【摘 要】目的：NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白6（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 6，NLRP6）是新發(fā)現(xiàn)的寡聚化核苷酸結合結構域樣受體家族成員，廣泛表達于腸道、肝臟、腎臟、脾臟和肌肉等組織器官，在炎癥、焦亡和自噬等多種生物過程發(fā)揮廣泛的調節(jié)作用。近期研究表明，NLRP6在應激條件下對多種組織器官的疾病表型具有重要影響。然而，NLRP6對組織器官生長發(fā)育的影響尚未可知。方法：采用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建NLRP6基因敲除小鼠，飼養(yǎng)并記錄小鼠的生長和繁殖情況。將小鼠的脾、肝、心、腎、腦、四肢和后背皮膚等組織器官進行解剖和切片染色，以評估NLRP6基因敲除對實質器官的宏觀發(fā)育影響和對組織結構的微觀影響。結果：在自然狀態(tài)下，NLRP6基因敲除縮短了雄鼠的性成熟期并使成年雄鼠的睪丸發(fā)生不可逆的破潰與萎縮。在四肢發(fā)育上，NLRP6基因敲除誘導成年雄鼠后肢橫紋肌斷裂，導致后肢明顯萎縮。在脾臟發(fā)育上，NLRP6基因敲除不僅顯著增加了雄鼠的脾臟體積（Plt;0.01）還誘導雄鼠脾臟出現(xiàn)炎性細胞浸潤。在后背皮膚上，NLRP6基因敲除引發(fā)雄鼠后背皮膚出現(xiàn)明顯的潰瘍損傷、膠原纖維增生和炎性細胞浸潤。結論：在自然生長發(fā)育條件下，NLRP6基因敲除選擇性影響小鼠的生殖器發(fā)育與性成熟期、后肢肌肉發(fā)育、脾臟大小及其炎癥免疫狀態(tài)以及后背皮膚的結構完整性，而且這一作用具有明顯的雄激素依賴性。

【關鍵詞】NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白6；生長發(fā)育；睪丸；后肢；脾臟；后背皮膚

【中圖分類號】R363.1 【文獻標志碼】A 【收稿日期】2024-03-10

寡聚化核苷酸結合結構域樣受體（nucleotidebindingoligomerization domain-like receptor proteins，NLRs）是一種多結構域蛋白家族，分布于細胞質，可以識別病原體相關分子模式（pathogen-associatedmolecular patterns，PAMPs）或損傷相關分子模式（damage-associated molecular patters，DAMPs）等損傷信號，參與先天免疫應答反應，在固有免疫炎癥反應過程中發(fā)揮不可或缺的作用[1]。此外，NLRs蛋白家族還參與焦亡、凋亡、線粒體自噬和發(fā)育等生物過程[2-3]。NLRP6是新發(fā)現(xiàn)的NLRs家族成員，由N 端的吡啶（pyrin domain，PYD）、中心的核苷酸結合寡聚結構域（nucleoside triphosphatase domain，NACTH）結構域和C 端的富含亮氨酸的重復序列（leucine-rich repeat，LRR）組成[4]。在損傷信號刺激下，NLRP6 被激活并以炎癥小體形式調節(jié)炎癥反應[4-5]：NLRP6的PYD結構域與凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing aCARD，ASC）相互作用并形成寡聚體，引發(fā)Procaspase-1的裂解與活化，隨后促進IL-1β和IL-18的成熟與分泌，加強炎癥反應。例如，在RNA病毒感染的腸上皮細胞中，NLRP6通過其NACHT結構域與RNA解旋酶DHX15結合，促進NLRP6與ASC的相互作用，誘導NLRP6炎癥小體的組裝以及IL-18的成熟，增強炎癥反應，從而抑制RNA病毒的復制[6]。此外，NLRP6也能以蛋白單體形式調節(jié)炎癥反應。例如，在類風濕性關節(jié)炎中，NLRP6不僅直接抑制NF-κB的轉錄活性還能間接通過促進關鍵激活蛋白TAB2/3的溶酶體降解而阻斷NF-κB的激活，從而減少促炎細胞因子和基質金屬蛋白酶的產(chǎn)生，抑制炎癥反應[7]。在外周坐骨神經(jīng)損傷中，NLRP6的敲除上調ERK的磷酸化水平，增強炎癥反應，而且這一過程不依賴ASC和Caspase-1[8]。由此可見，NLRP6在不同的應激條件下能以不同的方式對炎癥反應發(fā)揮不同的調節(jié)作用。

