮制成，具有補肺、益氣、固表等多種生物活性功能。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接等技術(shù)對其調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的分子機制進行研究，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫收集“黃芪補肺飲”的活性成分及對應(yīng)靶點，在GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫中獲取氧化應(yīng)激相關(guān)靶點。借助Cytoscape 3.9.1構(gòu)建“黃芪補肺飲-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)并篩選關(guān)鍵靶點，利用AutoDock Vina對關(guān)鍵靶點與活性成分進行分子對接并評估其結(jié)合能力與作用模式，進而采用聯(lián)合指數(shù)的體外抗氧化實驗確定“黃芪補肺飲”的最佳配比。以此為基礎(chǔ)，按1.0 g海藻酸鈉粉末、2.6 g高?；参锬z、3 mL的橄欖油、97 mL 20 mg／mL“黃芪補肺飲”的配比進行3D打印可食用凝膠制備。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明，山柰酚、槲皮素、豆甾醇為“黃芪補肺飲”主要活性成分，AKT1、MMP9和CASP3為核心靶點，且均具有較高結(jié)合能?；诼?lián)合指數(shù)的體外抗氧化實驗結(jié)果表明，烏梅、黃芪、五味子、麥冬的最佳配比為4∶1∶1∶4，顯示出最高清除率及最佳協(xié)同效果。本研究初步揭示“黃芪補肺飲”的“多成分-多靶點-多通路”模式能協(xié)同調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，進而為其工業(yè)化生產(chǎn)與精準(zhǔn)營養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

參考文獻：

［1］ OSWALD M C W，GARNHAM N，SWEENEY S T，et al.Regulation of neuronal development and function by ROS［J］.FEBS Letters，2018，592（5）：679-691.

［2］ ZHA L，HE L，LIANG Y J，et al.TNF-α contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation［J］.Biomedicine ＆ Pharmacotherapy=Biomedecine ＆ Pharmacotherapie，2018，102：369-374.

［3］ 朱凌云，呂曉東.“肺虛絡(luò)瘀” 病機觀與氧化應(yīng)激在慢性阻塞性肺疾病發(fā)病過程中相關(guān)性探討［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2024，26（3）：140-143.

［4］ DUBOIS-DERUY E，PEUGNET V，TURKIEH A，et al.Oxidative stress in cardiovascular diseases［J］.Antioxidants，2020，9（9）：864.

［5］ ZHANG P J，LI T，WU X Y，et al.Oxidative stress and diabetes：antioxidative strategies［J］.Frontiers of Medicine，2020，14（5）：583-600.

［6］ 姜洪順，姜國勇.天麻素注射液與吡咯烷酮類藥物聯(lián)合治療急性腦出血的療效及對患者氧化應(yīng)激、神經(jīng)功能的影響［J］.心腦血管病防治，2022，22（5）：63-66.

［7］ KALVANDI F，ALI AZARBAYJANI M，AZIZBEIGI R，et al.Elastic resistance training is more effective than vitamin D3 supplementation in reducing oxidative stress and strengthen antioxidant enzymes in healthy men［J］.European Journal of Clinical Nutrition，2022，76：610-615.

［8］ 趙敏英，張銘娜，郭麗娜，等.維生素E聯(lián)合促排卵藥物治療多囊卵巢綜合征不孕癥的療效及對氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響［J］.河北醫(yī)藥，2020，42（3）：357-361.

［9］ DEBRUIN D A，TIMPANI C A，LALUNIO H，et al.Exercise may ameliorate the detrimental side effects of high vitamin D supplementation on muscle function in mice［J］.Journal of Bone and Mineral Research，2020，35（6）：1092-1106.

［10］ OCHI H，TAKEDA S.The two sides of vitamin E supplementation［J］.Gerontology，2015，61（4）：319-326.

［11］ 朱曉東.葛根黃酮對大強度運動大鼠骨骼肌氧化應(yīng)激損傷的保護作用及其機制研究［J］.美食研究，2020，37（3）：78-82.

［12］ 呂安淇，施雨峰，姜成，等.氧化應(yīng)激干預(yù)肺癌相關(guān)信號通路及中藥干預(yù)研究進展［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2024，30（11）：228-237.

