摘 要：目的：對熟肉制品、速凍調理肉、速凍水產制品、即食果蔬制品、冷凍飲品和乳制品6類食品開展單核細胞增生李斯特氏菌檢測，總結試驗注意事項，評估病原菌污染風險，為食品質量監(jiān)控提供依據(jù)。方法：依據(jù)國家標準對樣品進行增菌、分離、初篩、鑒定，計算檢出率。結果：速凍調理肉、速凍水產制品、冷凍飲品3類食品均檢出單核細胞增生李斯特氏菌，其中冷凍飲品檢出率最高。結論：冷凍食品有單核細胞增生李斯特氏菌污染風險；選擇合適的檢測方法監(jiān)控病原菌，可降低單核細胞增生李斯特氏菌食品污染發(fā)生概率，保障食品安全。

關鍵詞：單核細胞增生李斯特氏菌；培養(yǎng)；檢測；檢出率

Application Analysis of Detection Methods for Listeria monocytogenes in Food

ZHU Shiyu， REN Guanda， GUO Xu， ZHAO Ziyi

（Shenyang Market Regulatory Affairs Service Center （Shenyang Product Quality Supervision and Inspection Institute）， Shenyang 110022， China）

Abstract： Objective： To detect Listeria monocytogenes in cooked meat products， quick-frozen prepared meat， quick-frozen aquatic products， ready-to-eat fruit and vegetable products， frozen drinks and dairy products. Summarize the precautions of the test， assess the risk of pathogen contamination， to provide the basis for food quality control. Method： According to the national standard， the samples were increased， separated， screened， identified and calculate the detection rate. Result： Listeria monocytogenes were detected in frozen prepared meat， frozen aquatic products and frozen drinks. The detection rate of frozen drinks was the highest. Conclusion： Frozen food has the risk of Listeria monocytogenes contamination. Select the appropriate test method to monitor the pathogen， reduce the probability of Listeria monocytogenes contaminating food， ensure food safety.

Keywords： Listeria monocytogenes; cultivate; detection; detection rate

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM）在自然界普遍存在，如土壤、植物、地表水等。該菌屬于一種人畜共患病的病原菌，動物和人攝入受污染的水或食物感染該細菌后會引發(fā)疾病。通常情況下，LM是革蘭氏陽性嗜冷桿菌，具有較強的生長繁殖能力，在4～45 ℃環(huán)境中均可以生長繁殖，污染環(huán)境的風險較高[1]。生活環(huán)境中存在LM污染會大幅提升人類感染患病風險，免疫力低下的人群如老人、嬰幼兒是該菌的易感染人群。LM可突破腸道、血腦和胎盤屏障，引發(fā)機體腸道炎、腦膜炎，甚至導致孕婦流產，現(xiàn)已被列為食品主要致病菌之一[2]。因此，重視對LM污染的監(jiān)控，借助快速檢驗方法對食品中LM開展檢驗，對于保護消費者生命健康、保障公共衛(wèi)生具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

隨機選取不同區(qū)域的食品消費場所的熟肉制品、速凍調理肉、速凍水產制品、即食果蔬制品、冷凍飲品、乳制品6類食品產品。菌種：單增李斯特氏菌（編號ATCC 19111）、伊氏李斯特氏菌（編號ATCC 19119）、斯氏李斯特氏菌（編號ATCC 35967）、英諾克李斯特氏菌（編號ATCC 33090）、馬紅球菌（編號ATCC 6939）和金黃色葡萄球菌（編號ATCC 25923）。

酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯、酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂、血瓊脂培養(yǎng)基、李氏增菌肉湯、PALCAM瓊脂、李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基、SIM動力培養(yǎng)基和生化鑒定試劑盒，均購自北京陸橋技術股份有限公司。

1.2 儀器與設備

LE2002E電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UBM-400拍擊式均質器，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；BF-115生化培養(yǎng)箱，德國賓得科技公司；CI-L生物顯微鏡，日本尼康科技公司；A2-1379生物安全柜，美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 檢驗方法