NLRP6廣泛表達于腸道、肝臟、腎臟、脾臟和肌肉等組織器官，在應激條件下對疾病表型具有重要影響。在小鼠結腸炎模型中，敲除NLRP6能夠增加炎癥易感性，促進炎性細胞浸潤和促炎介質的產(chǎn)生，導致廣泛的腸道上皮損傷并延遲上皮屏障恢復[9]。在酒精性肝炎中，NLRP6不僅減輕肝細胞的脂肪變性和炎癥反應，還通過抑制肝星狀細胞的活化減輕肝組織纖維化，發(fā)揮肝臟保護作用[10]。在急性腎損傷中，NLRP6的下調能夠增強腎組織的炎性細胞浸潤，加重腎細胞死亡率和腎組織纖維化[11-12]。由此可知，NLRP6對多種組織器官的疾病表型具有重要影響。然而，在自然條件下，NLRP6對組織器官生長發(fā)育的影響尚未可知。因此，在本實驗中，本課題組應用CRISPR/Cas9 技術構建NLRP6 基因敲除小鼠，對其進行基因型鑒定和飼養(yǎng)繁殖，解剖并觀察小鼠的脾、肝、心、腎、腦、四肢和后背皮膚等組織器官，以評估NLRP6基因敲除對實質器官的宏觀發(fā)育影響和對組織結構的微觀影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

25～47 日齡（3～7 周齡）SPF 級C57BL/6N的NLRP6 基因敲除純合子（NLRP6-/-）小鼠共15 只，9 雌6雄，體重約為11～20 g左右，購自賽業(yè)（蘇州）生物科技有限公司【SCXK（蘇）2018-0003】。4～5周齡SPF級C57BL/6N的野生型（WT）小鼠數(shù)量共20只，10雌10雄，體重約為12～18 g左右，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK（京）2021-0006】。實驗動物飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學動物實驗中心【SYXK（渝）2022-0016】。飼養(yǎng)期間各組小鼠自由飲水，飼喂普通維持飼料由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心【SCXK（渝）2022-0010】提供。SPF級標準飼養(yǎng)：溫度（23±1）℃，相對濕度（50±15）％，12 h晝夜循環(huán)照明，籠子墊料等物品均進行高壓真空滅菌，飼料進行消毒，小鼠自由進食；小鼠自由飲水，飲用水達到純凈無菌要求。所有操作均符合實驗動物倫理學要求（審批號：IACUC-4th Hos Hebmu-1018001）。

1.1.2 主要試劑與儀器

鼠尾基因鑒定試劑盒（碧云天生物科技公司，D7283M，中國），引物合成（擎科生物，中國），蛋白酶K（天根生物，RT403，中國），核酸染料（榮達生物科技，中國），2X Taq Master Mix（蘇州近岸蛋白質科技，E005-01B，中國），TritonX-100（Thermo Fisher，85111，美國），100 bp DNAladder（天根生物，MD109，中國），BSA（鼎國生物，中國），瓊脂糖（天根生物，RT101，中國），PCR 擴增儀（百樂科技，中國），凝膠電泳儀（BIO-RAD，1704469，美國），凝膠成像儀（廣州光儀生物科技有限公司，0I100，中國），輪轉式石蠟切片機（瑞沃德，S700A，中國），蘇木精伊紅（HE）染色試劑盒（索萊寶生物科技有限公司，G1120，中國），Masson三色染色液試劑盒（塞維爾生物科技有限公司，G1006，中國），全自動數(shù)字病理掃描分析系統(tǒng)（江豐生物，KFPRO-002，中國），顯微鏡（江豐生物，KF-FL-020，中國）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的飼養(yǎng)與繁殖

在SPF 級條件下分別飼養(yǎng)NLRP6-/-小鼠和WT小鼠；分別選取6～8周齡、體質量20 g左右的NLRP6-/-小鼠（雄性和雌性）或WT小鼠（雄性和雌性）隨機按照2∶1方式合籠繁殖，根據(jù)小鼠產(chǎn)仔率高低，配2～5籠延續(xù)保種，留6只以上雌雄小鼠替換繁殖；待NLRP6-/-新生小鼠與WT新生小鼠長至3～4周齡，隨機按照每籠5∶1方式剪鼠尾基因鑒定。