［13］ JI B Y，XUAN L S，ZHANG Y X，et al.Advances in biotechnological production and metabolic regulation of Astragalus membranaceus［J］.Plants，2023，12（9）：1858.

［14］ HAO M，LIU Y，CHEN P，et al.Astragaloside IV protects RGC-5 cells against oxidative stress［J］.Neural Regeneration Research，2018，13（6）：1081-1086.

［15］ WU Z W，ZHAO X K，MIYAMOTO A，et al.Effects of steroidal saponins extract from Ophiopogon japonicus root ameliorates doxorubicin-induced chronic heart failure by inhibiting oxidative stress and inflammatory response［J］.Pharmaceutical Biology，2019，57（1）：176-183.

［16］ YAN T X，LIU B，LI F Y，et al.Schizandrin ameliorates behavioral disorders in hepatic injury mice via regulation of oxidative stress and neuroinflammation［J］.Immunopharmacology and Immunotoxicology，2021，43（2）：212-222.

［17］ WANG J，DING K，WANG Y H，et al.Wumei pill ameliorates AOM／DSS-induced colitis-associated colon cancer through inhibition of inflammation and oxidative stress by regulating S-adenosylhomocysteine hydrolase-（AHCY-） mediated hedgehog signaling in mice［J］.Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2022，2022：4061713.

［18］ LIU C，XU N，ZONG Q D，et al.Hydrogel prepared by 3D printing technology and its applications in the medical field［J］.Colloid and Interface Science Communications，2021，44：100498.

［19］ YAN J X，WANG Y，ZHANG X，et al.Snakegourd root／Astragalus polysaccharide hydrogel preparation and application in 3D printing［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2019，121：309-316.

［20］ KOSHOVYI O，HEINMKI J，RAAL A，et al.Pharmaceutical 3D-printing of nanoemulsified eucalypt extracts and their antimicrobial activity［J］.European Journal of Pharmaceutical Sciences：Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences，2023，187：106487.

［21］ PENG Y，ZHU G R，MA Y Y，et al.Network pharmacology-based prediction and pharmacological validation of effects of astragali Radix on acetaminophen-induced liver injury［J］.Frontiers in Medicine，2022，9：697644.

［22］ YIN H H，LIU W，JI X Y，et al.Study on the mechanism of Wumei San in treating piglet diarrhea using network pharmacology and molecular docking［J］.Frontiers in Veterinary Science，2023，10：1138684.

［23］ GUAN T Z，BIAN C F，LI N，et al.Molecular mechanism of Guihuang traditional drink in prevention of thrombotic diseases explored through network pharmacology，quantum chemical calculation，and molecular docking-based strategy［J］.Chinese Journal of Analytical Chemistry，2023，51（2）：100216.

［24］ JIN W B，ZHOU T，LI G K.Recent advances of modern sample preparation techniques for traditional Chinese medicines［J］.Journal of Chromatography.A，2019，1606：460377.

［25］ 任晨汐，卞燦鋒，李寧，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探究藥膳“枸杞-桑椹-覆盆子湯” 治療糖尿病腎病的分子機制［J］.保鮮與加工，2023，23（11）：51-61.

［26］ 李小龍，熊曉莉，李寧.基于極端頂點混料設(shè)計優(yōu)化黃粉蟲秸稈飼料配方［J］.昆蟲學(xué)報，2018，61（5）：596-603.

［27］ BINSAN W，BENJAKUL S，VISESSANGUAN W，et al.Antioxidative activity of Mungoong，an extract paste，from the cephalothorax of white shrimp （Litopenaeus vannamei）［J］.Food Chemistry，2008，106（1）：185-193.

［28］ CHOU T C.The combination index （CIlt;1） as the definition of synergism and of synergy claims［J］.Synergy，2018，7：49-50.

［29］ ZHOU Q C，NAN X J，ZHANG S C，et al.Effect of 3D food printing processing on polyphenol system of loaded Aronia melanocarpa and post-processing evaluation of 3D printing products［J］.Foods，2023，12（10）：2068.

