摘要：【目的】通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較天子藍(lán)盤(pán)麗魚(yú)和野生阿蓮卡盤(pán)麗魚(yú)皮膚組織中與體色形成相關(guān)的基因 表達(dá)模式，為深入研究魚(yú)類(lèi)體色及良種選育提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，也為盤(pán)麗魚(yú)或其他水產(chǎn)魚(yú)類(lèi)進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究提供 技術(shù)借鑒。【方法】利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)天子藍(lán)（人工選育）和阿蓮卡（野生型）2種盤(pán)麗魚(yú)的皮膚組織進(jìn)行轉(zhuǎn) 錄組測(cè)序，經(jīng)fastp質(zhì)控過(guò)濾后，通過(guò)Cell Ranger比對(duì)參考基因組生成單細(xì)胞表達(dá)矩陣文件，使用Seurat進(jìn)行降維聚類(lèi) 后構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組圖譜，篩選出細(xì)胞類(lèi)型識(shí)別與鑒定的標(biāo)記基因；同時(shí)以阿蓮卡盤(pán)麗魚(yú)為對(duì)照，通過(guò)DEGseq篩選出2個(gè)樣本間的差異表達(dá)基因（DEGs），并進(jìn)行GO功能注釋分析和KEGG信號(hào)通路富集分析?！窘Y(jié)果】經(jīng)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從天子藍(lán)、阿蓮卡盤(pán)麗魚(yú)樣本中獲得的原始序列（Raw reads）分別為815237286和728886552條；將2個(gè)樣本整合后共捕獲17035個(gè)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)濾及降維聚類(lèi)后得到18個(gè)細(xì)胞簇（C0～C17），參考已知和潛在的標(biāo)記基因，被注釋為13種細(xì)胞類(lèi)型及其亞型，基本涵蓋了魚(yú)類(lèi)皮膚組織中的大部分細(xì)胞類(lèi)型。基于偽批量（Pseudo-bulk）處理，從2個(gè)樣本間篩選出20個(gè)DEGs（8個(gè)在天子藍(lán)盤(pán)麗魚(yú)皮膚組織中高表達(dá)，12個(gè)在阿蓮卡盤(pán)麗魚(yú)皮膚組織中高表達(dá)），主要注釋到與氣體傳遞、氧化代謝相關(guān)的GO功能條目。在單細(xì)胞維度，選擇黑色素細(xì)胞和虹彩細(xì)胞2個(gè)細(xì)胞集群進(jìn)行樣本間差異分析，結(jié)果顯示：在黑色素細(xì)胞中存在8個(gè)DEGs，主要富集于熱應(yīng)答、未折疊蛋白結(jié)合、生長(zhǎng)因子活性、金屬離子結(jié)合等信號(hào)通路。在虹彩細(xì)胞中存在25個(gè)DEGs，KEGG信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)主要富集于凋亡、沙門(mén)氏菌感染和MAPK等信號(hào)通 路，涉及細(xì)胞生存、應(yīng)激響應(yīng)和信號(hào)傳導(dǎo)等功能。【結(jié)論】TSPAN3A、PTGES、ATF3、JUNK、GADD45GA、HSP70L、FOSAB 等基因在調(diào)節(jié)天子藍(lán)盤(pán)麗魚(yú)皮膚體色、色素合成與沉著等方面發(fā)揮重要作用，而黑色素合成不活躍可能是導(dǎo)致天子 藍(lán)盤(pán)麗魚(yú)體色較阿蓮卡盤(pán)麗色更加鮮艷和絢麗的主要原因之一。

關(guān)鍵詞：盤(pán)麗魚(yú)；單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；標(biāo)記基因；色素細(xì)胞；體色

文章編號(hào)：2095-1191（2024）03-0601-10

中圖分類(lèi)號(hào)：S965.819

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Single–cell transcriptome sequencing of skin tissue in bluediscus fish （Symphysodon spp.）

YANG Ping1， LIU Jie1， CHEN Zai-zhong*， LU Ying1*

（1Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources （Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China; 2Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources， Ministry of Agriculture and Rural

Affairs（Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China）

Abstract：[Objective】 To profile and compare the expression patterns of the genes involved in formation of body color between the skin tissues of blue discus fish and wild Alenquer discus fish through a single-cell transcriptome se- quencing， which provided the data basis for further study of body color and breeding， as well as the technical reference for the single-cell transcriptome studies in discus fish and other fishes. 【Method】Using the single-cell transcriptome se- quencing technology， transcriptome sequencing was performed on the skin tissues of blue discus fish （bred strain） and Alenquer discus fish （wild type）. The expression matrix of single-cell data was generated by Cell Ranger alignment against reference genomes after fastp quality control filtration， which was used for dimensionality reduction clustering to construct transcriptome atlas by Seurat and indentification of cell types referencing the marker genes. The differentially expressed genes （DEGs） between the two samples were identified by DEGseq， which was annotated through the GO functional analysis and KEGG pathway enrichment. 【Result]Through single-cell transcriptome sequencing， up to 815237286 and 728886552 raw reads were generated in blue discus and Alenquer discus， respectively. A total of 17035 cells were cap- tured after the integration of the two samples' data， which built 18 clusters （C0-C17） after filtering and dimensionality re- duction. Referred to known and potential marker genes， these clusters were divided into 13 cell types and their subtypes， which encompassed most of the cell types in fish skin. Based on pseudo-bulk treatment， 20 DEGs were detected from the 2 samples （8 were highly expressed in blue discus and 12 were highly expressed in Alenquer discus）， mainly annotated to GO functional terms of gas transport and oxidative metabolism. In the single-cell dimension， two cell clusters of mela- nocytes and iridophore were selected for inter-sample difference analysis， which detected eight DEGs in melanocytes， in- volving in response to heat， cytoplasm， unfolded protein binding， growth factor activity and metal ion binding. Twenty- five DEGs were found in iridophore， which were mainly employed in the signaling pathwasy， such as apoptosis， Salmo- nella infection and MAPK， cell survival， stress response and signaling. 【Conclusion】TSPAN3A， PTGES， ATF3， JUNK， GADD45GA， HSP70L and FOSAB genes play an important role in regulation of pigment biosynthesis and pigmentation of blue discus fish skin. The inactive synthesis of melanin probably results in more vivid and gorgeous body color in blue dis- cus than Alenquer discus.