1.2.2 引物設計

NLRP6引物和GAPDH 引物由擎科生物公司合成，引物序列見表1。

1.2.3 小鼠基因型鑒定

（1）小鼠基因組DNA提取。①獲取組織樣本：小鼠斷奶后，剪取尾尖長度2～3 mm的組織，置于1.5 mL EP管，在冰上暫時保存；②消化組織樣本：配制消化液時，把DNA Extraction Solution和蛋白酶K充分混勻（現(xiàn)配現(xiàn)用、盡快使用）。配置好100 μL的消化液，使鼠尾完全浸沒在消化液中，金屬浴55 ℃敷15 min；③滅活組織樣本中蛋白酶：進一步金屬浴95 ℃敷5 min，使蛋白酶K高溫下降解；④終止消化組織樣本：加入100 μL的Stop solution，渦旋混勻，即可得到基因組DNA 產(chǎn)物并測定DNA 產(chǎn)物濃度。（2）小鼠基因型鑒定。PCR反應體系（20 μL）：滅菌雙蒸水7.4 μL，基因組DNA 模板1.0 μL（200 ng/μL），引物NLRP6-F1 0.8 μL（10 μmol/L）、NLRP6-R1 0.8 μL（10 μmol/L），引物GAPDH-F 0.8 μL（10 μmol/L）、GAPDH-R 0.8 μL（10 μmol/L），Easy-LoadTM PCR Master Mix（Green，2×）10.0 μL。PCR 反應條件：起始變性94℃ 3 min；變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 50 s，循環(huán)30 次；最終延伸72 ℃ 10 min；保持4 ℃。（3）PCR產(chǎn)物鑒定。取PCR擴增后的DNA樣本10 uL，在2%瓊脂糖凝膠中以120V的電壓電泳30 min后在凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察，最后瓊脂糖凝膠上PCR 條帶顯示：NLRP6引物擴增產(chǎn)物長度為594 bp，NLRP6-/-小鼠在該位置無條帶表示小鼠為純合的NLRP6基因敲除小鼠，WT小鼠在該位置有條帶表示小鼠存在NLRP6基因。GAPDH引物擴增產(chǎn)物長度為299 bp。理論與實驗結果一致。

1.2.4 觀察小鼠生長情況

①經(jīng)基因鑒定確定NLRP6-/-小鼠為純合的基因敲除小鼠后，把NLRP6-/-雌鼠和雄鼠隨機按照2∶1方式合籠繁殖；②待NLRP6-/-雌鼠和雄鼠生產(chǎn)的幼鼠長至10 g左右，分別對其幼鼠進行雌雄分籠，并按SPF級標準飼養(yǎng)；③觀察和記錄NLRP6-/-雌鼠和雄鼠的性成熟期：雌鼠陰道口皮膚逐漸變薄，陰道口張開，愿意接觸雄鼠；雄鼠睪丸下降，體質量增加；④觀察和記錄NLRP6-/-雌鼠的妊娠期：將NLRP6-/-雌鼠和雄鼠合籠交配后，第2天檢查雌鼠是否有陰栓，如果有則發(fā)生了交配行為，之后每天觀察雌鼠的腹部情況。如果雌鼠腹部隆起時采用摸胎法，當摸到黃豆粒大小的胚胎則代表懷孕，一般小鼠孕后10～12 d 才可觸摸到胎兒；⑤觀察和記錄NLRP6-/-雌鼠的哺乳期：當幼鼠出生后體重達到10～13 g后可脫離哺乳期；⑥觀察WT雌鼠的性成熟期、妊娠期和哺乳期同上述①～⑤過程一致。同時，觀察WT雄鼠的性成熟期同上述①～③過程一致。

1.2.5 小鼠樣品解剖分離

①將8 周齡的NLRP6-/-雄鼠、WT雄鼠、NLRP6-/-雌鼠和WT雌鼠脫頸處死，剪開小鼠的胸腔和腹腔，解剖分離后背皮膚、脾、肝、心、腎、腦和小腿后肢肌肉組織；②用預冷的PBS沖洗上述實質器官兩次并用濾紙擦干水分；將上述實質器官擺放在有標尺的濾紙上拍照；③利用Image J軟件測量小鼠各器官的面積；④拍照完畢后，將上述實質器官置于4%多聚甲醛中固定保存，用于制作石蠟切片。

