摘要 傳統(tǒng)高溫大曲是經(jīng)自然發(fā)酵而生產(chǎn)的，存在微生物群落組成復雜、所需的風味組分及含量難以控制等缺點。為了優(yōu)化高溫大曲微生物菌群結(jié)構(gòu)和提高大曲品質(zhì)，以小麥為原料，將高溫大曲中分離篩選的地衣芽孢桿菌BL44、釀酒酵母SCY62、宛氏擬青霉PV3、微小根毛霉RP1 和嗜熱子囊菌TC1 分別制備成固態(tài)菌劑，按不同添加比例構(gòu)建2 種人工合成菌群替代傳統(tǒng)母曲（CK）制作高溫大曲，并進行實驗室釀酒試驗分析。高通量測序結(jié)果表明，3 種大曲的優(yōu)勢真菌屬為Lichtheimia，優(yōu)勢細菌屬為Bacillus。大曲的理化指標測定結(jié)果顯示，接種人工合成菌群的高溫大曲的液化力和糖化力比CK 均有顯著提高。氣相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，接種人工合成菌群替代傳統(tǒng)母曲能顯著提高大曲及酒醅中四甲基吡嗪的含量。人工合成菌群1 和菌群2 接種的大曲中四甲基吡嗪含量分別為31. 90 mg/kg 和56.73 mg/kg，比CK 分別提高了2.80、4.99 倍；高溫堆積發(fā)酵酒醅中人工合成菌群1 和菌群2 的四甲基吡嗪含量分別為0.76 mg/kg 和2.74 mg/kg，比CK 分別提高了4.03 和14.61 倍。以上結(jié)果表明，人工合成菌群在定向調(diào)控大曲酶活性以及白酒中某些特定風味組分及含量等方面具有潛在的應用價值。

關(guān)鍵詞 人工合成菌群； 高溫大曲； 高通量測序； 理化指標； 揮發(fā)性物質(zhì)； 四甲基吡嗪

中圖分類號 TS261.1 文獻標識碼 A 文章編號 1000-2421（2024）04-0239-10

曲為酒之骨，是白酒釀造的糖化發(fā)酵劑和生香劑。酒曲中含有白酒發(fā)酵所需的主要微生物及相應的酶，在發(fā)酵過程中還會產(chǎn)生和積累多種風味物質(zhì)［1-2］。酒曲按照其制作工藝和發(fā)酵溫度可分為高溫大曲、中溫大曲和中低溫大曲。其中，高溫大曲主要用于醬香型白酒的釀造［3-4］。大曲微生物種類繁多、來源廣泛、組成復雜，主要微生物為細菌、酵母菌和霉菌［5］。芽孢桿菌對醬香風味和醬香風味前體物質(zhì)的形成具有關(guān)鍵作用［6-9］。酵母菌主要產(chǎn)生乙醇和其他醇類、醛類等風味物質(zhì)［10-11］。霉菌能產(chǎn)生糖化酶、酯化酶等多種酶類［12］，主要起糖化和酯化等作用［13］。傳統(tǒng)高溫大曲是通過接種上一批次的存留大曲（母曲）經(jīng)自然發(fā)酵而生產(chǎn)的，存在微生物群落組成復雜、菌群穩(wěn)定性不夠、產(chǎn)品所需的關(guān)鍵性風味組分及含量難以控制等缺點［14］。

合成微生物群落是人工將2 種或2 種以上遺傳背景完全解析的微生物通過共同培養(yǎng)而形成的微生物群體，具有復雜度低、可控性強、穩(wěn)定性好等優(yōu)點［15-16］。Wang 等［17］構(gòu)建的清香型白酒人工菌群的發(fā)酵結(jié)果表明，人工核心菌群對合成可重復的風味物質(zhì)是有效的。Tang 等［18］通過高通量測序揭示了發(fā)酵過程中大曲表面和核心微生物群落的結(jié)構(gòu)特征，探究了大曲物種多樣性的原因。韓國強等［19］的研究揭示了復配小曲白酒釀造發(fā)酵過程中微生物群落多樣性及變化規(guī)律，為復配小曲白酒的生產(chǎn)提供理論支持。曲冠頤［20］利用人工構(gòu)建的微生物組替代酒曲進行小曲清香型白酒發(fā)酵后，合成微生物組生產(chǎn)的白酒中15 種風味化合物產(chǎn)量提高，原酒品質(zhì)較酒曲發(fā)酵生產(chǎn)的原酒顯著提升。

