關(guān)鍵詞： ε-聚賴氨酸；殼聚糖；聚乙烯醇；抗菌活性；水凝膠

中圖分類號： R318.08 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

致病性細(xì)菌感染導(dǎo)致的傷口并發(fā)癥已成為全球傷口管理的重大挑戰(zhàn)之一[1]。紗布、棉墊等傳統(tǒng)敷料價格親民且原材料易得，但是滲透性差，屏障作用不足，易與皮膚黏連，增加感染風(fēng)險[2]，當(dāng)前研究探索了多種新型傷口敷料，如水凝膠、納米纖維膜、納米顆粒等。特別是具有抗菌功能的水凝膠作為新型抗菌材料，能夠延長抗菌效果，解決現(xiàn)有的耐藥性、毒性等問題，同時具備抗炎、促細(xì)胞生長等功能[3]，因而備受關(guān)注。Cai 等[4]開發(fā)了一種可注射真皮細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠敷料，并通過載入萬古霉素增強(qiáng)了水凝膠的抗菌活性。Cheng等[5]將HHC-36 抗菌肽和氧化鈰納米顆粒結(jié)合到兒茶酚功能化的甲基丙烯酸化水凝膠（GelMA）中，設(shè)計(jì)了一種快速抗菌水凝膠傷口敷料。然而，這些研究多集中于添加生物活性物質(zhì)[6， 7]，存在價格昂貴、制備復(fù)雜、不良反應(yīng)大等弊端。因此，開發(fā)制備簡便、環(huán)保、無污染，同時兼具優(yōu)良溶脹性、抗菌性、生物相容性的新型水凝膠傷口敷料至關(guān)重要。

聚乙烯醇（PVA） 是一種水溶性聚合物，因其具有良好的力學(xué)性能、無毒性和生物相容性等優(yōu)勢[8]，已成為制造各種功能性水凝膠基底的首選材料，并被廣泛應(yīng)用于傷口敷料和軟骨修復(fù)等領(lǐng)域[9-10]。通常采用化學(xué)方法，即通過在PVA 中加入交聯(lián)劑（如戊二醛、乙二醛等）[11] 形成穩(wěn)定的化學(xué)鍵，從而形成PVA 水凝膠。然而，常見的化學(xué)交聯(lián)劑存在一定的細(xì)胞毒性[12]。因此，不添加毒性交聯(lián)劑的物理交聯(lián)法成為了更安全可靠的制備方法[13]。殼聚糖（CS）是一種由幾丁質(zhì)去乙?；@得的天然陽離子多糖[14]，來源廣泛且成本低廉[15]，不僅可被人體酶生物降解，而且還具有良好的黏附性、止血能力和抗菌性能[16， 17]。然而，不足的力學(xué)性能限制了CS的應(yīng)用[18]。因此，通過將CS 與PVA 結(jié)合可協(xié)同兩者的優(yōu)勢，以制備理化性能更為出色的水凝膠材料[19]。

盡管CS 已表現(xiàn)出一定的抗菌活性，但其抗菌效果仍有限。ε-聚賴氨酸（ε-PL） 是一種由25～30 個賴氨酸殘基組成的天然陽離子多肽[20]，其對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌以及霉菌具有廣譜抗菌活性。目前，已有研究將ε-PL 應(yīng)用于傷口敷料，以提高材料的抗菌性能[21]。但遺憾的是，以往的研究大多集中在通過接枝共聚的方法將ε-PL 與材料結(jié)合[22， 23]，這些傳統(tǒng)的化學(xué)功能化方法同樣需要引入其他化學(xué)試劑，導(dǎo)致生物材料的生物相容性受影響。因此，探索一種更加安全有效的結(jié)合方式是非常有必要的。