1.2.6 多組織蠟塊制備

①脫水：將上述固定的組織取出后使用乙醇脫水，具體過程按照75%乙醇12～24 h→90%乙醇12 h→95%乙醇4 h→100%乙醇2 h進行；②透明：經(jīng)過脫水處理的組織樣本放置于1∶1的比例混合的無水乙醇和二甲苯中浸泡20 min→二甲苯Ⅰ中浸泡15 min→二甲苯Ⅱ中浸泡15 min；③浸蠟與包埋：將經(jīng)過透明處理的組織樣本轉移至1∶1的比例混合的二甲苯和石蠟的溶液中浸泡30 min→純石蠟Ⅰ中浸泡2～3 h→純石蠟Ⅱ中2～3 h→石蠟完全凝固冷卻后可切片。

1.2.7 HE染色

①將包埋的小鼠后背皮膚、脾、肝、心、腎和腦實質器官蠟塊脫蠟切片，切片厚度為4 μm；②利用蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒進行染色：蘇木精13 min；自來水洗1 min；0.3% 鹽酸乙醇分化1 s；自來水洗1 min；高壓ddH2O洗20 min；伊紅 5 min；自來水洗1 min；95% 乙醇 20 s；無水乙醇3次，每次1 min；二甲苯 3次，每次3 min；中性樹膠封固。③利用顯微鏡采集分析觀察NLRP6基因敲除后對小鼠實質器官免疫炎性反應的影響。

1.2.8 Masson 染色

將包埋的小鼠后肢組織的脫蠟切片后，利用Masson染色試劑盒進行染色（A液是2.5%重鉻酸鉀媒染劑，B液與C液等體積混合后為Weigert鐵蘇木素染液，D液是麗春紅酸性品紅，E液是1%磷鉬酸溶液，F(xiàn)液是2.5%苯胺藍溶液）。將切片在Masson A液中室溫浸泡過夜；第2天將切片浸泡于Masson A液于65 ℃烤箱內孵育30 min，自來水洗30 s。同時將Masson D液及Masson F液放于65 ℃烤箱內預熱；將Masson B液與Masson C液等體積混合（現(xiàn)配現(xiàn)用），切片入混合液內浸染1 min，流水稍洗；切片經(jīng)1%鹽酸酒精分化1 min左右，至細胞核呈灰黑色，背景幾乎無色或淡灰色；自來水稍洗，稍稍瀝干切片上的多余水分，切片入Masson D液浸染6 min，此時組織呈現(xiàn)亮紅色，然后切片經(jīng)自來水流水沖洗20 s左右，至切片上流下的水為無色；切片稍微瀝干水分，入Masson E液浸泡約1 min后稍微瀝干，不經(jīng)水洗，直接入Masson F液染色，常規(guī)組織一般2～30 s；切片經(jīng)連續(xù)三缸1%冰醋酸水溶液漂洗分化，每缸7 s左右，第3缸1%冰醋酸水溶液漂洗時鏡檢，避免藍色過度分化；切片經(jīng)連續(xù)3 缸無水乙醇依次脫水約3 s、5 s、5 s。經(jīng)二甲苯透明5min，中性樹膠封片后，利用顯微鏡采集分析觀察NLRP6基因敲除后對小鼠后肢組織免疫炎性反應的影響。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，每組重復至少3次。所有數(shù)據(jù)采用Graph Pad Prism 8 軟件分析，多組間比較使用單因素方差分析，2 組間比較使用t 檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 NLRP6基因敲除小鼠的構建與基因型鑒定

由賽業(yè)（蘇州）生物科技有限公司運用CRISPR/Cas9技術構建NLRP6基因敲除小鼠。使用PCR技術鑒定NLRP6-/-鼠尾基因組DNA，結果顯示：NLRP6-/-小鼠在594 bp位置未出現(xiàn)條帶，表示該小鼠為純合的NLRP6基因敲除小鼠；WT小鼠在594 bp位置出現(xiàn)條帶，表示該小鼠存在NLRP6基因；GAPDH引物擴增產(chǎn)物長度為299 bp，NLRP6-/-小鼠和WT小鼠在該位置均有條帶，排除了提取的基因組DNA不穩(wěn)定導致的NLRP6-/-小鼠在594 bp無條帶（圖1）。以上結果提示NLRP6基因敲除小鼠構建成功。