本研究將高溫大曲中分離篩選的功能芽孢桿菌、嗜熱真菌和釀酒酵母分別制成單一固態(tài)菌劑，再按一定比例復配成人工合成菌群，用人工合成菌群替代傳統(tǒng)母曲制作高溫大曲并進行實驗室釀酒比較試驗，通過大曲的感官評價、理化指標、揮發(fā)性風味物質(zhì)、微生物群落及實驗室釀酒等進行分析比較，旨在為人工合成菌群在大曲中的應用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種及材料

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）BL44：分離自某高溫大曲，為本研究篩選的1 株產(chǎn)醬香風味突出的功能芽孢桿菌；釀酒酵母（Saccharomyces cerevi?siae）SCY62、嗜熱子囊菌（Thermoascus crustaceus）TC1、微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）RP1 和宛氏擬青霉（Paecilomyces variotii）PV3：為筆者所在實驗室分離和保藏［21］；小麥、高粱、傳統(tǒng)高溫大曲母曲：由湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司提供。

1.2 試劑、儀器與設備

可溶性淀粉、糊精、無水乙醇、氯化鈉、碘、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、醋酸鈉、醋酸、無水葡萄糖：國藥集團有限公司；碘化鉀、硫酸銅、亞鐵氰化鉀、次甲基藍：天津市天力化學試劑有限公司。

MB35 快速水分測定儀：美國Ohaus 公司；ST2100 型pH 計：奧豪斯儀器（常州）有限公司；DVB/CAR/PDMS 三相固相微萃取頭：美國Supelco公司；7890B 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 單一固體菌劑及人工合成群落的制備

菌株BL44 種子液采用LB 培養(yǎng)基，180 r/min，37 ℃培養(yǎng)16 h 備用；菌株SCY62 采用種子液YPD 培養(yǎng)基，180 r/min，28 ℃培養(yǎng)24 h 備用；菌株TC1、RP1及PV3 采用YPD 培養(yǎng)基，180 r/min，37 ℃培養(yǎng)48 h備用。將小麥粉碎并加水混合至含水量29%，分裝于三角瓶中，115 ℃下滅菌30 min。滅菌冷卻后按2.5%（m/m）的接種量將培養(yǎng)好的各種子液分別接入三角瓶中并攪拌均勻，地衣芽孢桿菌、釀酒酵母和3株嗜熱真菌（嗜熱子囊菌、微小根毛霉、宛氏擬青霉）菌劑分別置于37、28 和40 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，期間每隔24 h 搖晃振蕩三角瓶，確保培養(yǎng)基疏松。發(fā)酵完成后，各單一固態(tài)菌劑置45 ℃烘箱烘干至水分12%～15%，經(jīng)粉碎后放置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。將各單一固體菌劑按活菌數(shù)比例混合后，制成人工合成群落。

1.4 嗜熱真菌酶活測定

測定方法參照文獻［22-23］及GB/T 23527.1-2023《酶制劑質(zhì)量要求第1 部分：蛋白酶制劑》。

1.5 高溫大曲的制備

稱取900 g 的小麥，加5% 的沸水，潤糧30 min 后將小麥粉碎（粉碎度在30% 左右），粉碎后添加接種劑（傳統(tǒng)母曲接種45 g，人工合成菌群按照活菌數(shù)1.0×106個/10 g 接種45 g）攪拌均勻，加水繼續(xù)攪拌將水分控制在37% 左右，結(jié)束后放入制曲磨具踩壓均勻，脫模后陰干12 h。之后放入培養(yǎng)箱，通過恒溫培養(yǎng)箱人工調(diào)節(jié)溫度，模擬曲房高溫大曲發(fā)酵過程，共發(fā)酵45 d（30 ℃發(fā)酵1 d、35 ℃發(fā)酵1 d、40 ℃發(fā)酵0.5 d、45 ℃發(fā)酵0.5 d、50 ℃發(fā)酵1 d、55 ℃發(fā)酵2 d、60 ℃發(fā)酵3 d、55 ℃發(fā)酵2 d、50 ℃發(fā)酵3 d、45 ℃發(fā)酵3 d、40 ℃發(fā)酵4 d、35 ℃發(fā)酵7 d、30 ℃發(fā)酵至結(jié)束）。并在第1 周、第2 周進行曲塊翻面，觀察曲塊變化并聞香，結(jié)束后進行相關(guān)后續(xù)試驗。發(fā)酵過程中不添加稻草。根據(jù)先前對傳統(tǒng)高溫大曲中主要功能微生物的種類和數(shù)量的檢測結(jié)果［24］以及對特定微生物的功能研究需要，本研究設計2 種人工合成菌群組合方案（表1）。

