摘" 要：微生物降解被認(rèn)為是修復(fù)鄰苯二甲酸酯（PAEs）最具有前景的方法之一.然而，從環(huán)境中分離的PAEs高效降解菌大部分是致病菌或條件致病菌.植物內(nèi)生菌為非致病菌，分離PAEs高效降解植物內(nèi)生菌具有重要的現(xiàn)實(shí)意義.選取一株Bacillus subtilis N-1為研究對(duì)象，該菌株是從受污染的植物內(nèi)部篩選到的植物內(nèi)生菌，能以鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）和鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）兩種PAEs為唯一碳源和能源生長.探究了菌株N-1的生長習(xí)性，包括其吲哚乙酸的分泌情況和對(duì)4種抗生素的耐藥性.結(jié)果表明，投加色氨酸能促進(jìn)菌株N-1分泌吲哚乙酸；0.50 mg·L-1慶大霉素、8.00 mg·L-1氯霉素、32.00 mg·L-1鹽酸四環(huán)素和32.00 mg·L-1利福平為菌株N-1的最小抑菌質(zhì)量濃度.目前污水中抗生素質(zhì)量濃度遠(yuǎn)低于菌株N-1的最小抑菌質(zhì)量濃度，菌株N-1修復(fù)PAEs污染的范圍較廣泛，具有較好的應(yīng)用前景.

關(guān)鍵詞：鄰苯二甲酸酯；降解；植物內(nèi)生菌；吲哚乙酸；抗生素耐藥性

中圖分類號(hào)：Q89""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1000-2367（2024）06-0020-07

鄰苯二甲酸酯（PAEs）是一類合成有機(jī)化合物，是廣泛應(yīng)用于塑料制品中的塑化劑和添加劑［1］.PAEs通過物理作用與塑料制品結(jié)合，因此易于從塑料制品中脫離并進(jìn)入環(huán)境.PAEs化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能夠在自然環(huán)境中穩(wěn)定存在.目前為止，PAEs已在不同生境中被檢出，包括水體、土壤和空氣［2］.其中，鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）和鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）在環(huán)境中被廣泛檢出，是兩種典型的PAEs［3］.PAEs可以通過皮膚吸收和食物攝入等途徑進(jìn)入并累積于人體，當(dāng)達(dá)到一定劑量時(shí)會(huì)產(chǎn)生生物毒性，其危害主要包括致畸、致癌、致突變［4］.修復(fù)PAEs污染亟待解決.目前，通過微生物降解修復(fù)PAEs污染被認(rèn)為是最具有前景的方法之一［5］.微生物資源豐富，分布廣泛，對(duì)污染物有較強(qiáng)的適應(yīng)能力和高效降解能力.

大量PAEs高效降解菌已從不同環(huán)境（土壤、河道底泥、沉積物、污泥、河口、自來水和塑料碎片等）中被分離出來，如紅球菌屬（Rhodococcus）［6］、根瘤菌屬（Rhizobium）［7］、伯克氏菌屬（Burkholderia）［8］、戈登氏菌屬（Gordonia）［9］、鞘脂菌屬（Sphingobium）［10］、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）［11］、假單胞菌屬（Pseudomonas）［12］、青枯菌屬（Ralstonia）［13］、無色桿菌屬（Achromobacter）［14］和微桿菌屬（Microbacterium）［15］.然而，從環(huán)境中分離的PAEs高效降解菌大部分是致病菌或條件致病菌，將其應(yīng)用于環(huán)境修復(fù)的同時(shí)，會(huì)帶來一定的健康風(fēng)險(xiǎn).而植物內(nèi)生細(xì)菌定殖于植物組織內(nèi)部，對(duì)環(huán)境及植物沒有已知的有害影響.此外，植物內(nèi)生菌能促進(jìn)植物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，降解植物組織中的持久性有機(jī)污染物，進(jìn)而提高植物對(duì)持久性有機(jī)污染物的耐受性，促進(jìn)植物在持久性有機(jī)污染物污染土壤中生長［16］.另外，植物內(nèi)生菌通常能分泌吲哚乙酸［17］.吲哚乙酸具有調(diào)控植物生長發(fā)育的功能，一定濃度的吲哚乙酸能促進(jìn)植物的生長，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面具有巨大的

收稿日期：2023-08-24;修回日期：2024-01-16.

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（41977301）.

作者簡(jiǎn)介：呂輝雄（1977-），男，湖北荊州人，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)教授，研究方向?yàn)榄h(huán)境有機(jī)污染，E-mail：huixiongl@scau.edu.cn.

通信作者：黃雪晶，E-mail：huangxuejing@sjtu.edu.cn.

引用本文：呂輝雄，黃雪晶.高效降解鄰苯二甲酸酯植物內(nèi)生菌的抗生素耐藥性研究［J］.河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2024，52（6）：20-26.（Lü Huixiong，Huang Xuejing.Study on antibiotic resistance of endophytic bacterium efficiently degrading phthalates［J］.Journal of Henan Normal University（Natural Science Edition），2024，52（6）：20-26.DOI：10.16366/j.cnki.1000-2367.2023.08.24.0003.）

應(yīng)用潛力.因此，挖掘能降解PAEs的植物內(nèi)生菌具有重要意義.