本研究采用簡便、環(huán)保的凍融技術(shù)成功制備了負(fù)載ε-PL 的PVA/CS復(fù)合水凝膠（PCE），并探究了ε-PL的含量對復(fù)合水凝膠相關(guān)性能的影響：首先，探討了PCE 水凝膠的理化性質(zhì)表征，包括形貌、溶脹性能以及熱力學(xué)性能；然后，檢測了不同ε-PL 含量的PCE 水凝膠對大腸桿菌（Escherichia coli， E. coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， S. aureus） 的抗菌能力；最后，檢測了PCE 水凝膠對小鼠成纖維細(xì)胞（L929）的細(xì)胞毒性。研究結(jié)果表明，通過加入適量的ε-PL，PVA/CS 水凝膠的抗菌性能得到了顯著提升，同時又保持了良好的細(xì)胞相容性。這種簡便且高效的制備方法有望為開發(fā)具有優(yōu)良抗菌性能的傷口敷料提供新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

PVA：1799型，醇解度98%～99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；CS：脫乙酰度≥95%，黏度100～200 mPa·s，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；ε-PL：生物試劑級（BR），上海源葉生物科技有限公司；乙酸（HAC），分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；小鼠成纖維細(xì)胞（L929）：中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；青霉素鏈霉素溶液、磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer solution，PBS）、DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶：美國 Hyclone 公司；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）：美國BI 公司；CCK-8 試劑盒：美國 Invitrogen 公司；Luria-Bertani（LB）肉湯、LB 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司；E.coi 和S. aureus 均購自北京保藏生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

SS-550 型掃描電子顯微鏡（SEM）：日本島津公司；FTIR-650S 型傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）儀：天津港東科技發(fā)展有限公司，波長范圍為4 000～400 cm^?1；HCT-3型差熱熱重聯(lián)用儀：北京恒久實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，在空氣氛圍下，升溫速率為10 ℃/min，升溫區(qū)間為25～650 ℃；Varioskan Flash 型多功能酶標(biāo)儀和離心機(jī)：美國 ThermoFisher公司。

1.3 PVA/CS/ε-PL復(fù)合水凝膠的制備

稱取0.02g的CS 加入1 mL乙酸（0.01 g/mL）溶液中，在室溫下攪拌24 h 后制得溶液A；稱取1 g 的PVA加入1 mL 去離子水中，在95 ℃ 下攪拌6 h 后制得溶液B。將溶液A 與溶液B 以體積比1∶2 混合，在40 ℃ 下攪拌1 h，得到PVA/CS 混合溶液。然后，將ε-PL 按照0、0.004、0.006、0.008 g/mL 的比例加入到PVA/CS 混合溶液中，攪拌6 h 后靜置脫泡，制得PVA/CS/ε-PL 溶液。最后，將PVA/CS/ε-PL 溶液倒入模具中，于?20 ℃ 下冷凍24 h 后取出，在室溫下放置2 h 使其解凍，重復(fù)此凍融過程3 次，得到PVA/CS/ε-PL 復(fù)合水凝膠。根據(jù)ε-PL 的添加比例分別命名為PCE-0、PCE-4、PCE-6、PCE-8。

1.4 復(fù)合水凝膠的表征檢測

將制得的復(fù)合水凝膠在?80 ℃ 中冷凍后，置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干2 d，再置于液氮中淬斷。將復(fù)合水凝膠樣品用導(dǎo)電膠固定到金屬臺上，噴金，使用SEM 觀察復(fù)合水凝膠的形貌。取適量復(fù)合水凝膠樣品、PVA、CS、ε-PL 分別與溴化鉀充分研磨并壓制成薄片，使用FT-IR 儀測試官能團(tuán)。通過差熱熱重聯(lián)用儀對凍干的復(fù)合水凝膠樣品進(jìn)行熱穩(wěn)定性分析。

1.5 復(fù)合水凝膠的溶脹率測試

將冷凍干燥后的復(fù)合水凝膠樣品切成大小、質(zhì)量相近的圓柱狀，稱重為m0，將樣品浸泡在37 ℃ 的PBS溶液中，每間隔一定時間取出，擦干樣品表面水分后稱重為mt。復(fù)合水凝膠的溶脹率（SR）計(jì)算公式如下：