1.6 高溫大曲感官評價

大曲感官檢測打分詳情見表2，評分人員由5 名專業(yè)的大曲質(zhì)檢員進行評價，然后去掉一個最高分，去掉一個最低分后計數(shù)平均值，平均值為最后大曲的感官評價得分。

1.7 高溫大曲微生物群落分析及理化指標檢測

使用Illumina 平臺進行宏基因組測序。水分、酸度、液化力、糖化力及發(fā)酵力參照QB/T 4257-2011《釀酒大曲通用分析方法》進行測定。

1.8 高溫大曲實驗室釀酒方法

將新鮮高粱用90 ℃熱水浸泡過夜，蒸煮150 min后，攤涼至30 ℃接種高溫大曲，接種量為高粱干質(zhì)量的14%。用恒溫培養(yǎng)箱模擬高溫堆積發(fā)酵，發(fā)酵溫度第1 天28 ℃、第2 天37 ℃、第3 天42 ℃，堆積發(fā)酵完成后，裝入滅菌的玻璃發(fā)酵瓶中，每組樣品各裝3 瓶，28 ℃恒溫發(fā)酵30 d。

1.9 高溫大曲及酒醅中揮發(fā)性物質(zhì)檢測

樣本預處理參照王雪山［25］方法。揮發(fā)性物質(zhì)使用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測，檢測方法參照文獻［26］進行。

1.10 數(shù)據(jù)處理

使用BLASTP 將非冗余基因集的氨基酸序列與NR 數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得物種在屬分類學水平上的物種注釋信息，使用R 軟件繪制群落組成圖。其他數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均使用SPSS 23.0 軟件進行，并采用單因素方差分析比較均值，Plt;0.05 表示數(shù)據(jù)具有顯著性差異；利用Origin 2019 軟件繪制揮發(fā)性成分聚類熱圖。所有樣品重復測定3 次，結(jié)果用“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜熱子囊菌、宛氏擬青霉及微小根毛霉的酶活性

表3 為嗜熱子囊菌、宛氏擬青霉、微小根毛霉的酶活性測定結(jié)果。由表3 結(jié)果可知，微小根毛霉具有很強的淀粉酶活力，其活力高達1 434.05 U/g。宛氏擬青霉的糖化酶活力最高，為2 856.06 U/g。嗜熱子囊菌中性蛋白酶活力和酸性蛋白酶活力最高，分別為13.96、6.73 U/g。

2.2 固體菌劑揮發(fā)性物質(zhì)測定結(jié)果

采用小麥粉培養(yǎng)的5 種單一固態(tài)菌劑的揮發(fā)性產(chǎn)物的HS-SPME-GC-MS 檢測結(jié)果如表4 所示。共檢出33 種主要揮發(fā)性物質(zhì)，其中酯類化合物5 種、酸類化合物12 種、醇類化合物8 種、醛醛類化合物5種及其他類3 種。揮發(fā)性物質(zhì)中種類及總含量最多的是BL44，其中地衣芽孢桿菌BL44 菌株產(chǎn)四甲基吡嗪能力最強，含量達到109.22 mg/kg，而其他4 株真菌僅產(chǎn)生微量的四甲基吡嗪。

2.3 高溫大曲感官評價結(jié)果

根據(jù)高溫大曲感官檢測標準表，CK 和人工合成菌群2 的表面均光滑，呈小麥色。CK 曲香寡淡且有輕微異味，菌絲生長較差；人工合成菌群2 菌絲生長不明顯但有十分濃厚的復合曲香且無異味。故感官評分在70～90 分，鑒定為高溫中級大曲。人工合成菌群1 的表面較光滑，呈棕黃色，穿衣好，有較濃的曲香且無異味，斷面呈現(xiàn)灰白色且較整齊，菌絲生長較為明顯，泡氣性好。故感官評分在90 分以上，鑒定為高優(yōu)級大曲。具體情況見表5。