自青霉素發(fā)現(xiàn)并使用以來，人類為追求利益最大化，在各個(gè)領(lǐng)域廣泛使用抗生素［18］.然而，大部分抗生素會(huì)以藥物原型隨糞尿排出并進(jìn)入環(huán)境，影響各生境微生物生態(tài)系統(tǒng).不同環(huán)境中的抗生素種類和濃度差異很大，從納克每毫升到微克每毫升不等.應(yīng)用高效降解菌修復(fù)環(huán)境污染時(shí)，環(huán)境中的抗生素會(huì)降低微生物活性，使得污染物高效降解菌的代謝活性喪失或部分受到抑制，導(dǎo)致無效降解或降解效率低［19］，環(huán)境中的抗生素污染嚴(yán)重限制了微生物修復(fù)有機(jī)物污染環(huán)境的應(yīng)用.因此，將PAEs高效降解菌應(yīng)用于PAEs污染的環(huán)境修復(fù)時(shí)，處理對(duì)象中所殘留的抗生素會(huì)對(duì)處理效果產(chǎn)生較大的影響.基于目前大部分環(huán)境受PAEs污染的同時(shí)也受抗生素污染情況，篩選具備一定抗生素耐藥性的PAEs高效降解菌更具有現(xiàn)實(shí)意義.然而，目前對(duì)PAEs高效降解菌的研究主要集中于研究其對(duì)PAEs的降解性能及降解機(jī)制，而對(duì)抗生素的耐藥性知之甚少.在應(yīng)用PAEs高效降解菌修復(fù)PAEs污染前，了解PAEs高效降解菌對(duì)不同抗生素的耐藥性才能確保PAEs高效降解菌在修復(fù)實(shí)際污染環(huán)境時(shí)能發(fā)揮最佳修復(fù)效果.因此，分離能高效降解PAEs的植物內(nèi)生菌及探究其對(duì)抗生素的耐藥性至關(guān)重要.

本研究以一株Bacillus subtilis為研究對(duì)象，其被命名為N-1，該菌株是從受污染的植物內(nèi)部篩選到的植物內(nèi)生菌，能以DBP和DEHP兩種PAEs為唯一碳源和能源生長.在PAEs初始質(zhì)量濃度為50～100 mg·L-1時(shí)，培養(yǎng)5 d后DBP的降解率達(dá)到90%以上，DEHP降解率能達(dá)到60%.對(duì)菌株N-1分泌吲哚乙酸的能力進(jìn)行檢測(cè)，以探討其除修復(fù)PAEs污染外更多元的功能特性，如作為促進(jìn)植物生長的微生物菌種資源，為進(jìn)一步研發(fā)生物肥料提供理論依據(jù).另外，探究其對(duì)不同抗生素的耐藥性，以探討不同抗生素對(duì)菌株N-1在實(shí)際污染環(huán)境修復(fù)中的限制，確定菌株N-1修復(fù)PAEs污染的應(yīng)用范圍.

1" 材料與方法

1.1" 實(shí)驗(yàn)材料

樣品：本研究以一株Bacillus subtilis為研究對(duì)象，該菌株于廣東省韶關(guān)市一處污水溝旁的植物樣品內(nèi)分離獲得，是一株植物內(nèi)生菌.

主要試劑：L-色氨酸（純度＞99%）、吲哚乙酸分析標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99.9%）、慶大霉素（純度＞99%）、氯霉素（純度＞99%）、鹽酸四環(huán)素（純度＞99%）和利福平（純度＞99%）購于aladdin公司.

Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基（g·L-1）：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g，pH值調(diào)至7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min.含L-色氨酸的LB液體培養(yǎng)基：配置高濃度L-色氨酸母液，使用細(xì)菌過濾器將母液注入冷卻的LB液體培養(yǎng)基中，使得培養(yǎng)基中L-色氨酸終濃度為3 mmol·L-1.含慶大霉素的LB液體培養(yǎng)基：配置高質(zhì)量濃度慶大霉素母液，使用細(xì)菌過濾器將母液注入冷卻的無菌LB液體培養(yǎng)基中.氯霉素、鹽酸四環(huán)素和利福平LB液體培養(yǎng)基制備方法與慶大霉素LB液體培養(yǎng)基制備方法一致.

1.2" 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1" PAEs高效降解植物內(nèi)生細(xì)菌的分離

本研究植物樣品在廣東省韶關(guān)市一處污水溝渠邊采集.在采集的植物樣品中，通過分離獲得了34株植物內(nèi)生菌.后以PAEs為唯一碳源和能源對(duì)34株植物內(nèi)生菌進(jìn)行馴化，最終篩選到了一株P(guān)AEs降解效果較好的優(yōu)勢(shì)菌株，名為N-1.

