【關鍵詞】肺血管屏障；急性肺損傷；緊密連接蛋白；凋亡

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是由嚴重感染、創(chuàng)傷、燒傷等非心源性因素誘發(fā)的全身炎癥反應，以肺屏障功能受損為特征，表現(xiàn)為進行性呼吸窘迫、難治性低氧血癥及非心源性肺水腫等癥狀，為臨床常見的急危重癥，死亡率高達30%～40%[1]。目前大多數(shù)學者認為ALI的發(fā)病機制主要是炎性反應失控及氧化應激損傷導致直接及間接肺損傷[2]。肺屏障由肺上皮屏障及肺血管內(nèi)皮屏障共同組成，肺上皮屏障由肺泡上皮細胞組成，為抵御外來病原體侵犯的第一道防線，肺內(nèi)皮屏障由肺微血管內(nèi)皮細胞及細胞間緊密連接組成，是急性肺損傷時抵御體內(nèi)炎癥因子攻擊，阻止肺水腫的第一道屏障。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是ALI炎性反應中釋放最早最重要的內(nèi)源性介質(zhì)，啟動炎性級聯(lián)反應。研究顯示TNF-α可以通過降低血管內(nèi)皮鈣黏蛋白增加人肺微血管內(nèi)皮屏障的通透性[3]。本研究采用TNF-α作為細胞炎癥刺激因子，探究其對肺微血管內(nèi)皮細胞及細胞間機密連接蛋白表達的影響，更接近ALI對機體的病理生理過程。本課題組前期研究表明，TNF-α下調(diào)大鼠肺上皮細胞緊密連接蛋白Claudin-4、緊密連接蛋白1（zonulaoccludens-1，ZO-1）的表達，損傷肺上皮屏障，導致肺損傷[4]。并通過在體內(nèi)實驗證實，在油酸誘導的大鼠急性肺損傷中，大鼠肺Claudin-5及ZO-1表達下調(diào)[5]。肺血管內(nèi)皮屏障及肺泡上皮屏障，在影響肺通透性改變方面的作用同樣重要，且肺血管內(nèi)皮細胞損傷較早且更為嚴重，因此進一步研究TNF-α對血管內(nèi)皮屏障功能的影響，對于進一步明確ALI對TNF-α損傷肺屏障的機制十分重要。然而，關于TNF-α 對大鼠肺內(nèi)皮細胞Claudin-5 及ZO-1 表達的研究，目前主要集中于動物實驗，在體內(nèi)狀態(tài)下，急性肺損傷炎癥風暴發(fā)生時，機體常存在多種炎癥因子共同作用情況，研究關鍵促炎因子TNF-α在離體狀態(tài)下對大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞Claudin-5、ZO-1的作用，能更準確地反應TNF-α對肺血管內(nèi)皮屏障的影響。因此，本研究通過TNF-α與肺微血管內(nèi)皮細胞體外共培養(yǎng)，觀察肺微血管內(nèi)皮細胞的損傷及細胞間緊密連接蛋白Claudin-5、ZO-1的表達情況，進一步探討TNF-α對肺血管內(nèi)皮屏障損傷的機制，為急性肺損傷的治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞系

大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞株購自上海拜力生物有限公司。

1.2 試劑及試劑盒

1640細胞培養(yǎng)基和10%胎牛血清（Gibico公司），TNF-α（Peprotech 公司，400-14）；MTT 試劑盒、Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒和BCA蛋白檢測試劑盒（南京凱基生物有限公司）；小鼠抗大鼠Claudin-5（Invitrogen 公司，352588）和兔抗大鼠ZO-1（Invitrogen 公司，61-7300）；小鼠抗大鼠β-actin（北京中山金橋生物有限公司，TA09）、羊抗兔IgG（北京中山金橋生物有限公司，ZF-0511）和羊抗小鼠IgG（北京中山金橋生物有限公司，ZB-2305）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司，RR037A），Claudin-5、ZO-1和β-actin引物（上海生物工程有限公司，表1）。本研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院科研倫理委員會批準（審批號：2012-3-6）。

1.3 方法

1.3.1 細胞分組及處理 細胞分為對照組（1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清共培養(yǎng)），TNF-α 24 h組（TNF-α 10 mg/L+1640培養(yǎng)基+10% 胎牛血清共培養(yǎng)24 h）、TNF-α 48 h 組（TNF-α10 mg/L+1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清共培養(yǎng)48 h）和TNF-α 72 h組（TNF-α 10 mg/L+1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清共培養(yǎng)72 h。