Key words： discus fish; single-cell transcriptome sequencing; marker gene; pigment cell; body color

Foundation items： Blue Granary Science and Technology Innovation Project of National Key Research and Development Program of China （2022YFD2400804）

0 引言

【研究意義]盤(pán)麗魚(yú)（Symphysodon spp.）俗稱(chēng)七彩神仙魚(yú)，隸屬于慈鯛科（Cichlidae），因其鮮艷多彩 的體色和獨(dú)特的體型而備受養(yǎng)魚(yú)愛(ài)好者青睞（劉怡 南等，2020）。體色作為盤(pán)麗魚(yú)的重要屬性，不僅能 反映其生理健康，還決定了觀賞價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)格。 魚(yú)類(lèi)體色的形成涉及復(fù)雜分子機(jī)制，包括色素細(xì)胞 發(fā)育、色素合成與沉積等多個(gè)環(huán)節(jié)（程云生等，2015）， 因此，挖掘分析與盤(pán)麗魚(yú)體色相關(guān)的基因，了解其關(guān) 鍵基因及信號(hào)通路，對(duì)揭示盤(pán)麗魚(yú)體色調(diào)控機(jī)制具 有重要意義，同時(shí)可為選育體色穩(wěn)定遺傳的盤(pán)麗魚(yú) 品系提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】魚(yú)類(lèi)體色之所 以豐富多彩，是由于其皮膚組織含有不同類(lèi)型的色 素細(xì)胞，包括黑色素細(xì)胞、紅色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞、 白色素細(xì)胞及虹彩細(xì)胞（鳥(niǎo)糞素細(xì)胞）（Fadeev et al.， 2016；韋玲靜等，2020）。皮膚組織中的呈色物質(zhì)分 別是黑色素細(xì)胞的黑色素及紅、黃色素細(xì)胞的嘧啶 和類(lèi)胡蘿卜素，但只有黑色素和嘧啶都能在魚(yú)體內(nèi) 自我合成，而類(lèi)胡蘿卜素必須通過(guò)食物、環(huán)境等方式 從外界攝入補(bǔ)充（劉曉東和陳再忠，2008）。虹彩細(xì)胞本身不含色素，但含有鳥(niǎo)嘌呤晶體所構(gòu)成的反射小板，通過(guò)反射特定波長(zhǎng)的光來(lái)顯色（田浚杉等， 2024）。這些色素細(xì)胞的數(shù)量組成及其在皮膚組織 中的分布情況，形成了魚(yú)類(lèi)絢麗的體色和斑紋。如 斑馬魚(yú)具有交替的深色和淺色水平條紋，是由三類(lèi) 色素細(xì)胞（黑色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞和虹彩細(xì)胞）的精確排列而產(chǎn)生（Patterson and Parichy，2019）。馮 彩等（2020）通過(guò)對(duì)不同體色草金魚(yú)的背部鱗片色素 細(xì)胞進(jìn)行觀察，確定4種色素細(xì)胞形狀、組成和密度的不同形成了草金魚(yú)多彩的體色；周康奇等（2020） 研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)質(zhì)血鸚鵡魚(yú)體內(nèi)的黑色素細(xì)胞和黃色 素細(xì)胞少，而皮膚和鱗片上大量分布有紅色素細(xì)胞。 至今，針對(duì)盤(pán)麗魚(yú)體色的相關(guān)研究主要集中在影響 因素和調(diào)控機(jī)制2個(gè)方面。在影響因素方面，有研 究發(fā)現(xiàn)添加適量的蝦青素不僅能增強(qiáng)盤(pán)麗魚(yú)顯色 （黃璞等，2011），還能改善其形體（Song et al.， 2017）；王磊等（2016）研究證實(shí)，在飼料中加入葉黃 素可有效改善盤(pán)麗魚(yú)體表黃色，提高肝臟總抗氧化 能力。在調(diào)控機(jī)制方面，Yang等（2021）通過(guò)比較代 謝組學(xué)分析藍(lán)色、黃色、白色盤(pán)麗魚(yú)的代謝物含量， 發(fā)現(xiàn)黃色個(gè)體蝦青素含量更高，與脂質(zhì)代謝、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑及不飽和脂肪酸生物合成更豐富有 關(guān)，而藍(lán)色個(gè)體富含腺嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤；李 中軍等（2022）通過(guò)研究全藍(lán)、白化全藍(lán)、全白盤(pán)麗魚(yú) 皮膚組織轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)其差異表達(dá)基因（Differen- tially expressed genes，DEGs）主要富集在氧化磷酸 化、檸檬酸循環(huán)、嘌呤合成及肌動(dòng)蛋白組織等信號(hào)通 路上；吉鈺等（2023）對(duì)盤(pán)麗魚(yú)的全藍(lán)型群體和白化 藍(lán)型群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)USP43、FGFR2、DENND4、MLL1基因可能與其體色形成密切相關(guān)；Ng等（2023）通過(guò)對(duì)野生型盤(pán)麗魚(yú)皮膚不同 顏色進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)條紋形成區(qū)域皮膚 組織的關(guān)鍵調(diào)控基因包括ERBB4、ADCY9、WNT2、14-3-3和TSPAN。【本研究切入點(diǎn)】盤(pán)麗魚(yú)不同品系 間的體色、斑紋差異明顯，但其種內(nèi)遺傳距離很小、 遺傳信息差異不明顯（陳信忠等，2016），傳統(tǒng)的組學(xué) 研究對(duì)象多為組織或個(gè)體，細(xì)胞間存在的異質(zhì)性通 常被忽略。盤(pán)麗魚(yú)皮膚組織中的細(xì)胞群體，尤其是色素細(xì)胞的差異和互作關(guān)系對(duì)體色的形成與調(diào)控影 響極大，利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)能對(duì)單個(gè)細(xì)胞 進(jìn)行測(cè)序，捕獲單個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)信息，更深入地 理解細(xì)胞群體內(nèi)部的多樣性和復(fù)雜性，提供更全面 的基因表達(dá)圖譜，而有助于揭示影響盤(pán)麗魚(yú)體色形 成的分子機(jī)制。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】構(gòu)建單細(xì)胞轉(zhuǎn) 錄組測(cè)序的盤(pán)麗魚(yú)皮膚組織圖譜，篩選出皮膚組織 細(xì)胞潛在的標(biāo)記基因，并從天子藍(lán)和阿蓮卡品系盤(pán) 麗魚(yú)皮膚組織中篩選出與體色有關(guān)的DEGs，為深入 研究魚(yú)類(lèi)體色及選育優(yōu)良物種提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，也為 盤(pán)麗魚(yú)或其他水產(chǎn)魚(yú)類(lèi)進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序提供 技術(shù)借鑒。

