摘要 為探究細(xì)菌微生物群落在楊樹濕心材發(fā)病過程中的作用，以江漢平原6 年生華石2 號黑楊濕心材和正常材為研究對象，采用高通量測序?qū)?6S rRNA 基因V5―V7 區(qū)進(jìn)行測序，對測序列結(jié)果進(jìn)行信息學(xué)分析，利用主成分分析、α 多樣性指數(shù)分析和微生物網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)等方法，探究6 年生黑楊濕心材和正常材細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)和組成差異。結(jié)果表明：6 年生華石2 號黑楊濕心材和正常材細(xì)菌微生物群落屬水平上，勞爾氏菌屬和擬桿菌屬的細(xì)菌豐度最高，擬桿菌屬、多形單胞菌屬和氫孢菌屬在濕心材中占比顯著高于正常材（Plt;0.05）。微生物群落功能分析顯示，勞爾氏菌屬多為植物病原菌，在濕心材中廣泛存在。α 多樣性指數(shù)分析表明，濕心材群落多樣性和物種分布均勻度高于正常材，物種總數(shù)低于正常材。共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)研究表明，黑楊正常材細(xì)菌微生物之間存在較多的競爭和拮抗作用，群落較不穩(wěn)定，濕心材細(xì)菌間存在更多的協(xié)同和互生關(guān)系，微生物群落較穩(wěn)定。關(guān)鍵微生物分析表明，6 年生黑楊濕心材中關(guān)鍵細(xì)菌微生物是Aquabacterium、WCHB1-32 等，6 年生黑楊正常材中關(guān)鍵細(xì)菌微生物是Pleomorphomonas、Dysgonomonas，這些關(guān)鍵微生物在穩(wěn)定濕心材微生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中發(fā)揮著重要作用。以上結(jié)果表明，黑楊濕心材形成受多方面因素的影響，是由微生物群落共同作用產(chǎn)生的結(jié)果。

關(guān)鍵詞 黑楊； 濕心材； 高通量測序； 細(xì)菌； 微生物群落

中圖分類號 S792.11 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1000-2421（2024）04-0221-09

楊樹（Populus spp.）生長速度快、分布廣，是我國最重要的短周期工業(yè)用材林和防護(hù)林樹種之一［1］。楊樹木材是一種重要的制漿造紙原料，我國大部分企業(yè)都采用楊樹木材制漿工藝生產(chǎn)紙漿，同時楊樹也是較好的膠合板用原材料［2］。然而，楊樹濕心材病是一種難防治的枝干病害，在國內(nèi)外發(fā)生普遍，且危害嚴(yán)重。楊樹濕心材病變會使其組織理化性質(zhì)發(fā)生改變［3］，并表現(xiàn)出更高的水分含量、更深的顏色、腐爛的木材和惡臭的液體氣味［4］，給楊樹的加工和利用帶來十分不利的影響。

濕心材病主要是由微生物活動導(dǎo)致的，宋春草等［5］從楊樹濕心材中分離出的楊柳歐文氏桿菌（Brenneria salicis）能導(dǎo)致被侵染的楊樹植株出現(xiàn)典型濕心材癥狀，王奎［6］從楊樹濕心材病株組織中分離出果膠桿菌屬（Pectobacterium spp.），經(jīng)莖注射和莖割傷法接種能使楊樹莖部產(chǎn)生典型的濕心病癥狀，王明鳳［7］從楊樹濕心材中分離出柳歐文氏桿菌（Brenneria salicis）和胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜軟腐亞種（Pectobacterium carotovorum subsp.carotovo?rum），接種楊樹莖后可引起濕心材病害。因此，導(dǎo)致濕心材形成的致病菌是多樣的。