1.2.2" 檢測(cè)PAEs高效降解菌N-1分泌吲哚乙酸的能力

本研究中吲哚乙酸含量采用Salkowski比色法進(jìn)行測(cè)定［17］.將菌株N-1接種于裝有含L-色氨酸的LB液體培養(yǎng)基中，另外設(shè)計(jì)一組不接種菌株N-1作為空白對(duì)照.在溫度為28 ℃、轉(zhuǎn)速為160 r·min-1的全溫振蕩器（DHZ-D）中培養(yǎng)12 h后，將1 mL菌液轉(zhuǎn)入滅菌的試管中，加入2 mL Sacowski顯色液，充分混合均勻，室溫下避光顯色20 min，若出現(xiàn)粉紅色，說明該菌具有分泌吲哚乙酸的能力.其中Sacowski顯色液由250 mL雙蒸水、150 mL濃硫酸、7.5 mL 0.5 mol·L-1的FeCl3·6H2O配置而成.經(jīng)上述顯色反應(yīng)后，將剩余的菌液在10 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心10 min，取10 mL上清液加入25 mL比色管中，加入等體積的Sacowski顯色液，用雙蒸水定容，室溫下避光顯色20 min后，采用紫外分光光度計(jì)在530 nm波長下測(cè)定其光度值.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌株N-1分泌吲哚乙酸的質(zhì)量濃度.標(biāo)準(zhǔn)曲線吲哚乙酸的質(zhì)量濃度梯度為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 mg·L-1.

1.2.3" PAEs高效降解菌N-1對(duì)不同抗生素的耐藥性實(shí)驗(yàn)

配置50 mL LB液體培養(yǎng)基若干，添加一定量的氯霉素，其質(zhì)量濃度分別為0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、32.00 mg·L-1.對(duì)慶大霉素、鹽酸四環(huán)素和利福平做相同的處理，每個(gè)處理做3個(gè)平行，以探究氯霉素、慶大霉素、鹽酸四環(huán)素和利福平對(duì)菌株N-1的最小抑菌質(zhì)量濃度.將菌株N-1懸濁液接種于上述培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)前培養(yǎng)基OD600值為0.05，接著在溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為160 r·min-1的全溫振蕩器（DHZ-D）上進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，分別培養(yǎng)0、1、2、4、6、8、12、24、36、48、72 h.最后使用紫外分光光度計(jì)，波長設(shè)置為600 nm，測(cè)定其光度值，即OD600.使用0.22 μm濾膜過濾樣品獲得的濾液作為空白對(duì)照.樣品OD600值減去空白對(duì)照OD600值為實(shí)際菌液OD600值.后以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制曲線，以分析菌株N-1在含有不同種類和不同質(zhì)量濃度抗生素LB液體培養(yǎng)基中的生長情況；研究外源抗生素對(duì)菌株N-1生長的影響，以探討菌株N-1對(duì)幾種常見抗生素的耐藥性.

2" 結(jié)果與分析

2.1" PAEs高效降解菌N-1的形態(tài)學(xué)及菌株鑒定

PAEs高效降解菌N-1在以PAEs為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基上生長繁殖.菌落呈規(guī)則圓形，在長成菌落初期，菌落呈半透明，表面光滑，在培養(yǎng)24 h后，菌落表面變粗糙，呈白色不透明狀，菌落生長圖見圖1.通過革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)確定該菌株為革蘭氏陽性菌.

菌株N-1的16S rDNA序列與NCBI Genebank數(shù)據(jù)庫中Bacillus subtilis中的16S rDNA序列相似性最高，高達(dá)100%.結(jié)合菌株N-1的菌落形態(tài)、生長特性、革蘭氏特征和16S rDNA同源性分析，該菌株被鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）.

2.2" PAEs高效降解菌N-1吲哚乙酸的分泌情況

吲哚乙酸是一種重要的植物生長素，主要用于調(diào)節(jié)植物發(fā)育，具有吲哚乙酸分泌能力的植物內(nèi)生菌能提高特定植物的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)［17］.本研究菌株N-1菌液加入Sacowski顯色液避光顯色20 min后，菌液顏色變?yōu)榉奂t色，不接種該菌的空白對(duì)照組顏色沒有變?yōu)榉奂t色，說明該菌具備分泌吲哚乙酸的能力.植物內(nèi)生細(xì)菌普遍具有分泌吲哚乙酸的能力，目前報(bào)道細(xì)菌分泌吲哚乙酸的質(zhì)量濃度差異較大，一般在0.109～251 mg·L-1之間.例如，從桑葚莖中分離的植物內(nèi)生菌陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）能分泌17.8～17.9 mg·L-1吲哚乙酸［17］.本研究對(duì)象PAEs高效降解植物內(nèi)生菌N-1分泌的吲哚乙酸質(zhì)量濃度為9.08 mg·L-1，相比可知菌株N-1分泌吲哚乙酸的質(zhì)量濃度相對(duì)較低，這可能與宿主植物類型、生長條件及分離培養(yǎng)條件等因素有關(guān).低質(zhì)量濃度生長素促進(jìn)植物生長，高質(zhì)量濃度生長素抑制植物生長.同一質(zhì)量濃度生長素對(duì)不同植物幼苗的影響不同，分泌生長素質(zhì)量濃度相同的不同種屬微生物對(duì)同種植物幼苗的影響也不同.因此本研究篩選出的可分泌吲哚乙酸的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)植物生長是否具有促進(jìn)作用，還需通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí).