TNF-α 10 ng/mL 為通過TNF-α 5 ng/mL、TNF-α 10 ng/mL、TNF-α 20 ng/mL、TNF-α 40 ng/mL濃度梯度行預實驗篩選后所得的適宜刺激濃度。

1.3.2 透射電鏡觀察大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞超微結構 肺微血管內(nèi)皮細胞以適當密度接種于6孔板，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照上述分組處理細胞，常規(guī)制片，透射電子顯微鏡觀察細胞超微結構，攝片。

1.3.3 MTT法測定細胞的增殖抑制率 肺微血管內(nèi)皮細胞接種于96孔板，1×105個/L，100 μL/孔。置于細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，按照實驗分組處理細胞，每組設置3個復孔，處理結束后，棄上清液，更換無血清培養(yǎng)基90 μL/孔，按照試劑盒操作說明進行操作，酶標儀490 nm波長處測定每孔吸光度值（A 值）。細胞增殖抑制率=（對照組A 值-TNF-α處理組A值）/對照組A 值。

1.3.4 流式細胞雙染法測定細胞的凋亡率 肺微血管內(nèi)皮細胞以1×105個/L接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，按照實驗分組處理細胞，每組設2個復孔，處理結束，棄培養(yǎng)液，加入胰酶（不含EDTA）500 μL/孔，離心收集懸浮細胞。按照AnnexinV-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作。流式細胞儀檢測結果可得出各組細胞早期凋亡率。

1.3.5 免疫熒光法測定ZO-1、Claudin-5的表達分布 肺微血管內(nèi)皮細胞以適當密度均勻接種于置有無菌爬片的6孔板內(nèi)，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，預溫的PBS（1×）洗滌細胞，4%的多聚甲醛室溫固定20 min，再次洗滌細胞，5% 牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）室溫封閉1 h。6孔板內(nèi)加入一抗（兔抗大鼠ZO-1 1∶50；小鼠抗大鼠Claudin-5 1∶50）4 ℃孵育過夜，洗滌細胞，加入FITC標記的對應二抗（羊抗大鼠 IgG，1∶100；羊抗小鼠 IgG，1∶100），室溫避光孵育1 h。洗滌細胞，DAPI封片劑染核封片，共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.3.6 RT-q-PCR法測定ZO-1、Claudin-5的mRNA 收集處理后的各組細胞，用Trizol法提取細胞總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（按說明書操作）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。應用 LightCycler480Systerm法進行實時熒光定量PCR：反應體系共：20 μL（SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，PCR Forward Primer 0.4 μL，PCR Reverse Primer 0.4 μL，DNA 模板 2 μL，H2O 7.2 μL）。反應條件為95 ℃ 5 s 1個循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃（ZO-1）/57 ℃（Claudin-5）30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。用PCR儀器測定各組CT 值，按2-ΔΔCt 計算Claudin-5 及ZO-1 的相對轉(zhuǎn)錄水平。

1.3.7 Western blot法測定ZO-1、Claudin-5的表達 收集處理后各組細胞，加入預冷的細胞裂解液100 μL，混合均勻后，4 ℃搖床震蕩后靜置4 min，充分裂解20 min后離心收集上清即為全蛋白提取物，BCA法蛋白含量檢測，配置SDSPAGE凝膠，分別配置12% 及8% 的分離膠，5% 的濃縮膠。將蛋白樣品加入上樣緩沖液變性處置，取適量樣品加入凝膠孔，80 V恒壓電泳，電泳結束后，使用Bio-Rad的標準濕式轉(zhuǎn)膜裝置，按照濾紙-凝膠-PVDF 膜-濾紙順序組裝轉(zhuǎn)印夾，300 mA電流冰浴轉(zhuǎn)膜90 min，5%的脫脂牛奶封閉轉(zhuǎn)印有蛋白的PVDF膜2 h，加入一抗（兔抗大鼠ZO-1 1∶250，小鼠抗大鼠 Claudin-5 1∶500，小鼠抗大鼠β-actin 1∶500）4 ℃過夜孵育，洗膜3次，HRP標記的相對應的二抗（羊抗兔IgG，1∶5 000，抗小鼠IgG，1∶5 000）室溫孵育2 h，洗膜，將顯色液加到膜上，置于凝膠成像儀內(nèi)，曝光，成像。用Image Lab分析軟件進行分析處理，測定各條帶的灰度值，目的條帶/對應內(nèi)參的灰度值，計算各組蛋白表達的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，若滿足正態(tài)性，方差齊，則各組樣本間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗。若不符合正態(tài)性，方差不齊，則用秩轉(zhuǎn)換的非參數(shù)檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 TNF-α對肺微血管內(nèi)皮細胞超微結構的影響

