【關(guān)鍵詞】β-catenin；Survivin；RNAi；肺癌耐藥；補(bǔ)中益氣湯

肺癌發(fā)病率和死亡率排世界首位，其中約三分之一的新發(fā)病例和死亡病例來(lái)自中國(guó)[1]。目前，以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是晚期肺癌患者的最佳治療方案，而化療耐藥極大地降低治療的成功率，因此全面了解肺癌化療耐藥是亟待解決的問(wèn)題[2]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，干擾糖原合成酶激酶-3β（glycogensynthase kinase-3β，GSK3β）可以活化Wnt/β-catenin信號(hào)通路，在Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活的情況下，使用補(bǔ)中益氣湯干預(yù)A549/DDP細(xì)胞仍可以改善A549/DDP細(xì)胞順鉑耐藥[3]。因此，推測(cè)補(bǔ)中益氣湯可以抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路改善A549/DDP細(xì)胞順鉑耐藥，即補(bǔ)中益氣湯具有沉默連環(huán)蛋白β1（β-catenin）的同等效應(yīng)。本研究利用siRNA技術(shù)干擾β-catenin，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，檢測(cè)A549/DDP細(xì)胞的Survivin表達(dá)、順鉑IC50及順鉑誘導(dǎo)的總凋亡率，探討補(bǔ)中益氣湯含藥血清和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Siβ-catenin在抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路改善肺腺癌順鉑耐藥性方面是否具有協(xié)同效應(yīng)，證實(shí)補(bǔ)中益氣湯具有siβ-catenin瞬時(shí)轉(zhuǎn)染樣效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞株 SPF級(jí)SD大鼠，供自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（合格證號(hào)SCXK（遼）2020-0001），已獲得遼寧中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與動(dòng)物倫理審查委員會(huì)審查批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：210726221100791635），體質(zhì)量170～210 g。A549/DDP細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科院腫瘤研究中心細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要試劑 本實(shí)驗(yàn)中所用siRNA采購(gòu)于吉瑪基因公司；LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑（產(chǎn)品批號(hào)：11668）供自invitrogen公司（美國(guó)）；β-catenin一抗、全蛋白提取試劑盒、Survivin一抗、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒以及ECL發(fā)光液、β-actin 一抗、AnnexinV-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（產(chǎn)品批號(hào)：WL01456、WLA001c、WLA003、WL01684、WL0961a、WLA019、WL0002、WLA020）均供自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司；RIPA裂解液、羊抗兔IgG-HRP以及胰酶（產(chǎn)品批號(hào)：P0013B、A0208、C0203）、均供于碧云天生物科技有限公司；順鉑（產(chǎn)品批號(hào)：MB1055）購(gòu)于大連美侖生物技術(shù)有限公司；DMSO以及MTT檢測(cè)試劑盒（產(chǎn)品批號(hào)：M-2128、D-5879）均購(gòu)于Sigma公司（美國(guó)）；胎牛血清（產(chǎn)品批號(hào)：SH30084.03）Hyclone公司（美國(guó)）產(chǎn)品；PBS（產(chǎn)品批號(hào)：P10033）由雙螺旋公司生產(chǎn)。