2.4 高溫大曲理化指標測定結(jié)果

高溫大曲理化指標測定結(jié)果如表6 所示，從含水量、酸度、液化力、糖化力及發(fā)酵力分析，3 種大曲均具有顯著差異（Plt;0.05）。含水量最高的是接種人工合成菌群1 制作的大曲。酸度最高的是CK。接種人工合成菌群2 的曲塊發(fā)酵力最高，為0.64 U/g，是CK 的1.28 倍。糖化力和液化力均是接種人工合成菌群制作曲塊的高，其中接種人工合成菌群1 的曲塊糖化力及液化力分別是330、1.86 U/g，比CK 分別提高了5.89 和46.5 倍。接種人工合成菌群2 的曲塊糖化力及液化力分別是100、0.2 U/g，比CK 分別提高了1.79 和5.00 倍。

2.5 基于屬水平的微生物群落分析

基于屬水平的微生物群落結(jié)果如圖1 所示。在真菌屬水平上，CK、人工合成菌群1、人工合成菌群2微生物群落數(shù)分別為396、481、220 種，CK 中優(yōu)勢真菌屬為Lichtheimia、Circinella、Syncephalastrum，接種人工合成菌群1 的大曲中優(yōu)勢真菌屬為Lich?theimia、Circinella、Rasamsonia，接種人工合成菌群2的大曲中優(yōu)勢真菌屬為Lichtheimia、Circinella、Syn?cephalastrum。在細菌屬水平上，CK、人工合成菌群1、人工合成菌群2 微生物群落數(shù)分別為315、349、230種，CK 中優(yōu)勢細菌屬為Bacillus、Staphylococcus、Pediococcus，接種人工合成菌群1 的大曲中優(yōu)勢細菌屬為Bacillus、Staphylococcus、Saccharopolyspora，接種人工合成菌群2 的大曲中優(yōu)勢細菌屬為Bacillus、Staphylococcus、Proteu。

2.6 大曲及酒醅揮發(fā)性風味物質(zhì)分析

大曲揮發(fā)性物質(zhì)檢測結(jié)果如圖2A 所示，共檢測出78 種揮發(fā)性風味物質(zhì)。其中，人工合成菌群制作的大曲揮發(fā)性化合物種類均為69 種，接種傳統(tǒng)母曲的揮發(fā)性化合物種類為68 種。其中接種人工合成菌群2 的曲塊揮發(fā)性物質(zhì)含量最高，為855. 40 mg/kg，是CK 的1.95 倍。CK、人工合成菌群1 和菌群2 大曲中的乙偶姻含量分別為12. 27、20. 27、506. 90 mg/kg，相比于CK，人工合成菌群1 和菌群2 的大曲分別提高了1.65 和4.13 倍。此外，接種人工合成菌群制作大曲也可提高大曲中四甲基吡嗪含量。CK、人工合成菌群1 和菌群2 大曲中四甲基吡嗪含量分別為11. 36、31. 90、56.73 mg/kg，相比于CK，接種人工合成菌群1 和菌群2 分別提高了2.80 和4.99 倍。

大曲接種新鮮高粱高溫堆積發(fā)酵1 個月后，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測酒醅揮發(fā)性物質(zhì)。結(jié)果如圖2B 所示，共檢測出71 種揮發(fā)性風味物質(zhì)。CK、人工合成菌群1 和菌群2 發(fā)酵的酒醅中分別檢測出50、66 和54 種揮發(fā)性物質(zhì)。就種類來看，接種人工合成菌群制作的大曲提高了發(fā)酵酒醅中揮發(fā)性物質(zhì)的種類?？倱]發(fā)性物質(zhì)含量最高的酒醅是接種人工合成菌群1 曲塊發(fā)酵的，為2 183. 51 mg/kg。此外，接種人工合成菌群1 和菌群2 發(fā)酵的酒醅中四甲基吡嗪的含量分別為0.76、2. 74 mg/kg，比CK 發(fā)酵的酒醅產(chǎn)量分別提高了4.03 和14.61 倍。