1材料與方法

1.1材料取樣與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

供試動(dòng)物為人工選育的雌性天子藍(lán)盤(pán)麗魚(yú)（體 色為深藍(lán)色，簡(jiǎn)稱(chēng)TZL）和野生型雌性阿蓮卡盤(pán)麗魚(yú)（體色為紅棕色，簡(jiǎn)稱(chēng)為AD），2種盤(pán)麗魚(yú)體色均穩(wěn) 定遺傳（圖1），由上海海洋大學(xué)觀賞水族養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室 提供。取樣時(shí)，將盤(pán)麗魚(yú)置于低溫環(huán)境中，每尾魚(yú)選 取3塊2cm2左右的區(qū)域，刮除表面鱗片后用無(wú)菌手 術(shù)刀將皮膚組織切割成若干小塊，以PBS沖洗2遍，放入2mL的EP管中，并立即加入組織保存液，確保樣品全部浸潤(rùn)。隨后將EP管插入碎冰中固定，送至 上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成懸液制備和轉(zhuǎn) 錄組測(cè)序。上機(jī)采用10×Genomics平臺(tái)的油滴包裹單細(xì)胞微反應(yīng)體系GEMs，實(shí)現(xiàn)cDNA擴(kuò)增和片段化處理，利用Qubit構(gòu)建并定量二代測(cè)序文庫(kù)，構(gòu)建完 成的文庫(kù)采用PE150測(cè)序模式在Illumina HiSeq平 臺(tái)完成測(cè)序。

1.2測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估及預(yù)處理

下機(jī)后的原始數(shù)據(jù)（Raw data）通過(guò)fastp進(jìn)行基本的統(tǒng)計(jì)和質(zhì)量評(píng)估，隨后使用10×Genomics官方 提供的Cell Ranger進(jìn)行預(yù)處理。運(yùn)用Cell Ranger中的mkref子命令對(duì)盤(pán)麗魚(yú)的參考基因組（由wtdbg2組裝和EVidenceModeler預(yù)測(cè)而得）和GTF注釋文 件建立索引，隨后使用另一子命令Count對(duì)數(shù)據(jù)質(zhì) 量進(jìn)行評(píng)估和測(cè)定，并將下機(jī)后的fastq文件通過(guò) STAR功能比對(duì)到索引上，最終生成用于單細(xì)胞下游分析的單細(xì)胞表達(dá)矩陣文件（Dobin et al.，2013）。

1.3多樣本整合及批次效應(yīng)去除

采用Seura自帶的CCA方法整合TZL組和AD 組數(shù)據(jù)集并去除批次效應(yīng)。尋找批次間的最小互近鄰（Mutual nearest neighbor，MNN），使用FindInte- grationAnchors函數(shù)識(shí)別錨點(diǎn)細(xì)胞，然后將這些錨點(diǎn)傳遞給IntegrateData函數(shù)，再根據(jù)這些細(xì)胞對(duì)計(jì)算 校正因子，用于整合樣本和校正批次效應(yīng)。

1.4降維聚類(lèi)與細(xì)胞類(lèi)型注釋

采用R的 Seurat 包創(chuàng)建分析對(duì)象，在質(zhì)控基礎(chǔ) 上進(jìn)一步過(guò)濾，過(guò)濾掉捕獲基因數(shù)量大于2500和基 因數(shù)量小于200及線(xiàn)粒體基因比例大于5%的細(xì)胞； 隨后采用全局縮放歸一化方法“l(fā)og Normalize”，設(shè) 參數(shù)“scale.factor=10000”標(biāo)準(zhǔn)化處理，使用FindVari- ableFeatures函數(shù)抓取顯著差異的2000個(gè)高度可變 特征基因，用于主成分分析（PCA）。使用RunPCA對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行降維處理，隨后通過(guò)ElbowPlot函數(shù)選定肘點(diǎn)，以此確定降維聚類(lèi)的PC值，接著以Find- Neighbors 函數(shù)構(gòu)建K鄰近（K-nearest neighbor，KNN） 網(wǎng)絡(luò)圖，dims參數(shù)設(shè)為確定的PC值。聚類(lèi)分析時(shí)利用FindClusters函數(shù)通過(guò)調(diào)節(jié)分辨率大?。?.4～1.2）對(duì)KNN網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分群，Seurat提供多種非線(xiàn)性降 維方法，包括UMAP和TSNE；通過(guò)函數(shù)RunUMAP和RunTSNE分別進(jìn)行UMAP和TSNE降維聚類(lèi)分 析，再利用Vlnplot、Featureplot和dotplot 等方法將 FindMarker檢索到細(xì)胞簇（Cluster）中高表達(dá)基因的 表達(dá)情況可視化，以斑馬魚(yú)和尼羅羅非魚(yú)（與盤(pán)麗魚(yú) 同慈鯛科）為參考，通過(guò)BLASTp方式注釋基因，細(xì)胞 類(lèi)型識(shí)別使用斑馬魚(yú)研究或報(bào)道過(guò)的標(biāo)記基因，以 及FishGET數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行輔助鑒定（Guo et al.，2023）。

1.5DEGs篩選及其功能注釋分析

使用Seurat的 AverageExpression 函數(shù)獲取所有 基因在不同分組或分群下的表達(dá)均值列表，通過(guò)DEGseq包的DEGexp2函數(shù)，選用MARS基于MA圖的隨機(jī)抽樣模型方法（Wang et al.，2010），將其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值，以TZL為試驗(yàn)組，AD為對(duì)照組，DEGs篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2Fold Changegt;1且Plt;0.05。然后，利用DAVID工具對(duì)DEGs進(jìn)行GO功能注釋分析和KEGG信號(hào)通路富集分析，并以R中的ClusterPro-filer、enrichplot和ggplot2包進(jìn)行可視化。

2結(jié)果與分析

2.1單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜構(gòu)建情況

2.1.1數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果 通過(guò)fastp對(duì)10xGenomics 下機(jī)后的TZL組和AD組Raw data進(jìn)行質(zhì)控并統(tǒng) 計(jì)。TZL組和AD組獲得的原始序列（Raw reads）分別為815237286和728886552條。2個(gè)樣本的Q20超過(guò)96.00%、Q30超過(guò)91.00%，GC含量分別為48.58%和47.28%，堿基錯(cuò)誤率在0.02%～0.04%（未超過(guò) 1.00%的標(biāo)準(zhǔn)線(xiàn)），即測(cè)序數(shù)據(jù)符合下游分析要求。 通過(guò)Cell Ranger的Count子命令生成單細(xì)胞下游分 析的表達(dá)矩陣，儲(chǔ)存在barcodes.tsv.gz、features.tsv.gz 和matrix.mtx.gz的3個(gè)壓縮文件，同時(shí)對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行 統(tǒng)計(jì)和評(píng)估，得知2個(gè)樣本捕獲的細(xì)胞數(shù)分別為 8856和8255個(gè)，基因中位數(shù)為655和791個(gè)。