1.1.3 含藥血清的制備 根據(jù)最新全國(guó)高等中醫(yī)藥院校規(guī)劃教材《方劑學(xué)》（第十版），補(bǔ)中益氣湯配方及用量為：黃芪18 g（根部，貨號(hào)2111251，產(chǎn)地甘肅），甘草片9 g（根莖，貨號(hào)2102261，產(chǎn)地內(nèi)蒙古），人參片6 g（根部，貨號(hào)2111091，產(chǎn)地吉林），當(dāng)歸3 g（根部，貨號(hào)2201072，產(chǎn)地甘肅），橘皮6 g（干燥成熟果皮，貨號(hào)2111203，產(chǎn)地浙江），升麻6 g（根莖，貨號(hào)2011091，產(chǎn)地黑龍江），北柴胡6 g（根部，貨號(hào)2110093，產(chǎn)地陜西），白術(shù)9 g（根莖，貨號(hào)2110122，產(chǎn)地安徽），藥材購(gòu)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房，產(chǎn)自安徽普仁中藥飲片公司，并由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室鑒定均為正品，本次實(shí)驗(yàn)沿用課題組前期實(shí)驗(yàn)補(bǔ)中益氣湯的處方劑量[3-5]，計(jì)算出大鼠的等效劑量，實(shí)驗(yàn)大鼠給予灌胃處理，每日1次（1.314 g/mL，2 mL），持續(xù)7 d，末次灌胃處理1 h后腹主動(dòng)脈取血，制備補(bǔ)中益氣湯含藥血清備用，放置在無(wú)菌管中，隨后在37 ℃水浴環(huán)境下靜置時(shí)長(zhǎng)30 min，低速離心10 min后取上清液，再重復(fù)離心2次，56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm濾器濾過(guò)除菌，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 鏡下觀察A549/DDP 細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到80%，將培養(yǎng)液棄用，使用0.25%濃度胰酶1 mL，將細(xì)胞消化2 min 左右，顯微鏡下觀察到細(xì)胞形態(tài)卷縮變圓后，加入2 mL培養(yǎng)基終止消化。在培養(yǎng)瓶中加入5 mL 10%濃度的含有胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞吹打均勻。隨機(jī)分裝入新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)傳代培養(yǎng)。將所需的A549/DDP細(xì)胞隨機(jī)分組，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 siRNA干擾 按常規(guī)方法在6孔板之中（3×105個(gè)/孔）接種細(xì)胞，過(guò)24 h進(jìn)行轉(zhuǎn)染，保證細(xì)胞密度在轉(zhuǎn)染時(shí)占50%～80%，轉(zhuǎn)染后DDP（20 μmol/L）處理48 h。將β-catenin siRNA和陰性對(duì)照siRNA 經(jīng)LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)入A549/DDP 細(xì)胞中。隨機(jī)分5 組：正常血清組、順鉑組、siCTNNB1-235組、siCTNNB1-510組、siCTNNB1-547組。參照siRNA 的設(shè)計(jì)原則，CTNNB1-235 的干擾序列正義鏈為5’-GUAGCUGAUAUUGAUGGACTT-3’，反義鏈為5’-GUCCAUCAAUAUCAGCUACTT-3’；CTNNB1-510的干擾序列正義鏈為5’-GGCUGCAGUUAUGGUCCAUTT-3’，反義鏈為5’-CUUAGAUGGACCAUAACUGCAGCCTT-3’；CTNNB1-547的干擾序列正義鏈為5’-GCUUCCAGACACGCUAUCATT-3’，反義鏈為5’-UGAUAGCGUGUCUGGAAGCTT-3’。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 將β-catenin 表達(dá)受抑后的A549/DDP 細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)所需的補(bǔ)中益氣湯含藥血清按上述操作制備，實(shí)驗(yàn)中所需順鉑的藥物濃度為20 μmol/L，隨機(jī)分6 組：A549/DDP+正常SD 大鼠血清組（10% 正常血清處理）、A549/DDP 細(xì)胞+siCTNNB1+正常SD大鼠血清組、A549/DDP細(xì)胞+含藥血清組、A549/DDP細(xì)胞+siCTNNB1+順鉑+正常SD 大鼠血清組（20 μmol/L 順鉑與10%正常血清共同處理）、A549/DDP細(xì)胞+順鉑+siCTNNB1+含藥血清組（20 μmol/L順鉑與10%補(bǔ)中益氣湯含藥血清共同處理）、A549/DDP細(xì)胞+siCTNNB1+含藥血清組。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)β-catenin 干擾后蛋白表達(dá)量 將A549/DDP 細(xì)胞收集至潔凈EP 管中，用RIPA 裂解液（0.1%SDS；1% NP40；0.1 mmol/L PMSF；1×PBS）于冰上裂解30 min，BCA法測(cè)定蛋白濃度，配置分離膠并將其灌入玻璃板下2/3的位置，再將濃縮膠灌入玻璃板上1/3的位置，待濃縮膠凝固后將梳子拔掉，并加樣，電泳后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，配置5%的脫脂奶粉，將膜封閉處理，并放在脫色搖床上搖動(dòng)2 h，TBST洗膜3次，每次5 min，一抗（將Survivin、β-catenin稀釋至1∶500 濃度），4 ℃冰箱冷藏下孵育過(guò)夜，用TBST 洗膜5 min，洗3次，二抗（羊抗兔IgG-HRP按照1∶5 000濃度比例稀釋）室溫狀態(tài)下溫浴2 h，在暗室用DAB試劑盒顯色試劑發(fā)光，將膠片掃描或拍照，得到目標(biāo)圖像。得到目的蛋白條帶和內(nèi)參條帶圖像，從而測(cè)得蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