（1）增菌。依據(jù)《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》（GB 4789.30—2016）對樣品進行增菌，以無菌操作選擇25 g（mL）待檢測樣品和25 mL李斯特質控菌種菌液分別將其置于225 mL LB1培養(yǎng)液中，混勻，將其置于（30±1） ℃培養(yǎng)18～24 h，取培養(yǎng)液0.1 mL置于10 mL LB2培養(yǎng)液中，混勻，置于（30±1）℃培養(yǎng)18～24 h。

（2）分離。依據(jù)GB 4789.30—2016分離污染菌，取上述樣品和質控菌種培養(yǎng)液，接種于PALCAM培養(yǎng)基和LM顯色瓊脂培養(yǎng)基。將其置于（36±1）℃培養(yǎng)24～48 h。

（3）初篩。依據(jù)GB 4789.30—2016純培養(yǎng)可疑目標菌，將可疑目標菌和質控菌種接種到酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，置于（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h。同時接種鼠李糖發(fā)酵培養(yǎng)基和木糖發(fā)酵培養(yǎng)基，置于（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h。

（4）鑒定。依據(jù)GB 4789.30—2016對可疑目標菌和質控菌種開展鑒定試驗，將上述培養(yǎng)物接種到SIM動力培養(yǎng)基中于（25±1）℃培養(yǎng)24～48 h。同時接種到生化試劑培養(yǎng)基（MR、VP、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、七葉苷）中，將其放置在（36±1）℃環(huán)境下培養(yǎng)24～48 h，觀察反應現(xiàn)象。將上述培養(yǎng)物接種到血瓊脂平板上，在平板的底部位置分隔出多個小格，在各個小格中引入一種菌落，置于（36±1）℃培養(yǎng)24～48 h。

2 結果與分析

2.1 鑒定結果

陽性樣品和LM質控菌種鏡檢為革蘭氏陽性菌，有動力生長現(xiàn)象，鑒定結果如表1所示。其中鼠李糖黃色為陽性，綠色為陰性；木糖黃色為陽性，綠色為陰性；MR紅色為陽性，無色為陰性；VP紅色為陽性，無色為陰性；葡萄糖黃色為陽性，綠色為陰性；麥芽糖黃色為陽性，綠色為陰性；甘露醇黃色為陽性，綠色為陰性；七葉苷黑色為陽性，無色為陰性。通過反應顏色判定陽性樣品和LM質控菌種顯示出鼠李糖陽性、木糖陰性、MR陽性、VP陽性、葡萄糖陽性、麥芽糖陽性、甘露醇陰性及七葉苷陽性，且溶血試驗未出現(xiàn)明顯溶血現(xiàn)象，將符合此鑒定結果的樣品判定為陽性檢出。在鑒定檢測中為了獲得良好鑒定效果，選擇應用商品化生化試劑盒開展檢驗，操作方便，可減少檢驗時間。在試驗過程中與質控菌種鑒定對比，防止非目標菌的干擾。

2.2 樣品檢出率

通過以上鑒定方法對2021—2023年抽取的472份

食品樣品進行LM檢驗，結果顯示陽性樣品共5份，檢出率為1.06%。各年份檢出情況如表2所示。

472份樣品分為熟肉制品、速凍調理肉、速凍水產制品、即食果蔬制品、冷凍飲品和乳制品，各類別檢驗出情況如表3所示。冷凍飲品檢出率最高，達到1.82%，其余依次為速凍水產制品（1.72%）、速凍調理肉（1.64%），熟肉制品、即食果蔬制品和乳制品未檢出LM。

3 結論與討論

LM在食品致病菌檢驗中屬于較為常見的指標，2021—2023年隨機選取的472份6類食品樣品中，LM平均檢出率為1.06%，說明食品產品存在LM污染風險。其中，冷凍飲品檢出率為1.82%，在6類食品中檢出率最高，其次為速凍水產制品和速凍調理肉，檢出率分別為1.72%和1.64%。LM病原菌即便在低溫、高滲環(huán)境下也能夠生長繁殖，所以冷凍不能抑制LM生長，LM在冷凍食品中檢出率較高。因此，食品冷凍儲存方式存在病原菌污染風險，在食品流通領域不能過度依賴食品的冷凍儲存方式，應定期對冷凍設備進行清洗消毒，監(jiān)控冷凍設備病原菌污染情況，在冷凍食品檢驗中要更加關注LM污染情況。