2.1.2數(shù)據(jù)整合及批次效應(yīng)去除效果

通過(guò)merge 將TZL組和AD組2個(gè)樣本數(shù)據(jù)整合成1個(gè)數(shù)據(jù)集 進(jìn)行分析（以下簡(jiǎn)稱(chēng)Discus 2），共捕獲17035個(gè)細(xì) 胞。首先要去除批次效應(yīng)，若不去除，合并數(shù)據(jù)在降 維后樣本與樣本分開(kāi)，無(wú)法很好地混合（圖2），而導(dǎo) 致后續(xù)分簇時(shí)基因表達(dá)變化的定量分析受批次效應(yīng) 影響，使得原本聚類(lèi)在一起的細(xì)胞被分成不同簇，進(jìn) 而影響細(xì)胞亞群鑒定的準(zhǔn)確性及下游分析結(jié)果。

2.1.3降維聚類(lèi)和細(xì)胞類(lèi)型注釋結(jié)果

Discus 2降維后選取PC值為15，選擇的分辨率為0.5，共鑒定出 18個(gè)細(xì)胞簇。由圖3可知，部分基因只在特定的細(xì) 胞簇中表達(dá)，可將此類(lèi)基因作為潛在的Marker用于 注釋細(xì)胞類(lèi)型。為了更好地鑒定細(xì)胞類(lèi)型，標(biāo)記基 因主要選自于斑馬魚(yú)。相對(duì)于盤(pán)麗魚(yú)，斑馬魚(yú)的研究更廣泛，標(biāo)記基因的功能和表達(dá)模式分析更全面， 是一個(gè)很好的參考標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)pt.size為2時(shí)繪制出的細(xì)胞圖譜（圖4-A），細(xì)胞簇編號(hào)分別為C0～C17，共18個(gè)細(xì)胞簇，其中部分細(xì)胞簇聚集在一起（C0～C5），故推測(cè)這6個(gè)細(xì)胞 簇是相同的細(xì)胞類(lèi)型；其余細(xì)胞簇則分離散開(kāi)， 可能是獨(dú)立的細(xì)胞類(lèi)型。通過(guò)與參考標(biāo)記基因 的比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)18個(gè)細(xì)胞簇分別被注釋為表皮細(xì) 胞（Epidermal cells，C0～C5）、基底細(xì)胞（Basal cells， C6）、上皮細(xì)胞（Epithelial cells，C7）、成纖維類(lèi)上皮 細(xì)胞（Fibroblasts-epithelial cells，C8）、類(lèi)上皮細(xì)胞 （Epithelial-related cells，C9）、紅細(xì)胞（Erythroid cells， C10）、杯狀細(xì)胞（Goblet cells，C11）、成纖維細(xì)胞 （Fibroblasts，C12）、免疫細(xì)胞（Immune cells，C13）、 表皮巨噬細(xì)胞（Epidermal-macrophage cells，C14）、內(nèi) 皮細(xì)胞（Endothelial cells，C15）、黑色素細(xì)胞（Mela- nocyte，C16）及虹彩細(xì)胞（Iridophore，C17）（圖4-B）。 其中，紅細(xì)胞的出現(xiàn)可能是取樣過(guò)程中劃破皮膚導(dǎo) 致血液滲出，也可能是取樣時(shí)生物體應(yīng)激導(dǎo)致皮膚 毛細(xì)血管擴(kuò)充造成皮膚充血，而導(dǎo)致取樣時(shí)有紅細(xì) 胞混入。大部分細(xì)胞群的細(xì)胞類(lèi)型是通過(guò)細(xì)胞已知的標(biāo)記基因進(jìn)行注釋?zhuān)瑑H少數(shù)類(lèi)群通過(guò)多個(gè)潛在的 Marker綜合評(píng)估以完成細(xì)胞鑒定。

2.2DEGs篩選及其功能注釋分析結(jié)果

2.2.1未去批次效應(yīng)前的DEGs分析

傳統(tǒng)的轉(zhuǎn) 錄組只能對(duì)整個(gè)組織或器官進(jìn)行測(cè)序分析，獲得每 個(gè)基因在整個(gè)樣本的平均表達(dá)情況。經(jīng)偽批量（Pseudo-bulk）處理后（Chaffin et al.，2022），從2個(gè)單 細(xì)胞測(cè)序樣本間篩選出20個(gè)DEGs，相對(duì)于AD組而言，TZL組中有8個(gè)DEGs上調(diào)表達(dá)、12個(gè)DEGs下調(diào)表達(dá)。GO功能注釋分析結(jié)果（圖5）顯示，20個(gè)DEGs 被注釋到分子功能（Molecular function）、細(xì)胞組分（Cellular component）及生物學(xué)過(guò)程（Biologicalprocess）三大功能類(lèi)別上。在分子功能類(lèi)別上，主要注釋到核糖體結(jié)構(gòu)成分（Structural componentof ribosome）、氧載體活性（Oxygen carrier activity）及氧結(jié)合功能（Oxygen binding）等GO功能條目;在細(xì)胞組分類(lèi)別上，主要注釋到核糖體亞基（Ribosomalsubunit）、血紅蛋白復(fù)合物（Hemoglobin complex）、核糖體（Ribosome）等 GO功能條目;在生物學(xué)過(guò)程類(lèi)別上，注釋到與氧氣運(yùn)輸（Oxygen transport）、氣體運(yùn)輸（Gas transport）、過(guò)氧化氫分解過(guò)程（Hydrogenperoxide cotabolic process）等GO功能條目。KEGG信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)，20個(gè)DEGs只富集到1條信號(hào)通路核糖體通路（Ribosome pathway）。