1.2.5 MTT法檢測(cè)順鉑的IC50 貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，吹打制成細(xì)胞懸液，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為105/mL，于96孔板中每孔加入100 μL，培養(yǎng)24 h不同濃度順鉑進(jìn)行處理。一般培養(yǎng)條件下培養(yǎng)細(xì)胞48 h，在每孔中加入20 μL、5 mg/mL 的MTT 溶液，孵育4 h后，棄去液體培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，在搖床上通過(guò)10 min的振蕩，使結(jié)晶物溶解充分，將酶標(biāo)儀置于570 nm波長(zhǎng)下測(cè)得光吸收值（A 值）。

1.2.6 Annexin V/PI 染色法檢測(cè)凋亡率 貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化1 min左右，低速離心后棄上清，PBS洗滌細(xì)胞2次，取1×106/mL的細(xì)胞待檢測(cè)，加入250 μL結(jié)合緩沖液，使其成為濃度（2～5）×105/mL 的細(xì)胞懸液。取195 μL細(xì)胞懸液加入Binding Buffer和FITC標(biāo)記的AnnexinV-FITC 5 μL以及濃度為20 μg/mL碘化丙錠（PI）溶液10 μL，室溫避光處理30 min，再加入300 μL的結(jié)合緩沖液，輕輕混勻，2 min后于流式細(xì)胞儀上（激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm）進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 17. 0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 沉默β-catenin對(duì)各組β-catenin蛋白表達(dá)量影響

Western blot結(jié)果：由蛋白marker顯示，各組均在92 kD處顯示條帶，則各組β-catenin均有表達(dá)。以相對(duì)分子質(zhì)量為43 kD 的β-actin 作為內(nèi)參，應(yīng)用Image J 軟件定量分析β-catenin蛋白表達(dá)水平。正常血清組、順鉑組、siCTNNB1-235 組、siCTNNB1-510 組、siCTNNB1-547 組分別為：1.00、0.977±0.015、0.323±0.021、0.570±0.020、0.723±0.025。方差分析5組β-catenin蛋白表達(dá)的差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=714.980，P=0.000）。如圖1、圖2結(jié)果顯示，與順鉑組比較，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CTNNB1-235特異性siRNA組總β-catenin表達(dá)強(qiáng)度明顯降低（t=43.830，P=0.000）。以正常血清A549/DDP組蛋白表達(dá)量為基準(zhǔn)，特異性β-catenin siRNA對(duì)β-catenin表達(dá)抑制率達(dá)67％。而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA（順鉑）組細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)量變化不明顯（t=2.646，P=0.152）。此結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的對(duì)于β-catenin siRNA有較強(qiáng)特異性，且阻抑效果顯著。