對照組大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞胞漿豐富，含有大量的線粒體（雙層單位膜套疊而成的封閉性膜囊結構）、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（呈管狀、扁狀，擴大成囊）及高爾基復合體（扁平膜囊），胞漿內(nèi)可見少量吞飲泡。TNF-α 24 h 組細胞線粒體即出現(xiàn)腫脹，嵴結構尚完整，無明顯溶解現(xiàn)象。TNF-α作用至48 h、72 h時，細胞線粒體數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)溶解，嵴消失，細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡結構，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體腫脹，結構不清晰，部分細胞可見核碎裂、溶解，視野內(nèi)凋亡細胞增多（圖1）。

2.2 TNF-α對肺微血管內(nèi)皮細胞增殖及凋亡的影響

TNF-α作用于肺微血管內(nèi)皮細胞24 h后，細胞的增殖抑制率較對照組明顯升高［（27.39±3.45）% vs.（0.00±1.49）%］，呈時間依賴性［48 h（38.91±0.63）%；72 h（43.9±1.53）%，Plt;0.05］（圖2A）。與對照組（1.47±0.15）%比較，TNF-α各組，細胞的凋亡率均明顯增加［24 h（7.53±0.76）%；48 h（10.80±0.40）%；72 h（15.20±0.92）%，Plt;0.05］（圖2B）。

2.3 ZO-1及Claudin-5在肺微血管內(nèi)皮細胞的表達分布

共聚焦顯微鏡下可見ZO-1及Claudin-5均沿細胞膜呈線狀熒光分布細胞與細胞連接部位，調(diào)控細胞旁通透性（圖3）。

2.4 TNF-α 對ZO-1 及Claudin-5 的轉(zhuǎn)錄水平（mRNA）的作用

TNF-α各處理組細胞ZO-1及Claudin-5的相對轉(zhuǎn)錄水平（mRNA）均較對照組明顯降低，且隨作用時間的延長，相對轉(zhuǎn)錄水平呈下降趨勢，具有時間依賴性，各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（ZO-1：24 h：0.60±0.18，48 h：0.36±0.09，72 h：0.08±0.02 vs. 1.00±0.00，均Plt;0.05；Claudin-5：24 h 0.48±0.07，48 h：0.15±0.00，72 h：0.03±0.00 vs. 1.00±0.00，均Plt;0.05）（圖4）。

2.5 TNF-α對緊密連接蛋白ZO-1及Claudin-5蛋白表達的影響

與對照組比較，TNF-α各組細胞ZO-1蛋白表達水平均低于對照組（24 h：0.40±0.06；48 h 0.30±0.03；72 h 0.24±0.03 vs. 0.59±0.13；均Plt;0.05），TNF-α 72 h組較24 h組ZO-1表達降低（Plt;0.05）。TNF-α 48 h組與24 h組比較，ZO-1蛋白表達降低，但差異無統(tǒng)計學意義。TNF-α 48 h、72 h組細胞Claudin-5 的相對表達水平均明顯低于對照組（48 h：0.52±0.11，72 h：0.28±0.10 vs. 0.91±0.09），與TNF-α 24 h組（0.71±0.02）比較，TNF-α 72 h組Claudin-5表達降低（均Plt;0.05），TNF-α 48 h組Claudin-5表達雖繼續(xù)降低，但差異無統(tǒng)計學意義（圖5）。

3 討論

急性肺損傷的重要病理特征為彌漫性肺泡損傷及肺屏障功能障礙[6]。肺內(nèi)炎癥反應失衡為ALI的病理基礎，免疫細胞分泌的細胞因子白介素及TNF-α引發(fā)的細胞因子風暴及瀑布式炎性反應為肺損傷加重的主要因素[7]。肺微血管內(nèi)皮細胞為內(nèi)皮屏障的基本結構及功能單位，也是急性肺損傷時TNF-α 作用的重要靶細胞。研究關鍵促炎因子TNF-α對肺血管內(nèi)皮細胞及屏障功能的影響，對急性肺損傷的機制及今后治療有一定價值。

