【摘 要】目的：前瞻性研究妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）與正常產(chǎn)婦初乳菌群的豐度以及對其多樣性進(jìn)行評估分析。方法：選取符合納入標(biāo)準(zhǔn)的30例GDM產(chǎn)婦作為實(shí)驗(yàn)組，30例健康產(chǎn)婦作為對照組，分娩方式均為剖宮產(chǎn)。從所有受試者乳汁標(biāo)本中分離獲得DNA，在Illumina MiSeq平臺進(jìn)行16s rRNA基因V3～V4區(qū)擴(kuò)增子高通量測序。結(jié)果：正常組與GDM組之間評估菌群的豐度指數(shù)的Ace指數(shù)有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.039）。2組研究對象的菌群在除Ace指數(shù)外的Alpha多樣性上無差異，但在Beta多樣性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001）。GDM產(chǎn)婦母乳中厚壁菌門和變形菌門、鏈球菌科和孿生球菌科、鏈球菌屬和羅斯氏菌屬的相對豐度平均值均低于對照組，而放線菌門、葡萄球菌科、葡萄球菌屬的相對豐度平均值較對照組水平更高。結(jié)論：GDM產(chǎn)婦與健康產(chǎn)婦初乳菌群的豐度以及多樣性均有差異，GDM母乳中厚壁菌門以及變形菌門相對豐度的減少，可能對其子代早期腸道菌群的建立及早期的生長發(fā)育產(chǎn)生影響。定量母乳菌群的構(gòu)成對該人群及其子代有特殊意義。

【關(guān)鍵詞】妊娠期糖尿??；母乳微生物；16S核糖體RNA

【中圖分類號】R714.7 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2023-12-28

妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM），定義為妊娠期發(fā)病或首次識別的高血糖，低于2型糖尿病的診斷閾值[1]，其患病率正在增加，影響全球5%～18%的妊娠，這是由育齡婦女肥胖負(fù)擔(dān)增加引起的[2-3]。人類菌群及其衍生物在妊娠期代謝性疾病的發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[4]。新生兒腸道菌群的定植可能是在子宮內(nèi)妊娠期開始的，許多因素都是新生兒微生物生態(tài)學(xué)的影響因素[5]。這些因素包括：妊娠期（足月或早產(chǎn)），分娩方式（陰道分娩或剖宮產(chǎn)），母體營養(yǎng)，免疫狀態(tài)，母親的乳房皮膚和母乳，特別是母乳喂養(yǎng)嬰兒。母乳被認(rèn)為是嬰兒的最佳營養(yǎng)，提供必需營養(yǎng)和廣泛的生物活性化合物，并支持腸道微生物群的定植，這有利于嬰兒的生長發(fā)育[6]。母體菌群不僅影響嬰兒在圍產(chǎn)期的發(fā)育，還可以通過母乳進(jìn)行轉(zhuǎn)移，母乳是嬰兒出生后唯一推薦的食物來源，從而有助于嬰兒早期腸道菌群的建立和嬰兒免疫系統(tǒng)的發(fā)育[7]。同時，母乳被認(rèn)為是新生兒建立健康微生物組的主要來源[8]。由此可知，母乳和新生兒的菌群之間存在著復(fù)雜的相互作用。然而，目前關(guān)于GDM產(chǎn)婦初乳菌群的研究缺乏。本研究前瞻性對30例GDM及30例健康產(chǎn)婦的母乳進(jìn)行檢測，分析菌群在GDM產(chǎn)婦分娩后初乳中的分布情況，以期為GDM產(chǎn)婦子代發(fā)育的預(yù)防和治療提供一定參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2021年4月至2022年4月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科足月剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦80例，均簽署知情同意書。本研究獲得重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（審批號：2023-94）。將符合納排標(biāo)準(zhǔn)的患者分為妊娠期糖尿病組和正常組。