［30］ HUANG Y J，NAN G X.Oxidative stress-induced angiogenesis［J］.Journal of Clinical Neuroscience：Official Journal of the Neurosurgical Society of Australasia，2019，63：13-16.

［31］ SROUGI M C，TOLBERT C E，SMITH A，et al.Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress［J］.The FASEB Journal，2019，33（S1）：1155-1161.

［32］ RAZA H.Dual localization of glutathione S-transferase in the cytosol and mitochondria：implications in oxidative stress，toxicity and disease［J］.The FEBS Journal，2011，278（22）：4243-4251.

［33］ SCHEFF S W，ANSARI M A，MUFSON E J.Oxidative stress and hippocampal synaptic protein levels in elderly cognitively intact individuals with Alzheimer’s disease pathology［J］.Neurobiology of Aging，2016，42：1-12.

［34］ LIU C，LIU R X，CAO Z Z，et al.Identification of MMP9 as a novel biomarker to mitochondrial metabolism disorder and oxidative stress in calcific aortic valve stenosis［J］.Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2022，2022：3858871.

［35］ GALKIN I I，PLETJUSHKINA O Y，ZINOVKIN R A，et al.Mitochondria-targeted antioxidant SkQR1 reduces TNF-induced endothelial permeability in vitro［J］.Biochemistry （Moscow），2016，81（10）：1188-1197.

［36］ FAN H R，REN C X，SHI F，et al.Combining network pharmacology and molecular docking to decipher molecular mechanism of Wugen Decoction in influenza A prevention［J］.Chinese Journal of Analytical Chemistry，2024，52（2）：100353.

［37］ VINCENT CHONG V K，RAHMAN Z A A，ZAKARIA Z，et al.O56.Genome wide profiling of tongue and cheek cancer using high resolution array based CGH［J］.Oral Oncology，2011，47：S47-S48.

［38］ 彭毅秦， 何嘉欣， 胡靜，等. 不同基酒對中國櫻桃泡酒風(fēng)味特征及體外功能活性的影響［J］. 美食研究， 2023，40 （4）： 88-94.

［39］ 王婷婷， 賈娟， 王煜，等. 杜仲枸杞復(fù)合保健飲料的研制及體外抗氧化性研究［J］. 美食研究， 2023，40（4）： 79-87.

［40］ 苑靜， 唐國芳， 張建煬，等. 貴州白酸湯添加石斛花后品質(zhì)及風(fēng)味的提升研究［J］. 美食研究， 2024，41（1）： 67-77.

Study on synergistic oxidation and 3D printing of “Huangqi Bufei Yin” based on network pharmacology and molecular docking

GAO Mingyuan， REN Chenxi， FENG Yining， LI Ning， XIAO Lixia， YANG Zhenquan， GUAN Tianzhu

（School of Food Science and Engineering， Yangzhou University， Yangzhou， Jiangsu 225127， China）

Abstract： In this research， the molecular mechanism of “Huangqi Bufei Yin” regulating oxidative stress was studied using network pharmacology and molecular docking. The main active ingredients （kaempferol， quercetin and stigmasterol） and core targets （AKT1， MMP9 and CASP3） were screened out. Through Gene Ontology （GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway enrichment analysis， the role of these components in the antioxidative stress process of “Huangqi Bufei Yin” was inferred at the molecular level. The molecular docking results showed that the active ingredients could bind to the targets to form stable conformations， revealing the characteristics and advantages of “Huangqi Bufei Yin” in terms of the multi-component， multi-target and multi-pathway. In addition， in vitro antioxidant experiment based on the combination index indicated that the optimal ratio of Mume fructus， Hedysarum multijugum maxim， Schisandrae chinensis fructus and Ophiopogon japonicus was 4∶1∶1∶4， showing the highest scavenging rate and best synergistic effect. Using 3D printing technology， the optimally ratioed" of “Huangqi Bufei Yin” was made into a gel， improving its convenience and slow-release ability， providing a new idea for the large-scale production of traditional diet therapy.

Key words：

“Huangqi Bufei Yin”; oxidative stress; network pharmacology; molecular docking; antioxidant capacity; combination index

（責(zé)任編輯：趙 勇）