在對樣品開展LM檢測時，發(fā)現(xiàn)增菌環(huán)節(jié)有混濁現(xiàn)象，說明樣品中有污染菌。食品樣品往往受多種細菌污染，為有效檢出目標菌，在增菌環(huán)節(jié)要注意選擇適合的培養(yǎng)基排除干擾菌。LB培養(yǎng)液中加入吖啶黃以及萘啶酮酸2種試劑，對細菌脫氧核苷酸有一定抑制作用，可減少革蘭氏陰性菌的增殖[3]，LM在此營養(yǎng)條件下低溫培養(yǎng)可有效繁殖，有良好增菌效果。在增菌檢驗時，要注意培養(yǎng)基配制，防止過度熱處理影響培養(yǎng)基營養(yǎng)成分，添加上述2種試劑時要注意避光操作，添加時防止液體濺出，防止出現(xiàn)氣溶膠對環(huán)境和人員造成污染和傷害。在二次增菌時，取0.1 mL增菌液，注意增菌液完全混勻，確保增菌液培養(yǎng)的均勻性，防止出現(xiàn)漏檢問題。在分離環(huán)節(jié)，典型菌落在PALCAM瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈；在顯色瓊脂培養(yǎng)基上為藍綠顏色菌落，周邊存在白色暈圈。應用顯色瓊脂培養(yǎng)基分離目標菌種，較普通培養(yǎng)基更加便捷有效。在分離檢驗時，分離瓊脂培養(yǎng)基應現(xiàn)用現(xiàn)配，確保培養(yǎng)時間足夠滿足細菌生長要求，注重分離單個菌落，辨別菌落形態(tài)顏色，與質控菌種做對照，防止帶入雜菌和出現(xiàn)漏檢的情況。根據(jù)菌體抗原類型可將LM分為多個血清型，不同血清型的毒力、致病性不同，LM致病性強的血清型與其他細菌有重合抗原，因此鑒定血清型對分辨LM致病性沒有意義，反而通過生化反應鑒定LM更準確。在生化鑒定環(huán)節(jié)，鼠李糖發(fā)酵和木糖發(fā)酵是初篩生化反應，要注意辨別發(fā)酵反應的顏色，在鑒定檢驗時要應用生化試劑盒，注意接種菌懸液濃度為0.5麥氏濁度防止出現(xiàn)假陽性。應用生化試劑盒進行檢驗可節(jié)省配制培養(yǎng)基的時間，更加快速地鑒別細菌。此外，隨著科技的發(fā)展，目前利用分子生物學技術鑒定LM病原菌已得到普及。通過分析病原菌的actA基因序列，進行引物和RPA探針設計，進而應用PCR分子生物學技術開展病原菌檢測[4]。此方法鑒定結果更準確，但操作過程有分子生物污染風險，并且步驟煩瑣，不便于常規(guī)篩查食品中LM污染情況，而應用熒光定量PCR技術可規(guī)避分子生物學污染問題，并實現(xiàn)LM的定量分析[5]。

綜上所述，相關監(jiān)管部門和食品生產企業(yè)應選擇高效、準確的檢測技術開展食品和環(huán)境中LM檢測工作，關注冷凍食品LM的風險監(jiān)測，對食品污染情況進行評估，及時找出影響食品安全的因素，保證食品市場健康發(fā)展。

參考文獻

[1]余琪，吳忠紅，譚慧林.食品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢驗探討[J].現(xiàn)代食品，2020（10）：146-147.

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[3]王海艷，劉中學，劉虹，等.干奶粉中單增李斯特氏菌的生存評估[J].檢驗檢疫科學，2008（4）：19-22.

[4]郭正洋，陳晶，劉小青，等.單核細胞增生李斯特氏菌熒光RPA快速檢測方法的建立[J].基因組學與應用生物學，2020，39（12）：5599-5605.

[5]王小紅.熒光定量PCR技術研究進展[J].國外醫(yī)學（分子生物學分冊），2001（1）：42-45.