微生物共生是影響植物健康和生態(tài)系統(tǒng)功能的主要因素之一［8］。楊樹濕心材病通常由病原微生物侵染所致，也受到微生物共生影響，同時還與環(huán)境、基因、樹齡、地下水位等多種因素有關(guān)［9］。研究表明，楊樹濕心材多發(fā)生在地下水位較高的環(huán)境中，楊樹濕心材部分由于含水量高往往處于一個厭氧的環(huán)境。濕心材的產(chǎn)生也會使楊樹內(nèi)部生化環(huán)境發(fā)生變化，含水量增加，營養(yǎng)物質(zhì)下降，不含或含有極少量氧氣，濕心材這種環(huán)境會對大多數(shù)微生物生長產(chǎn)生抑制作用，同時楊樹濕心材浸提物中存在的酚酸類化合物對微生物群落也有影響［10］。有學(xué)者認(rèn)為楊樹濕心材和正常材的微生物成分存在差異，這些差異反映了濕心材形成的原因。目前有關(guān)楊樹濕心材微生物群落結(jié)構(gòu)研究甚少，Yu 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，楊樹濕心材與正常材之間細(xì)菌群落組成存在顯著差異，而真菌群落內(nèi)沒有觀察到明顯差異，且木材化學(xué)性質(zhì)與細(xì)菌屬相對豐度顯著相關(guān)。為此，本研究選取6 年生樹齡的美洲黑楊（Populus deltoides）品種華石2號楊（Populus deltoides Bartr‘. Huashi 2’）作為研究對象，通過Illumina-MiSeq 高通量測序?qū)ζ錆裥牟暮驼２倪M(jìn)行微生物多樣性分析，以期為楊樹濕心材的形成機制和防治方法提供有效指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

研究樣本為湖北省林業(yè)科學(xué)研究院在江漢平原石首市南口鎮(zhèn)栽培的華石2 號黑楊（Populus deltoi?des Bartr‘. Huashi 2’），采樣的樹齡為6年生，隨機選取8 株樹分別采集濕心材和正常材（表1）。

楊樹濕心材病嚴(yán)重度分為若干等級，并以數(shù)值0、1、3、5 代表等級，按照濕芯占木芯總長度的比值來劃分。0 級：0；1 級：0～1/3；3 級：1/3～2/3；5 級：2/3～1。

1.2 樣品采集

于2022 年10 月21 日，在樹高1.3 m 處用5.0 mm直徑的生長錐采取鉆心取樣法收集木芯，取樣時保持鉆頭與楊樹樹干垂直，并測量樣本樹木芯長度、濕芯長度等指標(biāo)，隨機選取8 株取樣。將取好的木材樣品分別用密封管密封，標(biāo)記編號和日期，迅速放在干冰中帶回試驗室凍存，用于微生物高通量測序。

1.3 高通量測序

基因組DNA 的提取和PCR 擴(kuò)增：樣本基因組DNA 采用CTAB 方法提取，檢測純度和濃度后將DNA 樣本稀釋至1 ng/μL。以稀釋后的DNA 樣本為模板， 使用799F （5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3'） 和1193R （5'-ACGTCATCCCCACCTTCC-3'）引物對V5—V7 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增［12-13］。PCR 產(chǎn)物的混樣和純化：對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，通過檢測的PCR 產(chǎn)物等量混合后再次電泳檢測，使用Qiagen 公司提供的QIAquickGel Extraction Kit 膠回收試劑盒回收目的條帶產(chǎn)物。

文庫構(gòu)建和上機測序：使用TruSeq? DNAPCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，利用Qubit 和Q-PCR 定量后，使用Nova‐Seq6000 對合格文庫上機測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)擴(kuò)增區(qū)域的特征，構(gòu)建小片段文庫，并基于Illumina NovaSeq 測序平臺對文庫進(jìn)行雙末端測序。經(jīng)過Reads 拼接過濾，操作分類單元（operational taxonomicunits，OTUs）聚類降噪，對得到的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行物種注釋和豐度分析，以確定樣本的物種組成，并進(jìn)行α 多樣性分析，以挖掘樣本間群落結(jié)構(gòu)的差異及進(jìn)行個性化分析和深度的數(shù)據(jù)挖掘。

OTU 聚類和物種注釋：采用Uparse 算法對所有樣本的有效標(biāo)簽進(jìn)行聚類，按97% 的一致性將序列聚類為OTUs，篩選出OTUs 中出現(xiàn)頻率最高的序列為代表序列［14］。對OTUs 序列進(jìn)行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8～1.0），分析各樣本的群落組成［15］。使用MUSCLE 軟件進(jìn)行多序列比對，最后以樣本中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理［16］。