2.2 NLRP6基因敲除小鼠的繁殖情況

將NLRP6-/-小鼠或WT小鼠分別進行合籠繁殖。觀察發(fā)現(xiàn)（表2）：WT雄鼠性成熟期為45～60 d；與WT雄鼠相比，NLRP6-/-雄鼠性成熟期明顯縮短，約為38～40 d。此外，在WT雌鼠和NLRP6-/-雌鼠中，性成熟期均為60 d左右；WT雌鼠妊娠期為22 d左右，NLRP6-/-雌鼠妊娠期為21 d左右；WT雌鼠和NLRP6-/-雌鼠的哺乳期均為21 d左右。WT雌鼠在性成熟期、妊娠期和哺乳期3個周期無明顯差異。

以上結果提示，NLRP6基因敲除主要縮短雄鼠的性成熟期，而對雌鼠的性成熟期、妊娠期和哺乳期無明顯影響。

2.3 NLRP6基因敲除小鼠的外形特征

NLRP6-/-新生1 d仔鼠與WT新生1 d仔鼠的皮膚均為粉嫩肉紅色，雙眼未睜，四肢軀干向腹側蜷縮，兩者無明顯差異（圖2A）。當小鼠生長至4周齡，NLRP6-/-雄鼠與WT雄鼠的被毛均為黑色，2 者無明顯差異。與此同時，4 周齡的NLRP6-/-雌鼠與WT雌鼠被毛均為黑色，兩者也無明顯差異（圖2B）。當小鼠生長至8周齡，與WT雄鼠相比，NLRP6-/-雄鼠后背皮膚可見明顯潰瘍和損傷，生殖器明顯受損并且后肢出現(xiàn)明顯萎縮（圖2C）。然而，在8周齡NLRP6-/-雌鼠與WT雌鼠的后背皮膚、生殖器和后肢中，兩者相比無明顯差異（圖2D）。此外，8周齡NLRP6-/-小鼠（雄性或雌性）和WT小鼠（雄性或雌性）在體質量上也無明顯差異（圖2E）。

綜上所述，在外形特征方面，敲除NLRP6基因主要損傷8周齡雄鼠的后背皮膚、生殖器以及后肢肌肉組織，而對8周齡雌鼠的后背皮膚、生殖器以及后肢肌肉組織無明顯影響。

2.4 NLRP6基因敲除對小鼠實質器官的影響

為了進一步分析NLRP6基因敲除對8周齡小鼠脾、肝、心、腎和腦等主要實質器官發(fā)育的影響，本研究將8周齡的NLRP6-/-雄鼠、WT雄鼠、NLRP6-/-雌鼠和WT雌鼠處死，解剖分離脾、肝、心、腎和腦并拍照記錄，利用Image J軟件測量其面積。結果顯示：與WT雄鼠相比，8周齡NLRP6-/-雄鼠的脾面積明顯增加（圖3A），但肝、心、腎和腦實質器官的面積無明顯變化（圖3B）。同時，在8周齡的NLRP6-/-雌鼠與WT雌鼠中，兩者的脾、肝、心、腎和腦實質器官面積均無明顯差異（圖4）。

綜上所述，NLRP6基因敲除顯著增加了8周齡NLRP6-/-雄鼠的脾面積，但對肝、心、腎和腦主要實質器官面積無明顯影響。此外，NLRP6基因敲除對8周齡NLRP6-/-雌鼠脾、肝、心、腎和腦主要實質器官面積均無明顯影響。

2.5 NLRP6基因敲除對小鼠組織器官免疫炎性反應的影響

使用HE染色或Masson染色評估NLRP6敲除對8周齡小鼠后背皮膚、脾、肝、心、腎、腦和后肢組織免疫炎性反應的影響。HE染色結果顯示：與WT雄鼠相比，NLRP6-/-雄鼠后背皮膚出現(xiàn)膠原纖維增生和炎性細胞浸潤（圖5A），脾出現(xiàn)炎性細胞浸潤和淋巴造血組織異常（圖5B），肝出現(xiàn)細胞變性、雙核肝細胞增多和匯管區(qū)炎性細胞浸潤（圖5C），但心、腎、腦實質器官組織均未觀察到免疫炎性反應發(fā)生。（圖5D～F）。Masson染色結果顯示：與WT雄鼠相比，NLRP6-/-雄鼠后肢組織橫紋肌斷裂（圖5G）。同時，收集8 周齡的NLRP6-/-雌鼠或WT雌鼠的后背皮膚、脾、肝、心、腎、腦和后肢組織并進行HE和Masson染色。結果顯示，在NLRP6-/-雌鼠和WT雌鼠中，兩者的后背皮膚、脾、肝、心、腎、腦和后肢組織均未觀察到炎性細胞浸潤，免疫炎性反應不明顯（圖6）。