1.2 納排標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①自愿參加本研究；②年齡20～45歲；③單胎足月妊娠；④孕前孕期無內(nèi)分泌代謝疾?。ㄈ缂诇p，甲亢，多囊卵巢綜合征，妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥等）、高脂血癥、高血壓等心血管疾病以及自身免疫相關(guān)疾病，且無上述疾病家族遺傳病史；⑤僅合并妊娠期糖尿病（孕中期葡萄糖耐量試驗(yàn)兩項(xiàng)及以上異常）；⑥重慶市區(qū)城鎮(zhèn)孕婦。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往乳房手術(shù)史（n=5）；②人工喂養(yǎng)（n=5）；③乳腺炎（n=10）；④曾患乳房疾病以及有相關(guān)家族遺傳病史（n=0）；⑤孕前肥胖，即孕前體質(zhì)指數(shù)gt;30 kg/m2；⑥吸煙（n=0）。最終有60例產(chǎn)婦作為本次研究對象，納排流程，見圖1。

1.3 方法

1.3.1 資料收集

面對面收集研究對象的基本信息，包括乳母年齡、孕前體質(zhì)量、孕期體質(zhì)量增量、孕期體質(zhì)量、孕次產(chǎn)次、孕期75 g口服葡萄糖耐量試驗(yàn)結(jié)果（mmol/L）、孕期血壓、新生兒胎齡、性別、出生身長和體質(zhì)量。

1.3.2 樣本收集

于產(chǎn)后7 d內(nèi)收集乳母乳汁，所有標(biāo)本均在上午9：00-11：00采集，由醫(yī)院專業(yè)醫(yī)務(wù)人員在無菌生理鹽水清洗乳頭后用手?jǐn)D法采集單側(cè)乳房部分乳汁入15 mL聚丙烯無菌管中，乳汁量為5～10 mL，用干冰低溫保存將樣品運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，使用渦旋振蕩器混勻后分別分裝于2 mL無菌冷凍管中，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.3.3 乳汁菌群分析

將乳汁樣本中提取的DNA，在Illu?mina MiSeq平臺進(jìn)行16s rRNA基因V3-V4區(qū)擴(kuò)增子高通量測序。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0和R 4.3.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。經(jīng)正態(tài)性分布和方差齊性檢驗(yàn)后，計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)），即Md（P25，P75）表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)，計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。采用4個指標(biāo)，包括Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)計算兩組乳汁菌群的Alpha 多樣性，并使用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)進(jìn)行差異檢驗(yàn)。Beta多樣性基于未加權(quán)的Unifrac距離，使用Qiime 1.9.1 軟件進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal co-ordinatesanalysis，PCoA），配合使用置換多元方差分析（permutationalmultivariate analysis of variance，PERMANOVA）（999次）進(jìn)行統(tǒng)計檢驗(yàn)，此分析利用R軟件包“vegan”，并使用ggplot2程序包繪圖。使用線性判別分析軟件（linear discriminant analysiseffect size，LEfSe）基于線性判別式分析結(jié)果（linear discrimi?nant analysis，LDA）gt;3.0和Plt;0.05的標(biāo)準(zhǔn)分析2組之間存在明顯差異的微生物，并繪制物種聚類樹圖。使用R軟件中mean函數(shù)，分別計算出2組中各個微生物在門水平、科水平、屬水平的平均相對豐度。

2 結(jié) 果

2.1 孕婦及新生兒一般資料

本研究共納入60例計劃性剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦，其中妊娠期糖尿病組產(chǎn)婦30例，正常組產(chǎn)婦30例。計量資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示，2組產(chǎn)婦在孕前體質(zhì)指數(shù)、孕期增重、空腹血糖、餐后1 h血糖、餐后2 h血糖間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），2組在年齡、孕期體質(zhì)指數(shù)、孕次、產(chǎn)次、收縮壓、舒張壓、孕周、新生兒出生身長、新生兒出生體質(zhì)量間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示，2組新生兒性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.2 產(chǎn)婦乳汁微生物數(shù)據(jù)