1.5 分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用MENAP 和Cytoscape 軟件，構(gòu)建微生物網(wǎng)絡(luò)。首先，標(biāo)準(zhǔn)化屬水平豐度，獲取屬水平標(biāo)準(zhǔn)相對豐度（standardized relative abundances，SRA）。將屬水平SRA 矩陣提交MENAP，構(gòu)建微生物網(wǎng)絡(luò)；使用greedy modularity optimization 確定模塊（modules）。提交屬水平 SRA，病情指數(shù)，屬水平注釋信息表格，采用Cytoscape 3.7.2 對網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行可視化處理。細(xì)菌微生物網(wǎng)絡(luò)由不同屬（nodes）組成，屬之間正或負(fù)相互作用用連接（edges）表示。

對所有樣本進(jìn)行相關(guān)性指數(shù)（斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)SCC 或皮爾森相關(guān)系數(shù)PCC）計算，得到物種相互關(guān)系數(shù)矩陣后，設(shè)置過濾條件得到共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 病情指數(shù)分析

由表1 樣品組織的生物學(xué)信息可知，6 年生華石2 號黑楊（HS2-2017）的病情等級為3～5，病情指數(shù)為65.0。

2.2 黑楊濕心材與正常材OTU分布情況及微生物群落Alpha 多樣性

為進(jìn)一步探究每個樣本中細(xì)菌微生物多樣性的相互關(guān)系，通過韋恩分析觀察6 年生華石2 號黑楊濕心材、正常材的OTU 數(shù)目組成相似性及重疊情況。濕心材和正常材樣品共有的OTU 數(shù)目為502，不同樣品中特有OTU 表現(xiàn)為濕心材（HS17X）247個、正常材（HS17B）486 個（圖1）。6 年生華石2 號黑楊濕心材與正常材中微生物組成明顯不同，正常材（HS17B）特有OTU 數(shù)目最多。

微生物群落Alpha 多樣性可以體現(xiàn)微生物群落的多樣性與豐富度。香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）代表樣品中的分類總數(shù)及其占比，群落多樣性越高，物種分布越均勻，Shannon 指數(shù)越大；辛普森指數(shù)（Simpson index）表征群落內(nèi)物種分布的多樣性和均勻度，Simpson 值越高，多樣性越大。從表2 可以看出，6 年生華石2 號黑楊濕心材和正常材微生物群落的Shannon 指數(shù)與Simpson 指數(shù)變化趨勢類似，濕心材細(xì)菌群落的Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)都顯著高于正常材（Plt;0.05），結(jié)果表明，黑楊濕心材群落多樣性相比正常材較高，物種分布均勻度較好。Chao1 指數(shù)用來估計群落樣品中包含的物種總數(shù)，由表2 可知，濕心材群落細(xì)菌物種總數(shù)低于正常材，但沒有顯著性差異。

2.3 華石2 號黑楊細(xì)菌微生物群落分析

在屬水平，選取豐度前10 的微生物進(jìn)行作圖分析。由圖2 可知，在細(xì)菌屬水平上，黑楊濕心材和正常材中勞爾氏菌屬（Ralstonia）、擬桿菌屬（Bacteroi?des）2 個屬占據(jù)了超過24.6% 的相對豐度，為優(yōu)勢菌屬。對比濕心材與正常材的豐度，Ralstonia 在濕心材中占比顯著低于正常材（Plt;0.05），Bacteroides、多形單胞菌屬（Pleomorphomonas）和氫孢菌屬（Hy?drogenispora）在濕心材中占比顯著高于正常材（Plt;0.05）。擬桿菌屬是革蘭氏陰性、不形成孢子、厭氧和桿狀細(xì)菌，在厭氧條件下發(fā)酵產(chǎn)生大量有機酸如乙酸、異戊酸和琥珀酸［17］；多形單胞菌屬也可以在厭氧的條件下產(chǎn)生H2和CO2［18］，而CO2也可以促進(jìn)木材pH 的進(jìn)一步下降；Hydrogenispora ethanolica LXBT可利用葡萄糖產(chǎn)乙酸、乙醇和H2［19］，這3 種菌屬可能是造成濕心材pH 的下降以及腐臭味產(chǎn)生的重要因素。