2.2 β-catenin 表達(dá)受抑對(duì)各組A549/DDP 細(xì)胞β-catenin、Survivin蛋白表達(dá)的影響

圖3、5結(jié)果顯示，正常血清組、siCTNNB1+正常血清組、含藥血清組、siCTNNB1+順鉑+正常血清組、siCTNNB1+順鉑+含藥血清組和siCTNNB1+含藥血清組β-catenin蛋白表達(dá)水平分別為：1.00、0.453±0.021、0.458±0.020、0.387±0.015、0.247±0.015、0.323±0.252。方差分析6組β-catenin蛋白表達(dá)的差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=838.916，P=0.000）。與正常血清組比較，siCTNNB1+正常血清組和含藥血清組均能降低β-catenin蛋白表達(dá)量（t=45.490，P=0.000；t=46.430，P=0.000），而siCTNNB1+正常血清組和含藥血清組兩組間無(wú)明顯差異（t=0.299，P=0.709）。與siCTNNB1+正常血清組比較，siCTNNB1+順鉑+正常血清組和siCTNNB1+含藥血清組β-catenin 蛋白表達(dá)水平降低（t=4.472，P=0.000；t=13.860，P=0.000）。與siCTNNB1+順鉑+正常血清組相比，siCTNNB1+順鉑+含藥血清組β-catenin 蛋白表達(dá)量也降低（t=11.220，P=0.000）。

圖4、5結(jié)果顯示，正常血清組、siCTNNB1+正常血清組、含藥血清組、siCTNNB1+順鉑+正常血清組、siCTNNB1+順鉑+含藥血清組和siCTNNB1+含藥血清組Survivin蛋白表達(dá)水平分別為：1.00、0.523±0.015、0.503±0.015、0.356±0.005、0.257±0.015、0.313±0.015。方差分析6 組Survivin 蛋白表達(dá)的差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1 369.468，P=0.000）。與正常血清組比較，siCTNNB1+正常血清組和含藥血清組均能降低Survivin 蛋白表達(dá)量（t=54.050，P=0.000；t=56.320，P=0.000），而siCTNNB1+正常血清組和含藥血清組兩組間無(wú)明顯差異（t=0.184，P=0.077）。與siCTNNB1+正常血清組比較，siCTNNB1+順鉑+正常血清組和siCTNNB1+含藥血清組Survivin 蛋白表達(dá)水平降低（t=18.020，P=0.000；t=21.380，P=0.000）。與siCTNNB1+順鉑+正常血清組相比，siCTNNB1+順鉑+含藥血清組Survivin 蛋白表達(dá)量也降低（t=10.640，P=0.000）。

2.3 β-catenin表達(dá)受抑對(duì)各組A549/DDP細(xì)胞IC50的影響

圖6 中MTT 結(jié)果顯示，正常血清組、含藥血清組、siCTNNB1+正常血清組、siCTNNB1+含藥血清組的IC50分別為：（28.330±1.029） μmol/L、（20.350±1.155） μmol/L、（15.577±1.535） μmol/L、（10.453±0.999） μmol/L，4 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=120.493，P=0.000）。與正常血清組比較，補(bǔ)中益氣湯含藥血清可降低A549/DDP細(xì)胞順鉑的IC50（t=8.932，P=0.000）。與含藥血清組或siCTNNB1+正常血清組比較，siCTNNB1+含藥血清組A549/DDP細(xì)胞順鉑的IC50顯著降低（t=11.220，P=0.001；t=4.844，P=0.000）。