2.3" 抗生素脅迫對(duì)PAEs高效降解菌N-1生長的影響

抗生素是一種抑制微生物生長的化合物［19］，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖和畜牧業(yè)等產(chǎn)業(yè)，其帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，排入環(huán)境中會(huì)帶來一定的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，如影響土著微生物代謝、抑制微生物修復(fù)有機(jī)污染物等.環(huán)境中殘留的抗生素主要包括酰胺醇類抗生素、氨基糖苷類抗生素、四環(huán)素類抗生素和大環(huán)內(nèi)酰胺類抗生素等.本研究選擇氯霉素作為酰胺醇類抗生素代表、慶大霉素作為氨基糖苷類抗生素代表、四環(huán)素作為四環(huán)素類抗生素代表和利福平作為大環(huán)內(nèi)酰胺類抗生素代表，以探究PAEs高效降解菌N-1對(duì)不同類型抗生素的耐藥性.

2.3.1" 氯霉素脅迫對(duì)PAEs高效降解菌N-1生長的影響

氯霉素脅迫對(duì)PAEs高效降解菌N-1生長影響的結(jié)果見圖2.當(dāng)未添加氯霉素時(shí)，4～36 h為菌株N-1的對(duì)數(shù)生長期.當(dāng)氯霉素質(zhì)量濃度為0.25～2.00 mg·L-1時(shí)，菌株N-1的對(duì)數(shù)生長期為8～36 h.當(dāng)氯霉素質(zhì)量濃度為4.00 mg·L-1時(shí)，菌株N-1的對(duì)數(shù)生長期為12～48 h.因此，氯霉素的添加延長了菌株N-1生長的遲緩期.在一定范圍內(nèi)，氯霉素質(zhì)量濃度越高，菌株N-1進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期時(shí)間越長.氯霉素對(duì)菌株N-1的最小抑菌質(zhì)量濃度為8.00 mg·L-1.陸孫琴等［20］研究兩處污水處理廠二級(jí)出水總異養(yǎng)菌群對(duì)氯霉素的耐藥性，發(fā)現(xiàn)兩處污水處理廠總異養(yǎng)菌群對(duì)氯霉素的半抑制質(zhì)量濃度分別為29.6 mg·L-1和23.1 mg·L-1.而氯霉素對(duì)菌株N-1的最小抑菌質(zhì)量濃度為8.00 mg·L-1.相比可知，菌株N-1對(duì)氯霉素的耐藥性相對(duì)較弱.使用菌株N-1修復(fù)PAEs污染前應(yīng)先檢測(cè)修復(fù)環(huán)境中氯霉素的質(zhì)量濃度，不應(yīng)超過8.00 mg·L-1，否則修復(fù)環(huán)境中的氯霉素會(huì)抑制菌株N-1的生長，導(dǎo)致PAEs無法被降解去除.當(dāng)PAEs污染環(huán)境中氯霉素質(zhì)量濃度為4.00～8.00 mg·L-1時(shí)，使用該菌進(jìn)行修復(fù)應(yīng)至少延長12 h的降解時(shí)間，才能得到較好的PAEs去除效果.突尼斯城市廢水中氯霉素含量為3 ng·L-1［21］，姜蕾等［22］在甲魚養(yǎng)殖場(chǎng)廢水檢測(cè)出氯霉素質(zhì)量濃度低于0.1 μg·L-1，柯潤輝等［23］在上海某城市污水處理廠的初沉池檢測(cè)氯霉素的質(zhì)量濃度在14.4～26.8 ng·L-1之間，且在生化反應(yīng)池（A/A/O）和二沉池處理之后未檢出.由此可知，氯霉素在廢水中的質(zhì)量濃度遠(yuǎn)低于氯霉素對(duì)菌株N-1的最小抑菌質(zhì)量濃度，因此目前廢水中的氯霉素含量不影響菌株N-1對(duì)PAEs的生物降解.