利用樣本的OTU 豐度信息計算Bray Curtis，并用主坐標(biāo)分析（PCoA）法分析以上樣本的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異，發(fā)現(xiàn)PC1 和PC2 共同揭示了總?cè)郝涞?6.19% 的差異，濕心材與正常材組內(nèi)樣本之間微生物細(xì)菌群落存在差異，2 個組別樣本之間細(xì)菌群落具有一定的差異性（圖3A）?；贏NOSIM 組間差異檢驗的NMDS 分析表明，濕心材與正常材組別樣本之間細(xì)菌OTU（R=0.32，P=0.004）存在極顯著差異（圖3B）。

2.4 細(xì)菌相互作用網(wǎng)絡(luò)及可視化分析

根據(jù)16S 高通量測序的結(jié)果，以接近的相似閾值（St）用于HS17X（0.87）和HS17B（0.88）細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析結(jié)果如圖4 所示，濕心材（HS17X）和正常材（HS17B）細(xì)菌相互作用網(wǎng)絡(luò)分別由81 和110 個節(jié)點以及148 和181 個連接組成。在6 年生濕心材與正常材網(wǎng)絡(luò)中，np（節(jié)點與其他節(jié)點存在負(fù)相互作用）占比分別為63.51%（94/148）和74.03%（134/181），表明濕心材和正常材細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中都存在較多的資源競爭和抑制作用，濕心材細(xì)菌間存在更多的協(xié)同和互生關(guān)系，濕心材網(wǎng)絡(luò)相對較穩(wěn)定。

HS17X 細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)和HS17B 細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)的平均連通度分別為3.654 和3.291（表3），更高的連通度表明HS17X 網(wǎng)絡(luò)比HS17B 網(wǎng)絡(luò)更復(fù)雜。HS17X 細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)和HS17B 細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)的平均路徑距離分別為3.288和3.920，說明HS17X 的節(jié)點在群落聚集程度更高。

HS17X 網(wǎng)絡(luò)的平均聚類系數(shù)為0.147，大于HS17B網(wǎng)絡(luò)平均聚類系數(shù)，說明HS17X 的節(jié)點更緊密，HS17X 的細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)更為穩(wěn)定和復(fù)雜。通過構(gòu)建濕心材和正常材的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)濕心材細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)表現(xiàn)出極其復(fù)雜的互作關(guān)系，其相互作用機制還需要進(jìn)一步研究，而正常材細(xì)菌互作則顯得相對簡單，這可能是濕心材內(nèi)部細(xì)菌共同促進(jìn)植物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和防御病原物的入侵，經(jīng)過長期相互作用，形成了相比于正常材較穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)環(huán)境。

2.5 關(guān)鍵微生物分析

在微生物網(wǎng)絡(luò)分析中，用Zi 值和Pi 值分別描述節(jié)點的模塊內(nèi)連通性和模塊間連通性，根據(jù)Zi值和Pi值可以將節(jié)點分為：外圍節(jié)點（Zilt;2.5 且Pilt;0.62）、連接器（Zilt;2.5 且Pigt;0.62）、模塊集線器（Zigt;2.5 且Pilt;0.62）和網(wǎng)絡(luò)集線器（Zigt;2.5 且Pigt;0.62）。在分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中，不同節(jié)點的拓?fù)鋵W(xué)角色可以作為識別關(guān)鍵微生物的依據(jù)，根據(jù)Deng 等［20］研究結(jié)果，Zi≥2.5 或Pi≥0.62 的節(jié)點被定義為關(guān)鍵物種，這些微生物在各自的大模塊中起著聯(lián)系模塊內(nèi)部微生物的重要作用。從圖5 和表4 中可以看出，在6 年生黑楊濕心材中發(fā)揮關(guān)鍵作用的細(xì)菌主要為變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、擬桿菌門（Bacteroidota）和放線菌門（Actinobacteria）。其中，關(guān)鍵微生物WCHB1-32 參與秸稈難降解組分如木質(zhì)素的分解，是木質(zhì)素的潛在降解菌［21］，由此推測，WCHB1-32 可能參與了濕心材中木質(zhì)素的降解。