SR = （m_t－m₀）=m₀×100%

1.6 復(fù)合水凝膠抗菌性能測試

平板抑菌實(shí)驗(yàn)：將復(fù)合水凝膠樣品滅菌后，每組取500 μL 水凝膠樣品，分別加入到5 mL 的兩種不同菌液中，將各組水凝膠樣品與兩種菌液進(jìn)行分組共培養(yǎng)，其中對照組為不添加水凝膠樣品的菌液組。實(shí)驗(yàn)組與對照組均置于37 ℃ 細(xì)菌搖床中培養(yǎng)12 h，然后梯度稀釋106 倍，接著每組取100 μL 稀釋后的細(xì)菌懸液分別涂布在瓊脂平板上，將各組瓊脂平板倒置放在37 ℃ 細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，拍照記錄各組菌落生長狀況。

細(xì)菌生長動力學(xué)：將復(fù)合水凝膠樣品滅菌后，每組取500 μL 水凝膠樣品，分別加入到5 mL 的兩種不同菌液中，將各組水凝膠樣品與兩種菌液進(jìn)行分組共培養(yǎng)，其中對照組為不添加水凝膠樣品的菌液組。實(shí)驗(yàn)組與對照組均置于37 ℃ 細(xì)菌搖床中培養(yǎng)。分別在0、6、12 h 和24 h 使用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)菌在波長600 nm 處的吸光度（OD）值，并繪制細(xì)菌生長曲線。

細(xì)菌活/死染色：將復(fù)合水凝膠樣品滅菌后，每組取500 μL 水凝膠樣品，分別加入到5 mL 的兩種不同菌液中，將各組水凝膠樣品與兩種菌液進(jìn)行分組共培養(yǎng)，其中對照組為不添加水凝膠樣品的菌液組。實(shí)驗(yàn)組與對照組均置于37 ℃ 細(xì)菌搖床中培養(yǎng)12 h，然后離心（10⁴ r/min，10 min）收集各組細(xì)菌。將各組離心后的細(xì)菌用0.85%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）的NaCl 溶液洗滌3 次后，采用適量的活/死細(xì)菌染色液重懸細(xì)菌，置于室溫避光孵育15 min。最后，使用適量的0.85% 的NaCl 溶液沖洗并重懸細(xì)菌。使用熒光顯微鏡觀察細(xì)菌染色圖像，其中活細(xì)菌顯示為綠色熒光，死細(xì)菌顯示為紅色熒光。

1.7 復(fù)合水凝膠的生物相容性

采用CCK-8 法檢測復(fù)合水凝膠對L929 細(xì)胞的細(xì)胞毒性。將滅菌后的各組水凝膠浸泡在37 ℃ 的DMEM 培養(yǎng)基中24 h 制備浸提液。將L929 細(xì)胞以每孔1×10⁴ 個的密度接種到24 孔板中。使用浸提液配置培養(yǎng)基，每2 d 更換培養(yǎng)基。在第1、3 d 和7 d，每孔更換為含有體積分?jǐn)?shù)為10% 的CCK-8 溶液的培養(yǎng)基。在37 ℃ 條件下孵育1.5 h 后，將各組上清液用酶標(biāo)儀檢測450 nm 處的吸光度，并計(jì)算各組細(xì)胞活力。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)進(jìn)行了3次，實(shí)驗(yàn)中獲得的所有數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式，并采用單因素方差分析（ANOVA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，當(dāng)P lt; 0.05 時，認(rèn)為該結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合水凝膠的紅外譜圖

通過FT-IR 圖譜觀察水凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)組成。如圖1 所示， PVA 在3 300～3800 cm^?1 處的寬吸收峰歸因于O-H 基團(tuán)的拉伸振動[24]，在1 419 cm^?1 處的吸收峰歸因于C-H 鍵的彎曲振動[25]。CS 在3200～ 3 500 cm^?1 處強(qiáng)而寬的峰值與N-H 鍵和O-H 鍵的拉伸振動有關(guān)[24]， 在1 668 cm^?1（ 酰胺Ⅰ峰）和1 593 cm^?1（酰胺Ⅱ峰） 處的峰值則分別歸因于C=O 鍵的拉伸振動和N-H 鍵的彎曲振動[26]。ε-PL 在1 560 cm^?1 和1 674 cm^?1 處的吸收峰分別歸因于N-H的彎曲振動和C=O 拉伸振動[27]。相較于不含ε-PL 的PCE-0 水凝膠，其余PCE 水凝膠中觀察到屬于ε-PL 的特征峰，證明成功合成了PCE 水凝膠。同時，隨著ε-PL 的加入，PCE-0 在3 417 cm^?1處的O-H 伸縮峰逐漸向低波數(shù)吸收帶偏移，這可能是由于分子內(nèi)氫鍵的相互作用造成的[28]。