2.3.2" 慶大霉素脅迫對(duì)PAEs高效降解菌N-1生長的影響

慶大霉素脅迫對(duì)PAEs高效降解菌N-1生長影響的結(jié)果見圖3.當(dāng)慶大霉素質(zhì)量濃度為0.25 mg·L-1時(shí)，菌株N-1對(duì)數(shù)生長期為12～72 h.而未添加慶大霉素時(shí)菌株N-1的對(duì)數(shù)生長期為4～36 h.慶大霉素對(duì)菌株N-1的最小抑菌質(zhì)量濃度為0.50 mg·L-1.陳朝瓊［24］發(fā)現(xiàn)慶大霉素對(duì)兩城市污水處理廠細(xì)菌菌群的半抑制質(zhì)量濃度分別為28.1 mg·L-1和25.4 mg·L-1.而本研究中慶大霉素對(duì)菌株N-1的最小抑菌質(zhì)量濃度為0.50 mg·L-1.相比可知，菌株N-1對(duì)慶大霉素的耐藥性相對(duì)較弱.慶大霉素口服吸收率較低，主要通過肌肉注射給藥，因此其不隨尿液代謝排出，主要排放在醫(yī)療廢水中，在其他廢水等水環(huán)境中含量較低.德國某地醫(yī)院醫(yī)療廢水發(fā)現(xiàn)慶大霉素的質(zhì)量濃度范圍在0.4～7.6 μg·L-1［25］，而慶大霉素對(duì)菌株N-1的最小抑菌質(zhì)量濃度遠(yuǎn)高于該廢水中慶大霉素的質(zhì)量濃度.因此，目前廢水中的慶大霉素含量不影響菌株N-1對(duì)PAEs的降解.使用菌株N-1對(duì)PAEs污染環(huán)境進(jìn)行生物修復(fù)前應(yīng)先檢測(cè)環(huán)境中慶大霉素的污染情況，其質(zhì)量濃度不應(yīng)超過0.50 mg·L-1，否則菌株N-1生長將受到抑制，不能獲得較好的PAEs修復(fù)效果.當(dāng)環(huán)境中慶大霉素質(zhì)量濃度為0.25～0.50 mg·L-1時(shí)，應(yīng)至少延長12 h的降解時(shí)間才能得到較好的PAEs去除效果.

2.3.3" 鹽酸四環(huán)素脅迫對(duì)PAEs高效降解菌N-1生長的影響

鹽酸四環(huán)素脅迫對(duì)PAEs高效降解菌N-1生長影響的結(jié)果見圖4.在未添加鹽酸四環(huán)素情況下，菌株N-1的對(duì)數(shù)生長期為4～36 h.當(dāng)鹽酸四環(huán)素質(zhì)量濃度為0.25～0.50 mg·L-1時(shí)，菌株N-1的對(duì)數(shù)生長期為8～36 h.當(dāng)鹽酸四環(huán)素質(zhì)量濃度為1.00～4.00 mg·L-1時(shí)，菌株N-1的對(duì)數(shù)生長期為12～48 h.當(dāng)鹽酸四環(huán)素質(zhì)量濃度繼續(xù)增加至8.00～16.00 mg·L-1時(shí)，菌株N-1的對(duì)數(shù)生長期為24～72 h.鹽酸四環(huán)素對(duì)菌株N-1的最小抑菌質(zhì)量濃度為32.00 mg·L-1.陸孫琴等［20］研究污水處理廠二級(jí)出水總異養(yǎng)菌群對(duì)四環(huán)素的耐藥性，發(fā)現(xiàn)四環(huán)素質(zhì)量濃度為16 mg·L-1時(shí)，總異養(yǎng)菌群數(shù)幾乎為0.陳朝瓊［24］研究的兩污水處理廠中，當(dāng)四環(huán)素質(zhì)量濃度為4 mg·L-1時(shí)，兩污水處理廠的可培養(yǎng)菌株迅速下降至8.5%和9.6%，當(dāng)四環(huán)素質(zhì)量濃度為16 mg·L-1時(shí)，兩污水處理廠可培養(yǎng)菌株比例分別為0和低于10%.由圖4可知，鹽酸四環(huán)素質(zhì)量濃度為8.00 mg·L-1時(shí)，菌株N-1在12 h內(nèi)生長受到抑制，而在24 h后菌株N-1生長正常.當(dāng)鹽酸四環(huán)素質(zhì)量濃度為16.00 mg·L-1時(shí)，菌株N-1在24 h內(nèi)生長受到抑制，而在36 h后菌株N-1生長正常.相比可知，菌株N-1對(duì)鹽酸四環(huán)素的耐藥性相對(duì)較強(qiáng).使用菌株N-1對(duì)PAEs污染環(huán)境進(jìn)行生物修復(fù)時(shí)，當(dāng)環(huán)境中四環(huán)素質(zhì)量濃度為8.00～16.00 mg·L-1時(shí)，應(yīng)至少延長24 h的降解時(shí)間，當(dāng)鹽酸四環(huán)素質(zhì)量濃度高于16.00 mg·L-1時(shí)，應(yīng)至少延長36 h的降解時(shí)間，才能得到較好的PAEs去除效果.我國污水處理廠污水中的四環(huán)素進(jìn)水質(zhì)量濃度在96～1 300 ng·L-1，出水質(zhì)量濃度在180～620 ng·L-1［22，26］.姜蕾等［22］在污水處理廠進(jìn)水和出水都未檢測(cè)出四環(huán)素，在養(yǎng)豬場(chǎng)原廢水中檢測(cè)四環(huán)素質(zhì)量濃度為31.1 μg·L-1.由此可知，四環(huán)素在廢水中的質(zhì)量濃度遠(yuǎn)低于四環(huán)素對(duì)菌株N-1的抑制質(zhì)量濃度，因此目前污水中存在的四環(huán)素不影響菌株N-1對(duì)PAEs的降解.