將乳汁樣本中提取的DNA，在Illumina MiSeq平臺進(jìn)行16s rRNA基因V3～V4區(qū)擴(kuò)增子高通量測序。運(yùn)用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析2組乳汁菌群的Alpha多樣性（表2），結(jié)果顯示，正常組與妊娠期糖尿病組之間評估菌群的豐度指數(shù)的Ace指數(shù)有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.039）。運(yùn)用置換多元方差分析分別對2組菌群的Beta多樣性（PCoA）進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，正常組和妊娠期糖尿病組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001），如圖2所示，可以看出以藍(lán)色標(biāo)注點(diǎn)為中心展開的對照組，整體分布上以紅色標(biāo)注點(diǎn)為中心展開的妊娠期糖尿病組組間存在明顯的分離趨勢。LEfSe分析2組之間差異菌，結(jié)果顯示，正常組和妊娠期糖尿病組之間的菌群存在顯著差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），見圖3。Lefse 分析篩選LDA值gt;3的組間差異物種，結(jié)果顯示，正常組中，標(biāo)志性富集的微生物為變形菌門、擬桿菌門、擬桿菌綱、鞘脂桿菌綱、β-變形菌綱、擬桿菌目、鞘脂桿菌目、伯克氏菌目、奈瑟菌目、假單胞菌目、普雷沃氏菌科、鞘脂桿菌科、產(chǎn)堿桿菌科、奈瑟氏球菌科、假單胞菌科、普雷沃氏菌屬、土地桿菌屬、無色桿菌屬、奈瑟菌屬、假單胞菌屬。GDM組中，標(biāo)志性富集的微生物為孿生菌目、紅螺菌目、毛螺菌科、伯克氏菌科、鏈球菌屬、布勞特氏菌屬、韋榮氏菌屬、伯克霍爾德菌屬、不動桿菌屬。

2.3 產(chǎn)婦乳汁在門、科和屬水平上的微生物變化

通過16s rRNA測序在門、科和屬水平上確定產(chǎn)婦乳汁的微生物組成。在門水平上，厚壁菌門在正常組和妊娠期糖尿病組中分別占比72.19%和70.3%。變形菌門在正常組和妊娠期糖尿病組中分別占比25.2%和22.14%。放線菌門在正常組和妊娠期糖尿病組中相對豐度分別為2.5% 和6.87%，見圖4。

在科水平上，相對豐度前5名的微生物為鏈球菌、葡萄球菌、孿生球菌、微球菌和奈瑟菌。相比于正常組（44.66%），鏈球菌在妊娠期糖尿病組中的相對豐度減少為40.48%。而妊娠期糖尿病組中葡萄球菌（37.29%）比正常組（26.27%）豐度更高。孿生球菌在正常組和妊娠期糖尿病組中相對豐度分別為5.91%和3.5%，見圖5。

在屬水平上，相對豐度前5名的微生物為鏈球菌、葡萄球菌、羅斯氏菌、棒狀桿菌和奈瑟菌。相比于正常組（44.64%），鏈球菌在妊娠期糖尿病組中的相對豐度減少為40.45%。而妊娠期糖尿病組中葡萄球菌（37.39%）比正常組（26.27%）相對豐度更高。羅斯氏菌在正常組和妊娠期糖尿病組中相對豐度分別為5.76%和3.47%，見圖6。