以上結果提示，NLRP6基因敲除導致8周齡雄鼠的后背皮膚、脾、肝和后肢組織均出現(xiàn)免疫炎性反應，而對心、腎、腦實質器官的免疫炎性反應無明顯影響。同時，NLRP6基因敲除對8周齡雌鼠的后背皮膚、脾、肝、心、腎、腦和后肢組織的免疫炎性細胞的浸潤、形態(tài)改變等免疫炎性反應均無明顯影響。

3 討 論

作為新發(fā)現(xiàn)的NLRs家族成員，NLRP6能夠以炎性小體依賴性方式或非炎性小體依賴性方式調節(jié)炎癥免疫反應：一方面，NLRP6 通過其N 端的PYD結構域的同源蛋白連接與ASC蛋白相結合，進而通過ASC 的CARD 結構域募集caspsae-1 或cas?pase-11，最終組裝形成NLRP6炎性小體，進而誘導生成具有生物活性的IL-1β和IL-18，調節(jié)炎癥免疫反應[13-14]；另一方面，NLRP6能夠調控MAPK/ERK信號通路、NF-κB 轉錄活性或Ⅰ/Ⅲ型干擾素信號途徑，以與炎癥小體無關的方式對炎癥免疫反應發(fā)揮調節(jié)作用[6，10，15] 。除了在炎癥免疫反應中的調節(jié)作用外，NLRP6近年來也被報道在焦亡、自噬和蛋白降解等生物過程中發(fā)揮調節(jié)作用。例如，在神經(jīng)細胞中，本科研組實驗證實NLRP6能夠誘導GSDMD的裂解，促進細胞焦亡[16]。在腸上皮細胞中，NLRP6直接與Ulk1，Beclin-1，LC3B和p62等多種自噬相關蛋白結合，直接促進自噬活性[17]。在胃癌細胞中，NLRP6上調GRP78的泛素化水平，增強GRP78的蛋白酶體降解活性[18]?？偟膩碚f，NLRP6在炎癥、焦亡、自噬和蛋白降解等多種生物過程發(fā)揮著廣泛的調節(jié)作用。