2.2.2去批次效應(yīng)后的 DEGs分析

由于已完成降維聚類(lèi)和細(xì)胞類(lèi)型注釋?zhuān)虼艘酝N細(xì)胞的不同樣本進(jìn)行DEGs篩選及 GO功能注釋分析和KEGG信號(hào)通路富集分析。選擇黑色素細(xì)胞和虹彩細(xì)胞 為重點(diǎn)研究對(duì)象，結(jié)果顯示：在黑色素細(xì)胞中存在 8個(gè)DEGs，其中4個(gè)DEGs呈上調(diào)表達(dá)、4個(gè)DEGs呈 下調(diào)表達(dá)；GO功能注釋分析發(fā)現(xiàn)主要注釋到熱應(yīng) 答、細(xì)胞質(zhì)、未折疊蛋白結(jié)合、生長(zhǎng)因子活性、金屬 離子結(jié)合等功能條目。在虹彩細(xì)胞中鑒定出25個(gè) DEGs，其中19個(gè)DEGs呈上調(diào)表達(dá)、6個(gè)DEGs呈下調(diào)表達(dá)；GO功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，在生物學(xué)過(guò)程類(lèi)別 上主要涉及細(xì)胞生物學(xué)、應(yīng)激響應(yīng)、蛋白質(zhì)折疊和調(diào) 控等GO功能條目，在細(xì)胞組分類(lèi)別上主要涉及細(xì) 胞的基本功能和結(jié)構(gòu)；KEGG信號(hào)通路富集分析發(fā) 現(xiàn)主要富集于凋亡、沙門(mén)氏菌感染和MAPK信號(hào)通 路等，涉及細(xì)胞生存、應(yīng)激響應(yīng)及信號(hào)傳導(dǎo)等功能。

3討論

3.1細(xì)胞類(lèi)型鑒定及圖譜構(gòu)建

本研究共捕獲細(xì)胞數(shù)17035個(gè)，降維聚類(lèi)后得 到18個(gè)細(xì)胞簇；經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型鑒定，18個(gè)細(xì)胞簇被注 釋為13種細(xì)胞類(lèi)型及其亞型。其中，某些細(xì)胞亞群鑒定有一定難度，如C7、C8、C9、C12和C14等。krt8基因是上皮細(xì)胞的標(biāo)記基因（Orkin and Zon，2008），但在C7和C9中的表達(dá)量均遠(yuǎn)高于其他細(xì)胞簇，因此將C7和C9均鑒定為上皮細(xì)胞。此外，C9中還存 在1個(gè)高表達(dá)基因ttc36，是顱神經(jīng)脊細(xì)胞的標(biāo)記基因（Lukowicz-Bedford et al.，2022），且只在C9中 表達(dá)，但該細(xì)胞類(lèi)型只出現(xiàn)在胚胎階段。collala基 因常用于表征成纖維細(xì)胞（Metikala et al.，2021），除了在C8中高表達(dá)外，在C7和C12中也有表達(dá)C8中 還有1個(gè)高表達(dá)基因icn2，是上皮細(xì)胞的標(biāo)記基因 （Orkin and Zon，2008），而C12中的高表達(dá)基因都是表征成纖維細(xì)胞的潛在標(biāo)記基因。C14也是如此， 其高表達(dá)基因中既有表皮細(xì)胞的標(biāo)記基因，又有表 征巨噬細(xì)胞的標(biāo)記基因。因此，綜合評(píng)估可將C7注釋為上皮細(xì)胞，C8注釋為成纖維上皮細(xì)胞，C9注釋為類(lèi)上皮細(xì)胞，C12注釋為成纖維化細(xì)胞，C14注釋 為表皮類(lèi)巨噬細(xì)胞。

本研究構(gòu)建的盤(pán)麗魚(yú)皮膚組織單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖 譜基本涵蓋了魚(yú)類(lèi)皮膚組織中的大部分細(xì)胞類(lèi)型， 為了提高細(xì)胞類(lèi)型注釋的準(zhǔn)確性，針對(duì)每個(gè)細(xì)胞簇 的識(shí)別與鑒定盡量不局限于個(gè)別的標(biāo)記基因。與此 同時(shí)，發(fā)現(xiàn)在已確定細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞中還存在很多 特異性高表達(dá)的基因，可能是這類(lèi)型細(xì)胞的潛在標(biāo) 記基因。表1展示了本研究用于鑒定細(xì)胞類(lèi)型的標(biāo) 記基因及挖掘出的潛在標(biāo)記基因。

3.2天子藍(lán)盤(pán)麗魚(yú)皮膚組織DEGs鑒定

天子藍(lán)盤(pán)麗魚(yú)品系因其色澤及純藍(lán)程度而取名 天子藍(lán)。經(jīng)過(guò)多代近親交配與繁殖，選育出的天子藍(lán)品系基因穩(wěn)定且能遺傳。這種基因突變可能發(fā)生 在與色素合成相關(guān)的基因上，使得魚(yú)體表面鱗片和 表皮層的虹彩細(xì)胞及相關(guān)色素共同作用，而促使魚(yú)體呈現(xiàn)出嬌艷的藍(lán)彩。本研究選用的對(duì)照為阿蓮卡 盤(pán)麗魚(yú)，是一種未經(jīng)改良的野生型古老品系，其體色 主要呈紅棕色，條紋少，主要散布在頭頸部及魚(yú)鰭上（Farias et al.，2003）。通過(guò)對(duì)2個(gè)樣本的Pseudo-bulk處理，在上調(diào)的DEGs中發(fā)現(xiàn)TSPAN3A基因，其編碼1個(gè)四跨膜蛋白，參與離子交換、色團(tuán)相互作用和色素模式，具有細(xì)胞結(jié)合分子的功能（Djurdjevic et al.，2019）。已有研究表明，同家族的TSPAN3C基因在黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞中均高表達(dá)，但TSPAN3A基因只呈弱表達(dá)（Inoue et al.，2014）。另一上調(diào)基因PTGES被發(fā)現(xiàn)在黑色素細(xì)胞中呈低水平表達(dá)（Inoueet al.，2014），下調(diào)基因中JUNBB、FOSAB、ATF3同為AP-1家族成員，與黑色素的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)（Sitaram et al.，2012;Campagne et al.，2018）。TSPAN3A基因在天子藍(lán)盤(pán)麗魚(yú)品系中高表達(dá)，表明其體內(nèi)的黑色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞較少。此外，黑色素細(xì)胞及黑色素合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)基因也呈下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，皮膚組織中黃色素細(xì)胞或胞內(nèi)色素團(tuán)的缺乏、黑色素細(xì)胞和黑色素含量較少，是藍(lán)色體色形成的重要原因之一（Bagnara et al.，2007）。在阿蓮卡盤(pán)麗魚(yú)品系中，AP-1家族基因表達(dá)水平較高，協(xié)助黑色素合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)基因也呈上調(diào)變動(dòng)趨勢(shì)，導(dǎo)致黑色素含量更高，皮膚色素沉著更多。