2.3.4" 利福平脅迫對(duì)PAEs高效降解菌N-1生長的影響

利福平脅迫對(duì)PAEs高效降解菌N-1生長影響的結(jié)果見圖5.當(dāng)利福平質(zhì)量濃度小于0.50 mg·L-1時(shí)，菌株N-1的對(duì)數(shù)生長期為4～36 h，與未添加利福平時(shí)菌株N-1的對(duì)數(shù)生長期一致.當(dāng)利福平質(zhì)量濃度為1.00～2.00 mg·L-1時(shí)，菌株N-1的對(duì)數(shù)生長期為8～48 h.當(dāng)利福平質(zhì)量濃度繼續(xù)增加至4.00～16.00 mg·L-1時(shí)，菌株N-1的對(duì)數(shù)生長期為12～72 h.利福平對(duì)菌株N-1的最小抑菌質(zhì)量濃度為32.00 mg·L-1.劉佳佳等［27］在植物組織中分離的兩株植物內(nèi)生菌在10 mg·L-1利福平下不能生存.陸孫琴等［20］研究污水處理廠二級(jí)出水總異養(yǎng)菌群對(duì)利福平的耐藥性，發(fā)現(xiàn)利福平質(zhì)量濃度為32 mg·L-1時(shí)總異養(yǎng)菌群數(shù)幾乎為0.金明蘭等［28］研究的污水廠二級(jí)出水中當(dāng)利福平質(zhì)量濃度為16 mg·L-1時(shí)，利福平耐藥菌株比例低于10%，當(dāng)利福平質(zhì)量濃度為32 mg·L-1時(shí)，利福平耐藥菌株比例接近于零.由圖5可知，利福平對(duì)菌株N-1的最小抑菌質(zhì)量濃度為32.00 mg·L-1.相比可知，菌株N-1與現(xiàn)階段污水處理廠二級(jí)出水總異養(yǎng)菌群對(duì)利福平的耐藥性相似.使用菌株N-1對(duì)PAEs污染環(huán)境進(jìn)行生物修復(fù)時(shí)要求環(huán)境中利福平的質(zhì)量濃度不應(yīng)超過32.00 mg·L-1，否則將會(huì)抑制菌株N-1生長，從而導(dǎo)致PAEs無法被降解去除.當(dāng)環(huán)境中利福平質(zhì)量濃度為16.00～32.00 mg·L-1時(shí)，應(yīng)至少延長12 h的降解時(shí)間，才能得到較好的PAEs去除效果.

總的來說，本課題組前期篩選到了一株能高效降解PAEs的植物內(nèi)生菌N-1［29］，該菌株對(duì)不同類型抗生素的耐藥性不同，對(duì)不同質(zhì)量濃度抗生素的耐藥性也不同.菌株N-1對(duì)4種不同抗生素的耐藥性由小到大的順序依次為：慶大霉素，氯霉素，鹽酸四環(huán)素（利福平）（表1）.藥物外排是細(xì)菌耐抗生素的主要機(jī)制之一，耐藥菌株通過排出胞內(nèi)抗生素來降低對(duì)抗生素的敏感度.藥物外排泵是抗生素排出的主要通道，其廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞膜中，Bacillus subtilis的細(xì)胞膜含有多個(gè)小型多藥耐藥（SMR）家族外排泵，這可能是菌株N-1對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要原因，值得被進(jìn)一步研究.抗生素對(duì)環(huán)境中的大多數(shù)細(xì)菌具有抑制或者殺滅的作用，抗生素污染嚴(yán)重影響污染環(huán)境的微生物修復(fù)，使得修復(fù)效果不理想.分離環(huán)境中一些兼具耐藥性和降解功能的專性降解菌，有助于推動(dòng)生物修復(fù)技術(shù)的開發(fā)和發(fā)展.

3" 結(jié)" 論

本研究的對(duì)象為一株能高效降解PAEs的植物內(nèi)生菌Bacillus subtilis N-1，能分泌吲哚乙酸.不同抗生素對(duì)菌株N-1的最小抑菌質(zhì)量濃度為：慶大霉素0.50 mg·L-1、氯霉素8.00 mg·L-1、鹽酸四環(huán)素32.00 mg·L-1和利福平32.00 mg·L-1.目前污水中抗生素質(zhì)量濃度遠(yuǎn)低于菌株N-1的最小抑菌質(zhì)量濃度，因此目前污水中的抗生素不影響菌株N-1對(duì)PAEs的降解.菌株N-1具有較大的PAEs污染修復(fù)范圍，具有較大的應(yīng)用前景.