肺微血管內(nèi)皮屏障由內(nèi)皮細胞，細胞-細胞間連接及細胞外基質(zhì)組成，具有防止肺泡充血和調(diào)控血管內(nèi)外液體及營養(yǎng)交換2種功能，物質(zhì)交換方式包括跨細胞途徑及細胞旁途徑。在炎癥反應時，一些較大的物質(zhì)分子主要通過跨細胞途徑滲透至肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)，而液體分子主要通過細胞旁途徑進行滲透。TNF-α可介導多種炎癥反應，誘導細胞損傷。Zhou P等[8]的研究發(fā)現(xiàn)TNF-α可以誘導內(nèi)皮細胞線粒體損傷，上調(diào)線粒體死亡因子Cyt-c的表達，觸發(fā)線粒體凋亡途徑，選擇性下調(diào)TNF-α 受體可以減輕呼吸機誘導的肺損傷[9]。本研究中，TNF-α10 ng/mL與大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)24 h時，電鏡下觀察到內(nèi)皮細胞內(nèi)線粒體等細胞器結構腫脹，培養(yǎng)至48 h、72 h時，細胞內(nèi)線粒體數(shù)量明顯減少，線粒體嵴溶解、斷裂，出現(xiàn)排空現(xiàn)象。內(nèi)皮細胞炎性損傷是導致跨細胞途徑增加的關鍵因素。此外TNF-α參與細胞凋亡、自噬等的發(fā)生[10-11]，內(nèi)皮細胞的過度凋亡是肺氣腫和ALI等非腫瘤性肺部疾病發(fā)生機制之一。細胞凋亡分為外源性凋亡及內(nèi)源性凋亡。ALI通過白細胞活化、氧化應激、神經(jīng)酰胺上調(diào)等多種機制調(diào)控內(nèi)皮細胞過度凋亡。TNF-α不僅是促炎因子，同時還是一種細胞凋亡因子，可以通過外源性凋亡途徑，與相應配體在胞質(zhì)內(nèi)的死亡結構域中形成復合物，激活caspase 導致細胞凋亡，同時TNF-α誘導內(nèi)皮細胞線粒體損傷，釋放細胞色素Cyt-c于細胞質(zhì)中，形成凋亡小體，引起內(nèi)源性細胞凋亡。另有研究顯示TNF-α可以通過激活JNK通路誘導小鼠毛囊細胞凋亡，凋亡細胞又可以表達TNF-α，反向誘導細胞凋亡，形成惡性循環(huán)[12]。Wang L等[13]的研究顯示應用麻醉劑七氟醚通過調(diào)節(jié)caspase-3活化和Bcl-xl和Bcl-2表達抑制細胞凋亡減輕脂多糖誘導的大鼠急性肺損傷。而下調(diào)TNF-α的表達可以減輕內(nèi)毒素誘導的大鼠急性肺損傷[14]。本研究中，與對照組相比，TNF-α 10 ng/mL作用于肺血管內(nèi)皮細胞48 h及72 h時，電鏡下可見細胞核固縮溶解，凋亡細胞數(shù)量增加。且TNF-α組細胞的增殖受到抑制，凋亡率增加，且其作用具有時間依賴效應，作用時間越長，細胞損傷程度及凋亡越重。有研究顯示TNF-α在ALI發(fā)生后1 h即可出現(xiàn)升高，呈現(xiàn)動態(tài)變化，貫穿ALI的始終[15]。結合本研究結果，推測TNF-α可持續(xù)作用在ALI的進展中起到一定作用。完整的內(nèi)皮屏障結構是維持肺血管內(nèi)皮屏障穩(wěn)態(tài)，保障肺泡內(nèi)外氣體交換的必需條件。內(nèi)皮細胞凋亡所致的肺泡毛細血管屏障完整性受損是急性肺損傷的發(fā)生機制之一，也是急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）發(fā)生的關鍵，凋亡的細胞因為缺乏細胞間隙，促使死亡細胞在同一部位累積，增加毛細血管的滲漏，促進ARDS的發(fā)展[16]。因此，推測TNF-α直接損傷大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞結構，抑制其增殖，誘導其凋亡，增加跨細胞通透性及細胞間隙，破壞內(nèi)皮屏障結構完整性。