2.2 復(fù)合水凝膠的形貌分析

復(fù)合水凝膠的表面形貌如圖2 所示。由圖可見，所有的水凝膠均呈現(xiàn)出獨(dú)特的相互連接的多孔三維立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)的形成主要?dú)w因于PVA 鏈形成的晶體區(qū)域以及體系內(nèi)羥基間形成的大量氫鍵[7]。在凍融法制備復(fù)合水凝膠的過程中，水在冷凍時形成冰晶，而在冷凍干燥過程中，這些冰晶升華，留下多孔結(jié)構(gòu)。隨著ε-PL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，PCE 復(fù)合水凝膠的孔徑呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢，這可能是由于少量的ε-PL 能夠與PVA 形成氫鍵，增強(qiáng)了水凝膠的交聯(lián)密度，從而減小了孔徑。然而，當(dāng)ε-PL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增加時，水凝膠體系的分子間間距擴(kuò)大，導(dǎo)致交聯(lián)減少，孔徑增大[29]。這種多孔且相互連接的微觀結(jié)構(gòu)不僅能夠促進(jìn)氣體交換，吸收傷口滲出液，還能維持傷口濕潤，從而為傷口愈合創(chuàng)造有利條件[30， 31]。

2.3復(fù)合水凝膠的熱重分析

圖3 所示為復(fù)合水凝膠的熱重分析（TGA）曲線（圖3（a））以及對應(yīng)的微分熱重（DTG）曲線（圖3（b））。如圖3（a）所示，在整個過程中存在3 個失重階段：首先，所有樣品在80 ～ 180 ℃ 時都表現(xiàn)出質(zhì)量損失[32]，主要是由水凝膠中存在的吸附水和結(jié)合水揮發(fā)導(dǎo)致；其次，180 ～ 470 ℃ 為復(fù)合水凝膠的主要熱降解階段，這主要是由于氫鍵及各種官能團(tuán)的斷裂、多糖以及PVA 的分解導(dǎo)致的，其中，在180 ～ 370 ℃，復(fù)合水凝膠出現(xiàn)快速失重，PCE-0、PCE-4、PCE-6、PCE-8 的外推起始溫度依次減小，分別為297.3、239.9、234.6、230.7 ℃，此外，PCE-0 的失重率最大約為50%，PCE-4 的失重率最小約為39%；最后階段發(fā)生在470 ～ 650 ℃，這可能歸因于多烯殘基降解生成碳和碳?xì)浠衔颷33]。由圖3（b）所示，總體上復(fù)合水凝膠的最大熱分解速率溫度隨著ε-PL質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢。同時，熱分解結(jié)束后，PCE-4 的殘?zhí)悸首畲鬄?.3%。上述結(jié)果表明，少量的ε-PL 能夠改善復(fù)合水凝膠的熱穩(wěn)定性，這可能是因?yàn)榧尤肷倭康摩?PL 能夠增強(qiáng)復(fù)合水凝膠的分子間相互作用，使得分子鏈的纏結(jié)更為緊密。

2.4 復(fù)合水凝膠的溶脹率

不同ε-PL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對復(fù)合水凝膠溶脹性能的影響如圖4 所示。所有復(fù)合水凝膠均展現(xiàn)出了優(yōu)異的溶脹性能，其溶脹率均保持在500% 以上。PCE-0的溶脹率為620.4%，隨著ε-PL 的引入， PCE-4 的溶脹率略有下降至551.4%。這可能是由于ε-PL 的加入使得水凝膠內(nèi)部的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)密度增強(qiáng)，進(jìn)而阻礙了水分子的滲透，導(dǎo)致溶脹性能有所減弱[34， 35]。值得注意的是，隨著ε-PL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步增加，復(fù)合水凝膠的溶脹率呈現(xiàn)出遞增趨勢。PCE-6 和PCE-8的溶脹率分別提升至651.7% 和681.1%。這種變化可能歸因于ε-PL 的增加使得分子內(nèi)氫鍵間的距離擴(kuò)大，水凝膠的網(wǎng)絡(luò)孔隙也隨之增大，進(jìn)而有利于水分子的快速滲透與擴(kuò)散[36]，也可能直接源于荷電的賴氨酸殘基導(dǎo)致的滲透壓變化所致。