2.4 β-catenin表達(dá)受抑對(duì)各組A549/DDP細(xì)胞凋亡的影響

由圖7、8 的Annexin V/PI 染色法的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，正常血清組、順鉑組、siCTNNB1+順鉑組、順鉑+含藥血清組的總凋亡率分別為：（9.130±0.384）%、（34.367±0.631）%、（64.393±0.244）%、（70.120±0.400）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12 563.734，P=0.000）。單獨(dú)使用順鉑時(shí)，A549/DDP細(xì)胞的順鉑誘導(dǎo)總凋亡率明顯增加（t=59.140，P=0.000）；瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CTNNB1-235聯(lián)合順鉑，A549/DDP細(xì)胞的順鉑誘導(dǎo)總凋亡率進(jìn)一步增加（t=210.200，P=0.000）；補(bǔ)中益氣湯聯(lián)合順鉑后A549/DDP 細(xì)胞順鉑誘導(dǎo)總凋亡率增加最明顯（t=190.400，P=0.000）。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，腫瘤長(zhǎng)居體內(nèi)，會(huì)不斷吸收五臟精微，則虧損五臟之精，導(dǎo)致精不足以化氣而氣虛[6]。因此治則需益氣健脾，扶助正氣[7]。根據(jù)中醫(yī)五行相生理論“培土生金”法，選擇代表方劑補(bǔ)中益氣湯治療肺癌耐藥得到良好的療效[3-5]。前期研究也顯示，補(bǔ)中益氣湯可以明顯改善腫瘤對(duì)順鉑的耐藥性，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的藥物敏感性[8]，有利于化療的繼續(xù)治療，延長(zhǎng)肺癌患者壽命、提高生存質(zhì)量，為中醫(yī)藥治療或緩解癌癥癥狀提供新的思路。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥關(guān)系十分密切[9]。β-catenin是一種多功能蛋白質(zhì)，在內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著核心作用。β-catenin過(guò)高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致各種疾病，包括癌癥[10]。當(dāng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活，β-catenin從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，使得細(xì)胞增殖加快、產(chǎn)生凋亡抵抗，也提高A549/DDP 細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性[11]。Survivin 是Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游的靶基因，是最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白之一，只在腫瘤細(xì)胞和胚胎組織中表達(dá)，并與腫瘤治療抵抗相關(guān)[12]。當(dāng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路被抑制，能顯著降低A549/DDP對(duì)順鉑的耐藥性，同時(shí)也能下調(diào)Survivin蛋白表達(dá)[3]。這些研究不僅支持本研究的結(jié)果，而且可能解釋Survivin誘導(dǎo)途徑的中斷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加和腫瘤生長(zhǎng)抑制的分子機(jī)制[13]。本研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)中益氣湯干預(yù)或干擾β-catenin均能下調(diào)β-catenin、Survivin蛋白表達(dá)，降低順鉑的IC50，并提高順鉑誘導(dǎo)的總凋亡率，且補(bǔ)中益氣湯干預(yù)和干擾β-catenin 2組之間無(wú)明顯差異。以上結(jié)果證明，補(bǔ)中益氣湯干預(yù)與干擾β-catenin具有類似的作用，均可通過(guò)抑制抗凋亡蛋白Survivin的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，進(jìn)而降低順鉑的半數(shù)抑制濃度，增加耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，改善順鉑耐藥的發(fā)生。而當(dāng)補(bǔ)中益氣湯聯(lián)合干擾β-catenin時(shí)，β-catenin、Survivin蛋白的表達(dá)下調(diào)、順鉑的IC50降低及順鉑誘導(dǎo)總凋亡率的提高均比補(bǔ)中益氣湯聯(lián)合順鉑干預(yù)或干擾β-catenin時(shí)更加明顯，證明補(bǔ)中益氣湯干預(yù)和干擾β-catenin在改善順鉑耐藥方面具有協(xié)同效應(yīng)。本研究進(jìn)一步證實(shí)補(bǔ)中益氣湯可以通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路而干預(yù)肺癌的順鉑耐藥性。β-catenin作為Wnt/β-catenin通路的核心信號(hào)分子，是腫瘤耐藥的重要干預(yù)靶點(diǎn)之一，本研究證實(shí)補(bǔ)中益氣湯具有β-catenin干擾作用，并與其存在協(xié)同效應(yīng)，為臨床尋求中醫(yī)藥改善肺癌順鉑耐藥的有效靶點(diǎn)提供可參考的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。綜上所述，補(bǔ)中益氣湯通過(guò)抑制A549/DDP 細(xì)胞β-catenin及下游靶基因Survivin的表達(dá)、降低順鉑的IC50數(shù)值、增加順鉑誘導(dǎo)的總凋亡率，從而發(fā)揮改善肺腺癌順鉑耐藥的作用。補(bǔ)中益氣湯含藥血清聯(lián)合順鉑和干擾β-catenin在抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路改善肺腺癌順鉑耐藥性方面具有協(xié)同效應(yīng)，且補(bǔ)中益氣湯具有干擾β-catenin樣效應(yīng)。本研究為將來(lái)拓展肺癌順鉑耐藥提供新的思路與方法。