GO功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，在2個(gè)樣本間篩選獲得的DEGs主要注釋到與氣體傳遞、氧化代謝相關(guān)的GO功能條目上，下調(diào)的DEGs中也包含有血紅蛋白 基因，說(shuō)明人工選育的天子藍(lán)盤(pán)麗魚(yú)品系和野生型 阿蓮卡盤(pán)麗魚(yú)品系在色素合成、氧氣結(jié)合及氧化應(yīng) 激方面存在明顯差異，相關(guān)研究也表明慈鯛魚(yú)類(lèi)皮 膚色素沉積受氧化應(yīng)激的影響（Cahn et al.，2015）。 聚焦于同種細(xì)胞不同樣本間的差異分析，能揭示細(xì) 胞間的異質(zhì)性。黑色素細(xì)胞的DEGs主要富集于熱 應(yīng)答、細(xì)胞質(zhì)、未折疊蛋白結(jié)合、生長(zhǎng)因子活性、金屬 離子結(jié)合反應(yīng)等信號(hào)通路，其中熱應(yīng)答過(guò)程可能會(huì) 影響皮膚體色（Costin and Hearing，2007）。下調(diào)的DEGs中的PTN基因會(huì)抑制酪氨酸酶和MITF蛋 白表達(dá)，減少黑色素細(xì)胞中黑色素的生成（Choi et al.，2015）。富集在金屬離子結(jié)合反應(yīng)通路上的DEGs有DNAJA、CRIP1及MB等基因，金屬離子可 能通過(guò)調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)酶活性，而影響黑 色素的合成與沉積（Borovansky，1994）。

在虹彩細(xì)胞中存在25個(gè)DEGs，其中19個(gè)DEGs呈上調(diào)表達(dá)、6個(gè)DEGs呈下調(diào)表達(dá)。KEGG信號(hào)通 路富集分析發(fā)現(xiàn)主要富集于細(xì)胞凋亡、沙門(mén)氏菌感 染和MAPK信號(hào)通路等，涉及細(xì)胞生存、應(yīng)激響應(yīng)及信號(hào)傳導(dǎo)等功能。其中，MAPK信號(hào)通路是在 動(dòng)物體色形成過(guò)程中起重要作用的通路。有研究表明，MAPK信號(hào)通路可調(diào)控酪氨酸酶活性，是參與黑色素形成和沉著的主要途徑之一（Well- brock and Arozarena，2015;許藝蘭等，2023）。富集于 MAPK信號(hào)通路的DEGs分別是JUNK、GADD45GA、HSP70L和FOSAB基因，其中，GADD45GA和 FOSAB基因在其他有關(guān)黑色素的研究中也被差異 富集（Lumaquin-Yin et al.，2023），JUN和FOSAB基 因也是AP-1家族基因成員，參與黑色素細(xì)胞轉(zhuǎn)化和致癌的相關(guān)過(guò)程，還能間接下調(diào)MITF基因表達(dá)，是調(diào)控黑色素合成的關(guān)鍵基因之一（Maurus et al.，2017）。HSP7OL基因已被證明能抑制MITF基因表達(dá)，最終降低酪氨酸酶活性及抑制黑色素生成（Kim et al.，2021）?？梢?jiàn)，黑色素合成不活躍可能會(huì)導(dǎo)致 天子藍(lán)盤(pán)麗魚(yú)的體色較阿蓮卡盤(pán)麗魚(yú)更加鮮艷和絢 麗。該結(jié)論為后續(xù)研究盤(pán)麗魚(yú)色素細(xì)胞發(fā)育及體色 形成機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為非模式水產(chǎn)魚(yú)類(lèi)的單細(xì) 胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序提供了參考借鑒。

4結(jié)論

TSPAN3A、 PTGES、 ATF3、JUNK、 GADD45GA、 HSP7OL、FOSAB等基因在調(diào)節(jié)天子藍(lán)盤(pán)麗魚(yú)皮膚體 色、色素合成與沉著等方面發(fā)揮重要作用，而黑色素 合成不活躍可能是導(dǎo)致天子藍(lán)盤(pán)麗魚(yú)體色較阿蓮卡 盤(pán)麗魚(yú)更加鮮艷和絢麗的主要原因之一。

參考文獻(xiàn)（References）：

陳信忠，袁芳，許奕宸，郭書(shū)林，龔艷清，楊俊萍.2016.七彩神仙魚(yú)和神仙魚(yú)的DNA條形碼研究[J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，26（6）：1-6. [Chen X Z，Yuan F，Xu Y C，Guo S L， Gong Y Q， Yang J P. 2016. Study on the DNA barcode of the discuses and angelfish[J]. Journal of Inspection and Quarantine，26（6）：1-6.]

程云生，侯冠軍，楊坤，陳靜，高雷，何吉祥.2015.人工雌核發(fā) 育紅草金魚(yú)體色的定向發(fā)育研究[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，46（3）：518-522. [Cheng Y S，Hou G J，Yang K，Chen J，Gao L， He J X. 2015. Directional development of artificial gynogenetic red goldfish body color[J]. Journal of Southern Agriculture， 46 （3） ： 518-522.] doi： 10.3969/j： issn.2095-1191.2015.3.518.

馮彩，胡菊，李俊茹，劉廣勤，關(guān)銘軒，何一晴，王良炎.2020.

不同體色草金魚(yú)（Carassius auratus）鱗片色素細(xì)胞的觀 察[J].河南水產(chǎn)，（2）：19-21.[Feng C，Hu J，LiJR，Liu G Q，Guan M X， He Y Q， Wang L Y. 2020. Observation on scale chromatophore of Carassius auratus [J]. Henan Fi- sheries，（2）：19-21.]

黃璞，賈銘宇，劉濤，于洪賢.2011.蝦青素對(duì)七彩神仙魚(yú)生長(zhǎng) 和形體的影響[J].吉林農(nóng)業(yè)，（3）：93-94.[Huang P，Jia M Y， Liu T， Yu H X. 2011. Effects of astaxanthin on

growth and morphology of Symphysodon haraldi [J]. Jilin Agriculture， （3）：93-94.]

吉鈺，陳再忠，溫彬，高建忠.2023.野生型和人工選育全藍(lán)型 七彩神仙魚(yú)群體的遺傳多樣性分析[J/OL].廣東農(nóng)業(yè)

科學(xué).https：//link.cnki.net/urlid/44.1267.S.20231027.0953.