參" 考" 文" 獻(xiàn)

［1］ ""XIONG Y H，PEI D S.A review on efficient removal of phthalic acid esters via biochars and transition metals-activated persulfate systems［J］.Chemosphere，2021，277：130256.

［2］WANG Z M，MA J C，WANG T T，et al.Environmental health risks induced by interaction between phthalic acid esters（PAEs） and biological macromolecules：a review［J］.Chemosphere，2023，328：138578.

［3］SUN F H，TAO Y R，SHI D，et al.Ecological risk assessment of phthalate esters（DBP and DEHP） in surface water of China［J］.Frontiers in Environmental Science，2021，9：710125.

［4］YAN Y Y，ZHU F X，ZHU C Y，et al.Dibutyl phthalate release from polyvinyl chloride microplastics：Influence of plastic properties and environmental factors［J］.Water Research，2021，204：117597.

［5］HU R W，ZHAO H M，XU X H，et al.Bacteria-driven phthalic acid ester biodegradation：Current status and emerging opportunities［J］.Environment International，2021，154：106560.

［6］WANG L，GAN D P，GONG L，et al.Analysis of the performance of the efficient di-（2-ethylhexyl） phthalate-degrading bacterium Rhodococcus pyridinovorans DNHP-S2 and associated catabolic pathways［J］.Chemosphere，2022，306：135610.

［7］FANG Y，ZHANG L S，WANG J，et al.Identification of the di-n-butyl phthalate-biodegrading strains and the biodegradation pathway in strain LMB-1［J］.Applied Biochemistry and Microbiology，2017，53（3）：310-317.

［8］LI J L，ZHANG J F，YADAV M P，et al.Biodegradability and biodegradation pathway of di-（2-ethylhexyl） phthalate by Burkholderia pyrrocinia B1213［J］.Chemosphere，2019，225：443-450.

［9］WANG Y Y，ZHAN W H，REN Q，et al.Biodegradation of di-（2-ethylhexyl） phthalate by a newly isolated Gordonia sp.and its application in the remediation of contaminated soils［J］.Science of the Total Environment，2019，689：645-651.

［10］WANG Y，LIU H，PENG Y E，et al.New pathways for the biodegradation of diethyl phthalate by Sphingobium yanoikuyae SHJ［J］.Process Biochemistry，2018，71：152-158.

［11］YANG X，ZHANG C，HE Z，et al.Isolation and characterization of two n-butyl benzyl phthalate degrading bacteria［J］.International Biodeterioration amp; Biodegradation，2013，76：8-11.

［12］FENG N X，F(xiàn)ENG Y X，LIANG Q F，et al.Complete biodegradation of di-n-butyl phthalate（DBP） by a novel Pseudomonas sp.YJB6［J］.Science of the Total Environment，2021，761：143208.

［13］SHARIATI S，POURBABAEE A A，ALIKHANI H A，et al.Anaerobic biodegradation of phthalic acid by an indigenous Ralstonia pickettii strain SHAn2 isolated from Anzali international wetland［J］.International Journal of Environmental Science and Technology，2022，19（6）：4827-4838.

［14］WANG P，GAO J J，ZHAO Y，et al.Biodegradability of di-（2-ethylhexyl） phthalate by a newly isolated bacterium Achromobacter sp.RX［J］.Science of the Total Environment，2021，755：142476.

［15］ZHAO Z Z，LIU C，XU Q Q，et al.Characterization and genomic analysis of an efficient dibutyl phthalate degrading bacterium Microbacterium sp.USTB-Y［J］.World Journal of Microbiology amp; Biotechnology，2021，37（12）：212.

［16］ZHU X Z，NI X，WAIGI M G，et al.Biodegradation of mixed PAHs by PAH-degrading endophytic bacteria［J］.International Journal of Environmental Research and Public Health，2016，13（8）：805.

［17］PANIGRAHI S，MOHANTY S，RATH C C.Characterization of endophytic bacteria Enterobacter cloacae MG00145 isolated from Ocimum sanctum with Indole Acetic Acid（IAA） production and plant growth promoting capabilities against selected crops［J］.South African Journal of Botany，2020，134：17-26.

［18］HUANG F Y，AN Z Y，MORAN M J，et al.Recognition of typical antibiotic residues in environmental media related to groundwater in China（2009-2019）［J］.Journal of Hazardous Materials，2020，399：122813.

［19］CYCON′M，MROZIK A，PIOTROWSKA-SEGET Z.Antibiotics in the soil environment-degradation and their impact on microbial activity and diversity［J］.Frontiers in Microbiology，2019，10：338.

［20］陸孫琴，李軼，黃晶晶，等.污水處理廠二級(jí)出水中總異養(yǎng)菌群對(duì)6種抗生素的耐受性研究［J］.環(huán)境科學(xué)，2011，32（11）：3419-3424.