3 討 論

GDM在我國的流行病學(xué)調(diào)查顯示，其發(fā)病率為1.7％～16.7％[9]。既往臨床研究顯示，妊娠期糖尿病會增加產(chǎn)婦及子代后期患2型糖尿病及肥胖的風(fēng)險，嚴(yán)重影響產(chǎn)婦及子代的生活質(zhì)量[10]。母乳是嬰兒的最佳天然食物，其中含有較多可以促進(jìn)嬰兒成長的活性物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、母乳寡糖、脂類、免疫因子、激素等[11]。母乳也是嬰兒腸道共生和有益細(xì)菌的源泉，這些菌群可以通過哺乳進(jìn)而種植到嬰兒腸道，從而在嬰兒腸道菌群和免疫系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[12]。除此以外，母乳喂養(yǎng)還能有效預(yù)防子代后期肥胖癥的發(fā)生。1項(xiàng)涵蓋3 261例中國嬰兒的大隊(duì)列調(diào)查研究指出，與配方奶粉喂養(yǎng)兒相比，純母乳喂養(yǎng)組兒童在青年時期，擁有更低水平的膽固醇含量，進(jìn)而發(fā)生肥胖的風(fēng)險更低[13]。正是由于目前正常產(chǎn)婦和GDM產(chǎn)婦初乳菌群的差異尚未明確，所以本研究分析正常產(chǎn)婦和GDM產(chǎn)婦初乳菌群的特征性并預(yù)測其代謝功能，進(jìn)而探索母乳中的益生菌及其子代中“健康，核心”的腸道菌群，為GDM子代腸道健康提供切實(shí)有效的指導(dǎo)建議。并通過分析子代腸道菌群建立的影響因素，從GDM母嬰個體本身出發(fā)，進(jìn)行適時調(diào)控和干預(yù)，從而使其子代腸道菌群得到進(jìn)一步優(yōu)化。

相關(guān)研究報道，嬰兒出生時初期腸道菌群的建立主要來自于妊娠期母體子宮內(nèi)、分娩時母體產(chǎn)道和會陰部[14]，母乳中菌群構(gòu)成存在明顯個體差異，且分娩方式會影響母乳中較多營養(yǎng)素的濃度[15]。因此本研究中納入對象均為剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦。剖宮產(chǎn)新生兒的腸道菌群定植速度較慢，缺少一些有益菌，例如雙歧桿菌等厭氧菌相對豐度較低[16]，這與本研究的結(jié)果一致。針對母乳菌群特點(diǎn)，由本研究結(jié)論可知，鏈球菌屬，葡萄球菌屬，羅斯氏菌屬和棒桿菌屬組成了母乳菌群的主要部分。既往的研究表明，葡萄球菌和鏈球菌是不同國家和地區(qū)來源的母乳中的優(yōu)勢菌屬[17]。在對皮膚進(jìn)行消毒后采集的母乳樣品中，可培養(yǎng)細(xì)菌通常以葡萄球菌（主要是表皮葡萄球菌和其他革蘭氏陰性菌）、鏈球菌（主要是米氏鏈球菌）和唾液鏈球菌、棒狀桿菌、丙酸桿菌和其他分類上相關(guān)的革蘭氏陽性細(xì)菌為主[18]。進(jìn)一步證實(shí)鏈球菌屬和葡萄球菌屬在剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦的母乳中占據(jù)優(yōu)勢地位。