由于NLRP6在腸道、肝、心、脾、腎和腦等實質器官中具有較高的表達豐度，目前有關NLRP6的研究主要集中在疾病狀態(tài)下實質器官的功能調節(jié)。例如，在革蘭氏陽性菌（如李斯特菌和金黃色葡萄球菌）感染的小鼠腸道中，NLRP6直接結合革蘭氏陽性菌的脂壁酸，誘導NLRP6炎性小體的組裝和活化，促進依賴于caspase-11的IL-18的產(chǎn)生，最終加劇革蘭氏陽性菌感染并降低小鼠存活率，這表明NLRP6對宿主的腸道防御免疫反應具有負性調控作用[19]。在非酒精性肝炎中，NLRP6的敲除不僅促進Cd36介導的脂質攝取、加重肝臟的脂質代謝失調和肝細胞脂肪變性，還通過增強NF-κB的轉錄活性上調促炎細胞因子TNF-α和IL-1β的表達，加重肝臟炎癥反應和纖維化，最終加重肝組織損傷，這表明NLRP6對非酒精性肝炎具有保護作用[20]。在急性腎損傷中，敲除NLRP6 能夠上調ERK1/2 和p38MAPK的磷酸化水平，促進趨化因子的表達和免疫細胞（如巨噬細胞與中性粒細胞）的浸潤，增強炎癥反應，加重腎細胞死亡和腎組織纖維化，最終導致腎功能損傷和血清肌酐與尿素水平的升高，這表明NLRP6 對急性腎損傷具有保護作用[11]。不同于NLRP6在肝臟和腎臟中的保護作用，NLRP6在本課題組前期研究中被證實對缺血性腦卒中具有損害作用。在腦缺血后，NLRP6以炎性小體依賴性方式不僅促進炎癥因子IL-1β和IL-18的成熟與分泌、增強神經(jīng)炎癥反應，還誘導GSDMD的裂解、促進細胞焦亡，最終導致腦梗死體積的增大、神經(jīng)功能缺損評分的增加和腦組織形態(tài)損傷的加重[16，21-22]。由此可見，NLRP6對疾病狀態(tài)下多種實質器官的功能均具有顯著的調節(jié)作用。然而，在自然生長發(fā)育狀態(tài)下，NLRP6對組織器官的影響尚未可知。在本實驗中，通過飼養(yǎng)并繁殖野生型和NLRP6-/-型小鼠，在自然生長發(fā)育狀態(tài)下分析NLRP6基因型對小鼠的睪丸、脾、肝、心、腎和腦等主要實質器官及皮膚毛發(fā)等組織的影響。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP6基因敲除主要縮短了雄鼠的性成熟周期、使成年雄鼠的睪丸發(fā)生不可逆的破潰與萎縮，但對雌鼠的性成熟期、妊娠期、哺乳期和卵巢生長發(fā)育無明顯影響。在四肢發(fā)育上，NLRP6的基因敲除誘導成年雄鼠后肢橫紋肌斷裂，導致后肢出現(xiàn)明顯萎縮，但對雌鼠的后肢生長和組織結構無明顯影響。在脾臟的生長發(fā)育上，NLRP6的基因敲除不僅顯著增加了雄鼠的脾臟體積還誘導雄鼠脾臟出現(xiàn)炎性細胞浸潤和淋巴造血組織異常。然而，NLRP6基因敲除對雌鼠的脾臟體積和免疫炎癥反應未產(chǎn)生明顯影響。在后背皮膚上，NLRP6基因敲除引發(fā)雄鼠后背皮膚出現(xiàn)明顯的潰瘍損傷、膠原纖維增生和炎性細胞浸潤，但對雌鼠后背皮膚的完整性和免疫炎癥反應無明顯影響。除此之外，本研究還分析了NLRP6基因型對其他實質器官（如心、肝、腎和腦）生長發(fā)育和組織結構的影響。結果顯示，在自然生長發(fā)育狀態(tài)下，NLRP6的基因型對小鼠（包括雄性和雌性）的心、肝、腎、腦實質器官和毛發(fā)生長均無顯著影響。由此可見，NLRP6不僅在疾病狀態(tài)下實質器官的功能調節(jié)中發(fā)揮作用，還對組織器官的生長發(fā)育具有重要影響。

如前所述，在自然生長狀態(tài)下，NLRP6基因敲除選擇性影響雄鼠的生殖器發(fā)育與性成熟期、后肢肌肉發(fā)育、脾臟大小及其炎癥免疫反應，以及后背皮膚的組織結構及其炎癥免疫反應。而且，這一作用具有明確的性別依賴性，即NLRP6基因敲除對自然狀態(tài)下雌鼠的生殖器、后肢肌肉、脾臟及后背皮膚均無明顯影響。雌激素是維持雌性動物第二性征發(fā)育的關鍵激素，近年來還被報道在心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等疾病中發(fā)揮保護作用。例如，在心肌梗死中，雌激素受體β（ERβ）通過上調SERCA2a的表達活性增加肌漿網(wǎng)中鈣離子的攝取與吸收，加速心臟舒張，減少心臟破裂和心室不良重塑，降低小鼠心肌梗死后的死亡率[23]。NLRP6是近年來新發(fā)現(xiàn)的模式識別受體家族成員，其與雌激素之間的分子相關性已被報道。例如，在結腸炎疾病中，雌激素受體β（ERβ）通過直接結合NLRP6基因啟動子的雌激素反應元件促進NLRP6的基因表達，進而上調ASC、caspase-1、IL-1β和TNF-α的表達水平，促進炎癥細胞浸潤和黏膜損傷，最終加劇小鼠結腸炎癥[17]。這表明雌激素與NLRP6具有密切的分子相關性，兩者在抑制結腸炎的病情進展中發(fā)揮重要作用。本實驗首次證實NLRP6基因敲除選擇性影響雄鼠的實質器官生長繁育，而對雌鼠的實質器官生長繁育無明顯影響?？紤]到這一表型的性別差異以及雌激素的保護作用，推斷雌激素能夠阻斷NLRP6基因敲除對小鼠實質器官生長繁育的影響，但其具體作用和分子機制還有待于進一步研究。

參 考 文 獻

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基金項目：國家自然科學基金資助項目（編號：8207051351）；國家自然科學基金青年基金資助項目（編號：82302474）；重慶市博士后科學基金資助項目（編號：CSTB2022NSCQ-BHX0629）。