3 討論

嗜熱真菌中的宛氏擬青霉、微小根毛霉、嗜熱子囊菌為高溫大曲及釀造系統(tǒng)中的優(yōu)勢真菌［24，27］。本研究利用小麥為原料，將高溫大曲中分離篩選的地衣芽孢桿菌、釀酒酵母、宛氏擬青霉、微小根毛霉和嗜熱子囊菌分別制備成固態(tài)菌劑并按比例構(gòu)建人工合成菌群。采用人工合成菌群替代傳統(tǒng)母曲制作高溫大曲試驗結(jié)果表明，接種人工合成菌群2 的曲塊發(fā)酵力最高，是CK 曲塊的1.28 倍。糖化力和液化力均是接種人工合成菌群制作的曲塊高，其中接種人工合成菌群1 的曲塊糖化力是CK 的5.89 倍，液化力是CK 的46.50 倍，這可能與人工合成菌群1 中含有宛氏擬青霉有關(guān)，供試的3 株嗜熱真菌中宛氏擬青霉的糖化酶活性最高，同時其淀粉酶活性也較高。接種人工合成菌群2 的曲塊糖化力和液化力分別是CK 的1.79 和5.00 倍。酶活性高低可影響大曲的理化指標［28］，高溫大曲的液化力、糖化力、發(fā)酵力是檢測其品質(zhì)的重要指標［29］。本研究結(jié)果顯示，可通過選擇具有不同酶活特性和不同菌群組成的人工合成菌群來實現(xiàn)對高溫大曲的液化力和糖化力等性狀的精準調(diào)控。對制作的大曲進行屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)3 種大曲的優(yōu)勢真菌屬為Lichtheimia，優(yōu)勢細菌屬為Bacillus。以人工合成菌群為接種劑制作的高溫大曲的微生物種類也很豐富，這與制作大曲的原料小麥本身攜帶微生物及相對開放的發(fā)酵環(huán)境有關(guān)［30］。

從接種傳統(tǒng)母曲的曲塊和2 種人工合成菌群的高溫大曲曲塊中分別檢測出68 和69 種揮發(fā)性物質(zhì)成分。其中接種人工合成菌群2 的曲塊的揮發(fā)性物質(zhì)含量最高，是CK 的1.95 倍。揮發(fā)性物質(zhì)中的乙偶姻和四甲基吡嗪是白酒風味的重要組成成分［31］，其中四甲基吡嗪也是白酒行業(yè)公認的“ 健康因子”［32-34］。接種人工合成菌群制作大曲可顯著提高乙偶姻和四甲基吡嗪的含量。與CK 相比，接種人工合成菌群1 和菌群2 大曲曲塊的乙偶姻含量分別提高了1.65 和4.13 倍，四甲基吡嗪含量分別提高了2.80 和4.99 倍。

將CK、人工合成菌群1 和菌群2 制作的高溫大曲分別用于高溫堆積發(fā)酵，從發(fā)酵酒醅中分別檢測出50、66 和54 種揮發(fā)性物質(zhì)。其中接種人工合成菌群1 曲塊發(fā)酵酒醅的醇類、酸類、酯類、酮類和醛類物質(zhì)含量最高。酯類物質(zhì)能為白酒提供花香與果香，酸類物質(zhì)能穩(wěn)定香氣，醇類物質(zhì)、醛類物質(zhì)對白酒風味層次具有貢獻作用［35-36］。此外，與CK 相比，人工合成菌群1 和菌群2 發(fā)酵酒醅的四甲基吡嗪含量分別提高了4.03 和14.61 倍，表明人工合成菌群替代傳統(tǒng)母曲制作的高溫大曲可顯著提高酒醅中四甲基吡嗪含量。

綜上，本研究采用3 株嗜熱真菌（宛氏擬青霉、微小根毛霉、嗜熱子囊菌）、1 株釀酒酵母和1 株地衣芽孢桿菌構(gòu)建了一種精簡的人工合成菌群。采用人工合成菌群替代傳統(tǒng)母曲進行的實驗室規(guī)模的高溫大曲制備結(jié)果表明，接種人工合成菌群的高溫大曲液化力和糖化力均比接種傳統(tǒng)母曲的對照組有顯著提高，同時人工合成菌群能顯著提高大曲及酒醅中四甲基吡嗪的含量。表明人工合成菌群在定向調(diào)控大曲酶活性以及白酒中某些特定風味組分及含量等方面具有潛在的應用價值。

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（責任編輯：邊書京）