004. [Ji Y， Chen Z Z， Wen B， Gao J Z. 2023. Genetic diversity analysis of wild and artificially bred blue populations in discus fish [J/OL]. Guangdong Agricultural Sciences.

https：//link.cnki.net/urlid/44.1267.S.20231027.0953.004.]

李中軍，溫彬，馬騰飛，劉鑫，高建忠，陳再忠.2022.藍(lán)色七彩 神仙魚(yú)虹彩細(xì)胞呈色相關(guān)基因的發(fā)掘[J/OL].水產(chǎn)學(xué)報(bào).https：//kns.cnki.net/kcms/detail//31.1283.S.20221214.

0951.001.html. [Li Z J， Wen B， Ma T F， Liu X， Gao J Z， Chen Z Z. 2022. Exploration of candidate genes related to iridophore presenting blue skin in discus fish （Symphysodon haraldi） [J/OL]. Journal of Fisheries of China. https：//kns.

cnki.net/kcms/detail//31.1283.S.20221214.0951.001.html.]doi： 10.11964/jfc.20220113265.

劉曉東，陳再忠.2008.七彩神仙魚(yú)皮膚色素細(xì)胞觀察及類(lèi)胡 蘿卜素組分分析[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)，17（3）：339-343.

[Liu X D， Chen Z Z. 2008. Study on the chromatophores and the carotenoid components in the skin of discus fish （Symphysodon spp.） [J]. Journal of Shanghai Ocean University，17（3）：339-343.]

劉怡南，溫彬，陳再忠.2020.七彩神仙魚(yú)腦組織轉(zhuǎn)錄組 mRNAs差異表達(dá)分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，51（11）：2827-

2835. [Liu Y N， Wen B， Chen Z Z. 2020. Differential expression analysis of mRNAs based on brain transcriptome in the discus fish （Symphysodon haraldi） [J]. Journal of Southern Agriculture，51（11）：2827-2835.] doi： 10.3969/

j.issn.2095-1191.2020.11.027.

田浚杉，唐雨馨，王晨旭，王德壽.2024.硬骨魚(yú)類(lèi)虹彩細(xì)胞的 研究進(jìn)展[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，48（1）：1-16.[TianJS，Tang Y X， Wang C X， Wang D S. 2024. Research advances of iri- dophores in Teleosts [J]. Journal of Fisheries of China， 48

（1）：1-16.] doi：10.11964/jfc.20230213903.

王磊，陳再忠，冷向軍，高建忠，劉穎，劉漢鵬，宋雪露.2016.

飼料中添加雨生紅球藻對(duì)七彩神仙魚(yú)生長(zhǎng)、體色及抗氧 化力的影響[J].淡水漁業(yè)，46（6）：92-97.[WangL，Chen Z Z， Leng X J， Gao J Z， Liu Y， Liu H P， Song X L. 2016. Effect of Haematococcus pluvialis on growth， body color and antioxidation capacity of discus fish Symphysodon haraldi[J]. Freshwater Fisheries， 46 （6） ： 92-97.] doi： 10.3969/j.issn.1000-6907.2016.06.016.

韋玲靜，呂業(yè)堅(jiān)，鄒輝，文衍紅，甘寶江，張桂姣，張盛，嚴(yán)雪 瑜，葉香塵.2020.金邊鯉皮膚黑色素合成及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基 因表達(dá)分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，51（2）：453-460.[WeiL J，Lü Y J，Zou H，Wen Y H，Gan B J，Zhang G J，Zhang S， Yan X Y， Ye X C. 2020. Skin melanin synthesis of Jinbian carp and expression analysis of transport related genes[J].

Journal of Southern Agriculture， 51 （2） ： 453-460.] doi： 10.3969/j.issn.2095-1191.2020.02.027.

許藝蘭，文露婷，黃姻，陳忠，覃俊奇，潘賢輝，周康奇，林勇，鄧潛，武霞，杜雪松.2023.全州禾花鯉皮膚轉(zhuǎn)錄組特征 分析[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，52（6）：150-159.[Xu Y L，Wen L T，Huang Y，Chen Z， Qin J Q，Pan X H，Zhou K Q， Lin Y， Deng Q， Wu X， Du X S. 2023. Transcriptome characte- ristics analysis of skin of Cyprinus carpio var. Quanzhou- nensis[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences， 52（6）：

150-159.] doi：10.15933/j.cnki.1004-3268.2023.06.016.

周康奇，潘賢輝，牟春艷，鄭曙明.2020.血鸚鵡魚(yú)鱗片及色素 細(xì)胞的顯微和超微結(jié)構(gòu)研究[J].淡水漁業(yè)，50（5）：47-54. [Zhou K Q， Pan X H， Mou C Y， Zheng S M. 2020. Study on the microstructure and ultrastructure of Cichlasoma synspilum？×C. citrinellum? scales and pigment cells [J]. Freshwater Fisheries， 50 （5） ： 47-54.] doi： 10.3969/j.issn.1000-6907.2020.05.007.

Bagnara J T， Fernandez P J， Fujii R. 2007. On the blue coloration of vertebrates[J]. Pigment Cell Research，20（1）：14-26. doi： 10.1111/j.1600-0749.2006.00360.x.

Borovansky J. 1994. Zinc in pigmented cells and structures， interactions and possible roles [J]. Sbornik Lekarsky， 95（4）：309-320.

Cahn M D， Brown A C， Clotfelter E D. 2015. Guanine-based structural coloration as an indicator of oxidative stress in a cichlid fish [J]. Journal of Experimental Zoology. Part A： Ecological Genetics and Physiology， 323 （6） ： 359-367.doi： 10.1002/jez.1926.

Campagne C， Ripoll L， Gilles-Marsens F， Raposo G， Delevoye

C. 2018. AP-1/KIF13A blocking peptides impair melanosome maturation and melanin synthesis [J]. International Journal of Molecular Sciences， 19 （2） ： 568. doi： 10.3390/ijms19020568.

Chaffin M， Papangeli I， Simonson B， Akkad A D， Hill M C， Arduini A， Fleming S J， Melanson M， Hayat S， KostAlimova M， Atwa O， Ye J C， Bedi Jr K C， Nahrendorf M， Kaushik V K，Stegmann C M，Margulies K B，Tucker N R， Ellinor P T. 2022. Single-nucleus profiling of human dilated and hypertrophic cardiomyopathy [J] Nature， 608

（7921）：174-180. doi：10.1038/s41586-022-04817-8.