從圖5 和表4 可以看出，在6 年生正常材中發(fā)揮關(guān)鍵作用的細(xì)菌主要為Bacteroidota、Sumerlaeota、Proteobacteria、Actinobacteria 和厚壁菌門（Firmicutes）。6 年生正常材關(guān)鍵微生物中，Pleomor?phomonas 多為植物病原菌，可以在厭氧的條件下產(chǎn)生氫氣和二氧化碳［18］。Dysgonomonas 也是厭氧條件下營發(fā)酵細(xì)菌，并且在6 年生黑楊正常材和濕心材都占據(jù)了超過6.84% 的相對豐度（圖2）。研究者發(fā)現(xiàn)，在白蟻后腸中該屬也是優(yōu)勢微生物，在D. macro?termitis 基因組中有多個木質(zhì)纖維素降解酶基因，且具備完整的木質(zhì)纖維素降解和乙酸、乳酸生成通路［22］，這符合楊樹發(fā)生濕心材的特征，即木質(zhì)纖維素被降解而產(chǎn)生有機酸導(dǎo)致木材的酸化。有研究表明，Marmoricola（棲大理石雕菌屬）是潛在有益菌，可以促進(jìn)作物生長，提高作物抵抗病害的能力，具有較大的應(yīng)用潛力［23］。

3 討論

本研究以6 年生華石2 號黑楊為材料，研究濕心材與正常材細(xì)菌微生物群落比較。濕心材的發(fā)生既與楊樹本身生長快速的特性相關(guān)，也與楊樹所處的生態(tài)環(huán)境如地下水位較高相關(guān)。究其原因，濕心材就是在這樣的條件下，由于楊樹木質(zhì)部微生物的作用，最終導(dǎo)致楊樹木質(zhì)部腐爛變質(zhì)的現(xiàn)象。濕心材的發(fā)生，除了已經(jīng)報道的某些病原微生物的侵染［5-6］，我們推測濕心材的發(fā)生應(yīng)該是楊樹在厭氧條件下體內(nèi)微生物相互作用的結(jié)果。

本研究通過α 多樣性指數(shù)分析和構(gòu)建6 年生華石2 號黑楊濕心材和正常材微生物網(wǎng)絡(luò)分析圖發(fā)現(xiàn)，濕心材物種總數(shù)低于正常材，表明許多微生物在濕心材中生存受到抑制。大多數(shù)研究報道，濕心材的產(chǎn)生會使楊樹內(nèi)部生化環(huán)境發(fā)生變化，心材含水量遠(yuǎn)高于邊材，營養(yǎng)物質(zhì)下降，不含氧氣或氧氣很少［9］，濕心材這種環(huán)境會抑制大多數(shù)微生物生長。植物在受到病原菌侵染時會分泌大量的酚酸類化合物來抵御病原菌侵染，這些酚酸類物質(zhì)會通過損傷植物細(xì)胞膜以及破壞其他生化過程對植物造成危害［24］，會抑制某些細(xì)菌生長，導(dǎo)致微生物總數(shù)下降，這與本研究結(jié)論相符。

本研究分析了豐度最高的10 個細(xì)菌屬，其中Ralstonia 為優(yōu)勢菌屬且多為植物病原菌［25］，推測Ralstonia 可能和濕心材的發(fā)生有關(guān)。Bacteroides、Pleomorphomonas、Hydrogenispora 等都是厭氧細(xì)菌，在厭氧條件下發(fā)酵產(chǎn)生大量有機酸如乙酸、異戊酸和琥珀酸［17-19］，可能是造成木材pH 的下降以及腐臭味產(chǎn)生的重要因素。微生物通過相互作用構(gòu)成微生物網(wǎng)絡(luò)，共同維持群落的穩(wěn)定性［26］。6 年生華石2 號黑楊濕心材與正常材中維持微生物網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵細(xì)菌微生物有所區(qū)別，大多數(shù)是植物病原菌（例如Pleo?morphomonas）、可能改變環(huán)境（如pH）的菌株（例如Pleomorphomonas、Dysgonomonas、WCHB1-32）和促進(jìn)植物生長的有益菌（例如Marmoricola），這些菌株通過協(xié)同、拮抗等相互作用共同參與了濕心材的形成并被濕心材內(nèi)部環(huán)境所影響。本研究發(fā)現(xiàn)微生物網(wǎng)絡(luò)中6 年生黑楊濕心材比6 年生黑楊正常材微生物群落穩(wěn)定，濕心材細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)表現(xiàn)出及其復(fù)雜的互作關(guān)系，能否通過促進(jìn)或抑制某些關(guān)鍵微生物生長，以達(dá)到改變楊樹濕心材理化性質(zhì)，提高楊樹質(zhì)量的目的，仍需進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：葛曉霞）