2.5 復(fù)合水凝膠的抗菌性能評價

圖5 顯示了各組復(fù)合水凝膠對S. aureus 和E. coli 的體外抗菌效果。相較于不含水凝膠的空白對照組，PCE-0 組的菌落數(shù)量有所減少但仍能觀察到大量菌落，當(dāng)加入ε-PL 后，瓊脂板上的菌落數(shù)量顯著減少，PCE-6和PCE-8 組的瓊脂平板上均沒有觀察到菌落生成（圖5（a））。

通過監(jiān)測24 h 的細(xì)菌生長曲線來反映細(xì)菌的繁殖情況（圖5（b））。對照組的兩種細(xì)菌在24 h 內(nèi)呈現(xiàn)出持續(xù)繁殖的趨勢。PCE-0 組的E. coli 生長曲線與對照組相似，然而，PCE-0 組的S. aureus 生長曲線則表現(xiàn)出輕微的抑制趨勢。隨著ε-PL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，兩種細(xì)菌的生長均受到抑制，特別是在PCE-6 和PCE-8 組中，細(xì)菌的生長曲線幾乎平直，表明細(xì)菌數(shù)量無明顯增加。

進(jìn)一步通過活/死細(xì)菌染色驗(yàn)證各組復(fù)合水凝膠的直接殺菌效果（圖5（c））。對照組以活細(xì)菌（綠色熒光）為主，幾乎沒有死細(xì)菌（紅色熒光）。PCE-0 和PCE-4 組中的細(xì)菌同時具有綠色熒光和紅色熒光，且PCE-4 組中的紅色熒光更多，而PCE-6 和PCE-8 組幾乎均為紅色熒光，證明兩種細(xì)菌均被殺滅。

以上結(jié)果表明，PCE-0 水凝膠具有一定的抗菌作用但是抗菌效果不佳[37]，隨著ε-PL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，細(xì)菌的生長受到了明顯的抑制，特別是PCE-6 和PCE-8 組水凝膠，能夠有效殺死S. aureus 和E. coli。其機(jī)制可能是由于ε-PL 作為一種陽離子多肽，當(dāng)它與細(xì)菌的細(xì)胞膜接觸時，能夠增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞質(zhì)的外泄，最終使得細(xì)菌死亡[38]。因此，添加ε-PL 能夠顯著增強(qiáng)水凝膠的抗菌性能。

2.6 復(fù)合水凝膠的細(xì)胞毒性

良好的生物相容性是合格的傷口敷料體內(nèi)應(yīng)用的基礎(chǔ)。細(xì)胞活性是評價材料的生物相容性的重要指標(biāo)之一[39]。通過CCK-8 實(shí)驗(yàn)對各組復(fù)合水凝膠對L929 的細(xì)胞活性進(jìn)行評價。結(jié)果如圖6 所示，培養(yǎng)1、3 d 和7 d 后，L929 的細(xì)胞存活率均在85%以上，符合一級細(xì)胞毒性評級，表明PCE 水凝膠具有良好的生物相容性，能夠作為生物材料應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

3 結(jié)論

（1）采用簡單且環(huán)保的循環(huán)凍融法，成功制備出負(fù)載ε-PL 的PCE 復(fù)合水凝膠。

（2）PCE 水凝膠具有優(yōu)異的溶脹性、熱穩(wěn)定性、細(xì)胞相容性和抗菌性，并且其抗菌性隨著ε-PL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增加，PCE-6 和PCE-8 能夠有效殺滅菌株S. aureus 和 E. coli，該水凝膠有望在傷口修復(fù)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，成為新一代敷料材料。