LU S Q，LI Y，HUANG J J，et al.Antibiotic resistance of bacteria to 6 antibiotics in secondary effluents of municipal wastewater treatment plants［J］.Environmental Science，2011，32（11）：3419-3424.

［21］TAHRANI L，VAN LOCO J，BEN MANSOUR H，et al.Occurrence of antibiotics in pharmaceutical industrial wastewater，wastewater treatment plant and sea waters in Tunisia［J］.Journal of Water and Health，2016，14（2）：208-213.

［22］姜蕾，陳書怡，楊蓉，等.長江三角洲地區(qū)典型廢水中抗生素的初步分析［J］.環(huán)境化學(xué)，2008，27（3）：371-374.

JIANG L，CHEN S Y，YANG R，et al.Occurrence of antibiotics in the aquatic environment of the Changjiang delta，China［J］.Environmental Chemistry，2008，27（3）：371-374.

［23］柯潤輝，蔣愉林，黃清輝，等.上海某城市污水處理廠污水中藥物類個(gè)人護(hù)理用品（PPCPs）的調(diào)查研究［J］.生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2014，9（6）：1146-1155.

KE R H，JIANG Y L，HUANG Q H，et al.Investigative screening of pharmaceuticals in a municipal wastewater treatment plant in Shanghai［J］.Asian Journal of Ecotoxicology，2014，9（6）：1146-1155.

［24］陳朝瓊.城市污水處理廠所出水中的細(xì)菌對(duì)抗生素耐性的研究［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（20）：312-316.

CHEN Z Q.Antibiotic resistance of bacteria in effluents of municipal wastewater treatment plants［J］.Chinese Agricultural Science Bulletin，2012，28（20）：312-316.

［25］LFFLER D，TERNES T A.Analytical method for the determination of the aminoglycoside gentamicin in hospital wastewater via liquid chromatography-electrospray-tandem mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2003，1000（1/2）：583-588.

［26］WANG J L，CHU L B，WOJNROVITS L，et al.Occurrence and fate of antibiotics，antibiotic resistant genes（ARGs）and antibiotic resistant bacteria（ARB） in municipal wastewater treatment plant：an overview［J］.Science of the Total Environment，2020，744：140997.

［27］劉佳佳，馬竹鳳，閆淑珍.植物內(nèi)生細(xì)菌對(duì)利福平的抗性及紫外誘變研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（18）：9580-9581.

LIU J J，MA Z F，YAN S Z.Study on determination of endophytic bacteria resistance to rifampin and its UV-mutagenesis［J］.Journal of Anhui Agricultural Sciences，2010，38（18）：9580-9581.

［28］金明蘭，孫世梅，趙玉鑫，等.污水廠二級(jí)出水中抗生素抗性菌殘留及其特性［J］.中國給水排水，2016，32（23）：92-95.

JIN M L，SUN S M，ZHAO Y X，et al.Residual of antibiotic-resistant bacteria and their characteristics in secondary effluent of municipal WWTP［J］.China Water amp; Wastewater，2016，32（23）：92-95.

［29］HUANG Y H，HUANG X J，CHEN X H，et al.Biodegradation of di-butyl phthalate（DBP） by a novel endophytic bacterium Bacillus subtilis and its bioaugmentation for removing DBP from vegetation slurry［J］.Journal of Environmental Management，2018，224：1-9.

Study on antibiotic resistance of endophytic bacterium efficiently degrading phthalates

Lü Huixiong1， Huang Xuejing1，2

（1. College of Natural Resources and Environment， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China; 2. School of Life Sciences and Biotechnology; State Key Laboratory of Microbial Metabolism， Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200240， China）

Abstract： Microbial degradation is considered as one of the most promising methods for repairing phthalates（PAEs）. However， most highly efficient PAEs-degrading bacteria isolated from the environment are pathogenic or conditional pathogens. Endophytic bacteria are non-pathogenic bacteria. It is of great practical significance to isolate highly efficient PAEs-degrading endophytic bacteria. Bacillus subtilis N-1 was the research object in this study， which was an endophytic bacterium selected from a contaminated plant. Strain N-1 could grow using two types of PAEs as sole carbon source and energy source， which were dibutyl phthalate（DBP） and di（2-ethylhexyl）phthalate（DEHP）. Its growth habits were explored， including the secretion of indole-3-acetic acid and the resistance to four antibiotics. The results showed that adding tryptophan could promote strain N-1 to secret indole-3-acetic acid. What's more， 0.50 mg·L-1 gentamycin， 8.00 mg·L-1 chloramphenicol， 32.00 mg·L-1 tetracycline and 32.00 mg·L-1 rifampicin were the minimum inhibitory mass concentrations for strain N-1. At present， the concentration of antibiotics in wastewater is much lower than the minimum inhibitory mass concentration of strain N-1. Strain N-1 has a wide range of application for repairing PAEs pollution and has good prospects for application.

Keywords： phthalates; degradation; endophytic bacterium; indole-3-acetic acid; antibiotic resistance

［責(zé)任編校" 趙曉華" 陳留院］