本研究顯示，GDM產(chǎn)婦的母乳中厚壁菌門的豐度低于正常產(chǎn)婦。1項(xiàng)研究顯示GDM產(chǎn)婦產(chǎn)后仍存在胰島素抵抗，腸道菌群異?？沙掷m(xù)存在，表現(xiàn)為可降解黏液蛋白的普雷沃氏菌科比例增高，而厚壁菌門豐度降低[19]。厚壁菌門和擬桿菌門通過產(chǎn)生丁酸調(diào)節(jié)胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）和肽酪氨酸的分泌來介導(dǎo)胰島素抵抗[20]。GLP-1在體重減輕、葡萄糖穩(wěn)態(tài)和營養(yǎng)代謝中發(fā)揮重要作用[21]。這就在分子機(jī)制上證明，厚壁菌門在GDM疾病預(yù)防以及治療中均發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。同時GDM產(chǎn)婦的母乳中放線菌門的豐度也低于正常產(chǎn)婦。放線菌門主要為革蘭氏陰性菌，這類菌群的細(xì)胞外膜是由脂多糖所構(gòu)成的，脂多糖屬于構(gòu)成細(xì)胞壁的重要成分，能夠?qū)ρ装Y反應(yīng)產(chǎn)生刺激作用，如果腸道菌群的平衡性受到破壞，則脂多糖可進(jìn)入人體循環(huán)中，進(jìn)而誘發(fā)胰島素抵抗[22]。而母乳和母乳菌群又是嬰兒早期腸道菌群建立和生長發(fā)育的重要影響因素。在新生兒出生后，母乳菌群決定嬰兒腸道定植微生物的多樣性和種類。隨著母乳中的微生物進(jìn)入嬰兒腸道后并開始定植，進(jìn)而促進(jìn)腸道相關(guān)淋巴組織成熟、穩(wěn)定腸道上皮內(nèi)環(huán)境。研究表明，葡萄球菌屬可能參與病原體的競爭排斥，母乳提供給嬰兒腸道的共生葡萄球菌菌株可能成功地與潛在的有害菌株競爭[23]。本研究中GDM產(chǎn)婦乳汁中的葡萄球菌屬比正常產(chǎn)婦豐度更高，這可能與母乳菌群在預(yù)防新生兒感染方面相關(guān)，GDM產(chǎn)婦乳汁中可能需要提供更多的葡萄球菌屬來參與病原體的競爭排斥，從而降低新生兒因外界環(huán)境發(fā)生的感染。

一方面，臨床指南指出，妊娠期糖尿病產(chǎn)婦除加強(qiáng)運(yùn)動和飲食控制外，母乳喂養(yǎng)也成為了其控制血糖的一種方式。同時母乳喂養(yǎng)更是預(yù)防產(chǎn)婦后期發(fā)展成為慢性2 型糖尿病的重要生活干預(yù)方式[24]。母乳喂養(yǎng)通過增強(qiáng)與免疫和代謝活動相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，從而使人體獲益，其不僅降低新生兒早期死亡和患病的風(fēng)險，還對其子代在成年后的健康帶來益處。另一方面，既往研究顯示，持續(xù)母乳喂養(yǎng)至少8個月與GDM產(chǎn)婦子代的平均血糖水平降低有關(guān)[25]，這表明，母乳喂養(yǎng)可以有效降低GDM產(chǎn)婦子代罹患肥胖的風(fēng)險，并降低其遠(yuǎn)期罹患糖尿病的風(fēng)險。

綜上所述，本研究中GDM產(chǎn)婦乳汁菌群構(gòu)成的明顯改變，可能導(dǎo)致其子代腸道菌群的紊亂，從而影響嬰兒的生長發(fā)育。厚壁菌門豐度的降低可能是GDM產(chǎn)婦乳汁菌群改變的關(guān)鍵因素之一，同時，放線菌門在GDM產(chǎn)婦乳汁中豐度的下降，導(dǎo)致對炎癥反應(yīng)產(chǎn)生刺激作用可能會進(jìn)而誘發(fā)胰島素抵抗。本研究發(fā)現(xiàn)GDM產(chǎn)婦相對于正常產(chǎn)婦乳汁中菌群的一些特異性變化，為前瞻性觀察GDM產(chǎn)婦乳汁菌群的變化對其子代的腸道菌群建立及子代遠(yuǎn)期的生長發(fā)育拓展了視野。因此多中心、大樣本的研究是非常有意義的，同時母乳菌群變化對子代腸道菌群及其生長發(fā)育的影響還需進(jìn)一步探索。GDM產(chǎn)婦也應(yīng)注意飲食均衡和保持平衡的腸道微生態(tài)，以期降低子代罹患肥胖及糖尿病的風(fēng)險。

參 考 文 獻(xiàn)

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（責(zé)任編輯：周一青）