Choi W J， Kim M，Park J Y，Park T J，Kang H Y. 2015. Pleiotrophin inhibits melanogenesis via Erk1/2-MITF signaling in normal human melanocytes[J]. Pigment Cell amp; Melanoma Research，28（1）：51-60. doi： 10.1111/pcmr.12309.

Costin G E， Hearing V J. 2007. Human skin pigmentation： Melanocytes modulate skin color in response to stress[J].

The FASEB Journal， 21 （4） ： 976-994. doi ： 10.1096/fj.066649rev.

Djurdjevic I， Furmanek T， Miyazawa S，Bajec S S. 2019. Comparative transcriptome analysis of trout skin pigment cells [J]. BMC Genomics， 20： 359. doi： 10.1186/s12864-019-5714-1.

Dobin A， Davis C A， Schlesinger F， Drenkow J， Zaleski C， Jha S， Batut P， Chaisson M， Gingeras T R. 2013. STAR： Ultrafast universal RNA-Seq aligner[J]. Bioinformatics， 29（1）： 15-21. doi：10.1093/bioinformatics/bts635.

Fadeev A， Krauss J， Singh A P， Nusslein-Volhard C. 2016. Zebrafish leucocyte tyrosine kinase controls iridophore establishment， proliferation and survival [J]. Pigment Cell amp; Melanoma Research，29（3）：284-296. doi： 10.1111/pcmr.

12454. Farias I P， Hrbek T， Brinkmann H， Sampaio I， Meyer A. 2003. Characterization and isolation of DNA microsatellite primers for Arapaima gigas， an economically important but severely over-exploited fish species of the Amazon basin [J]. Molecular Ecology Notes，3（1）：128-130. doi：10.1046/j.1471-8286.2003.00375.x.

Guo C，Duan Y，Ye W D，Zhang W T，Cheng Y Y，Shi M J，Xia

X Q. 2023. FishGET： A fish gene expression and transcriptome database with improved accuracy and visualization [J]. iScience， 26（4）： 106539. doi： 10.1016/j.isci.2023.106

539. Inoue S， Kondo S， Parichy D M， Watanabe M. 2014. Tetraspanin 3c requirement for pigment cell interactions and boundary formation in zebrafish adult pigment stripes[J].

Pigment Cell amp; Melanoma Research，27（2） ：190-200. doi： 10.1111/pcmr.12192.

Kim H M，Oh S，Choi C H，Yang J Y，Kim S，Kang D，Son K H， Byun K. 2021. Attenuation effect of radiofrequency irradiation on UV-B-induced skin pigmentation by decreasing melanin synthesis and through upregulation of heat shock protein 70[J]. Molecules， 26（24） ： 7648. doi： 10.3390/molecules26247648.

Lukowicz-Bedford R M， Farnsworth D R， Miller A C. 2022. Connexinplexity： The spatial and temporal expression of connexin genes during vertebrate organogenesis [J]. Genes | Genomes| Genetics， 12（5）：jkac062. doi： 10.1093/g3jour-

nal/jkac062.

Lumaquin-Yin D， Montal E， Johns E， Baggiolini A， Huang T H， Ma Y， LaPlante C， Suresh S， Studer L， White R M. 2023. Lipid droplets are a metabolic vulnerability in melanoma [J]. Nature Communications， 14 （1） ： 3192. doi： 10.

1038/s41467-023-38831-9.

Maurus K， Hufnagel A， Geiger F， Graf S， Berking C， Heinemann A， Paschen A， Kneitz S， Stigloher C， Geissinger E， Otto C， Bosserhoff A， Schartl M， Meierjohann S. 2017. The AP-1 transcription factor FOSL1 causes melanocyte reprogramming and transformation[J]. Oncogene，36：5110-5121. doi：10.1038/onc.2017.135.

Metikala S， Chetty S C，Sumanas S. 2021. Single-cell transcriptome analysis of the zebrafish embryonic trunk[J]. PLoS One， 16（7）：e0254024. doi： 10.1371/journal.pone.0254024.

Ng T T， Lau C C， Tan M P， Wong L L，Sung Y Y， Muhammad T S T， de Peer Y V， Sui L Y，Danish-Daniel M. 2023. Cutaneous transcriptomic profiling and candidate pigment genes in the wild discus （Symphysodon spp.） [J]. New Zealand Journal of Zoology，50（4） ：478-496. doi： 10.1080/03

014223.2023.2180763.

Orkin S H， Zon L I. 2008. Hematopoiesis： An evolving paradigm for stem cell biology[J]. Cell， 132（4）：631-644. doi： 10.1016/j.cell.2008.01.025.

Patterson L B， Parichy D M. 2019. Zebrafish pigment pattern

formation： Insights into the development and evolution of adult form[J]. Annual Review of Genetics， 53： 505-530.

doi： 10.1146/annurev-genet-112618-043741.

Sitaram A，Dennis M K， Chaudhuri R， de Jesus-Rojas W， Tenza D，Setty S R G，Wood C S，Sviderskaya E V，Bennett D C， Raposo G， Bonifacino J S， Marks M S. 2012. Differential recognition of a dileucine-based sorting signal by AP-1 and AP-3 reveals a requirement for both BLOC-1 and AP-3 in delivery of OCA2 to melanosomes[J]. Molecular Biology of the Cell， 23 （16）： 3178-3192. doi： 10.1091/mbc.E11-06-0509.

Song X L， Wang L， Li X Q， Chen Z Z， Liang G Y， Leng X J.

2017. Dietary astaxanthin improved the body pigmentation and antioxidant function， but not the growth of discus fish （Symphysodon spp.） [J]. Aquaculture Research， 48 （4） ：

1359-1367. doi： 10.1111/are.13200.

Wang L K，F(xiàn)eng Z X，Wang X，Wang X W，Zhang X G. 2010. DEGseq： An R package for identifying differentially expressed genes from RNA-Seq data [J]. Bioinformatics， 26（1）： 136-138. doi： 10.1093/bioinformatics/btp612.

Wellbrock C， Arozarena I. 2015. Microphthalmia-associated transcription factor in melanoma development and MAPkinase pathway targeted therapy[J]. Pigment Cell amp; Melanoma Research，28（4）：390-406. doi： 10.1111/pcmr.12370.

Yang B T，Wen B，Ji Y， Wang Q，Zhang H R，Zhang Y，Gao J Z， Chen Z Z. 2021. Comparative metabolomics analysis of pigmentary and structural coloration in discus fish （Symphysodon haraldi）[J]. Journal of Proteomics，233：104085.

doi：10.1016/j.jprot.2020.104085.

（責(zé)任編輯

蘭宗寶）