細胞旁途徑主要依靠細胞間連接，內(nèi)皮細胞-細胞間連接包括緊密連接和黏附連接。緊密連接（tight junction，TJ）是黏附在相鄰細胞脂質(zhì)膜上的蛋白復合物，具有柵欄和屏障功能，維持細胞極性，控制細胞旁通透性，為影響肺通透性及肺泡清除能力的主要蛋白。緊密連接由閉合蛋白、Claudins 和ZO-1等組成。內(nèi)皮細胞主要表達Claudin-5，為內(nèi)皮特異性緊密連接分子[17-18]。在急性肺損傷發(fā)病過程中，微血管通透性升高、血氣屏障破壞與Claudin-5下調(diào)有關[19-20]，上調(diào)內(nèi)皮細胞中Claudin-5，可減輕內(nèi)皮細胞損傷[21]。有研究顯示TNF-α 通過增強TNFR1的表達降低豬腸上皮細胞Claudin-1、Claudin-3等表達，導致腸上皮損傷[22]，提示炎癥因子TNF-α可通過調(diào)節(jié)Claudin 蛋白的表達，調(diào)控細胞旁通透性。本研究TNF-α刺激體外大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞，作用時間48 h時Claudin-5的轉(zhuǎn)錄及表達出現(xiàn)下調(diào)，繼續(xù)作用至72 h，Claudin-5的表達水平繼續(xù)下降，提示TNF-α下調(diào)Claudin-5的表達損傷細胞間緊密連接結構。在一項流感病毒所致ALI肺微血管滲漏的研究中顯示，Claudin-5 呈劑量依賴性消耗，導致肺水腫[23]。Huang LY等[24]同樣研究病毒感染過程中Claudin-5及人肺血管內(nèi)皮細胞屏障中間的關系，發(fā)現(xiàn)Toll樣受體3配體多肌苷多胞苷酸通過刺激IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子α和干擾素β的產(chǎn)生，激活NF-κB和IRF3，降低跨膜Claudin-5的轉(zhuǎn)錄及表達，從而增加內(nèi)皮細胞單層通透性。因此，Claudin-5 的表達與肺血管內(nèi)皮通透性密切相關。ZO-1是中間跨膜蛋白和肌動蛋白細胞骨架的組成成分，是內(nèi)皮連接的中心調(diào)節(jié)器，與Claudin-5共同組成緊密連接復合體，調(diào)節(jié)細胞-細胞張力、遷移、血管生成和屏障形成。本研究結果顯示ZO-1 及Claudin-5蛋白呈線狀熒光分布于大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞與細胞間連接部位。Goldblum SE等[25]在急性肺損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制ZO-1 的表達，改變ZO-1 的定位，細胞跨膜電阻抗降低，肺通透性增加。本研究TNF-α10 ng/mL作用時間為24 h、48 h、72 h時，ZO-1蛋白表達水平明顯下調(diào)。吳彥立等[26]的研究采用TNF-α100 ng/mL作用于人微血管內(nèi)皮細胞24 h后，細胞claudin-5、ZO-1表達下調(diào)，與本實驗結果相比較，TNF-α的處理濃度及作用時間不同對緊密連接蛋白表達的影響差異可能與所干預細胞的種屬不同有關。任睿芳等[27]在犀角地黃湯合銀翹散對TNF-α誘導的大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞通透性的研究中顯示，TNF-α作用12 h至48 h時，血管內(nèi)皮細胞通透性逐漸增加，具有時間依賴效應。這與本研究結果相一致，說明TNF-α對細胞及細胞間緊密連接的損傷作用具有持續(xù)性，隨時間延長呈加重趨勢。然而目前關于TNF-α影響肺微血管內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白表達的分子機制尚不明確，有研究顯示，ALI時，TNF-α通過激活NF-κB信號通路，誘導炎癥反應，引起多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生及釋放[28]，而NF-κB是肺部Claudin-5的主要調(diào)控因子，在腸黏膜屏障[29]及視網(wǎng)膜屏障[30]中的研究證實，激活NF-κB信號通路可以增加細胞旁通透性，損傷屏障功能。也有研究顯示，TNF-α 可以通過激活Wnt/β-catenin 通路增加肺微血管內(nèi)皮屏障通透性[26]。可見TNF-α影響細胞間緊密連接蛋白表達的分子機制，仍需進一步地探索明確。

綜上，本研究認為TNF-α通過下調(diào)離體大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞ZO-1及Claudin-5的表達，并誘導細胞損傷及凋亡，破壞肺血管屏障結構，導致肺損傷。目前研究顯示TNF-α抑制劑已應用于炎癥性腸病，風濕類疾病等治療，并取得了較好的療效[31]，基于本研究結果，推測在急性肺損傷時，應用TNF-α拮抗劑有望為急性肺損傷患者帶來獲益，但仍需要大量的研究進一步進行理論支撐，為急性肺損傷今后的靶向治療提供指導意義。