摘要：目的 探究程序性細(xì)胞死亡配體-1 （programmed cell death ligand 1，PD-L1） 通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫以及PI3K/Akt/mTOR信號通路在脊髓損傷 （SCI） 小鼠模型中發(fā)揮保護(hù)作用。方法 采用C57BL/6小鼠建立SCI模型，分為假手術(shù)組 （Sham）、SCI組、SCI+PD-L1抗體組 （SCI+Ab） 和SCI+PD-L1蛋白組 （SCI+PRO）。C57BL/6小鼠和PD-L1基因敲除小鼠進(jìn)行SCI造模，分為假手術(shù)組（Sham WT）、PD-L1敲除假手術(shù)組（Sham PD-L1 KO）、SCI模型組（SCI WT）、PD-L1敲除SCI模型組（SCI PD-L1 KO）。應(yīng)用Western blotting和qRT-PCR檢測SCI后不同時(shí)間點(diǎn)脊髓組織中PD-L1的表達(dá)；通過Basso小鼠運(yùn)動(dòng)量表 （BMS） 評估小鼠運(yùn)動(dòng)功能；利用qRT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)分析SCI后炎癥因子水平和T細(xì)胞亞群的變化；Western blotting檢測PI3K/Akt/mTOR信號通路活化情況。結(jié)果 小鼠經(jīng)SCI造模后脊髓組織中PD-L1表達(dá)上調(diào)，于第7天達(dá)峰值。與SCI PD-L1 KO組相比，SCI WT組的小鼠在SCI后7 d、14 d和28 d時(shí)BMS評分均顯著升高（Plt;0.05），造模后第7天炎癥因子IL-1α、IL-2、IFN-γ和TNF-α水平顯著降低（Plt;0.05）；與SCI+PBS組相比，SCI+PRO組Foxp3水平顯著升高，Th1和Th17細(xì)胞水平顯著降低，Th2和Treg細(xì)胞水平顯著升高（Plt;0.05）；與SCI PD-L1 KO組相比，SCI WT組小鼠PI3K/Akt/mTOR信號通路磷酸化程度顯著升高（Plt;0.05）；與SCI+PBS組和SCI+Ab組相比，SCI+PRO組PI3K/Akt/mTOR信號通路磷酸化程度顯著降低（Plt;0.05）。結(jié)論 PD-L1通過調(diào)節(jié)Th1、Th17、Th2和Treg細(xì)胞平衡，并抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，從而減輕SCI后的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。PD-L1有望成為治療SCI的新靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：脊髓損傷（SCI）；程序性細(xì)胞死亡配體-1（PD-L1）；T細(xì)胞；炎癥；PI3K/Akt/mTOR信號通路

中圖分類號：R651.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.7652/jdyxb202406007

收稿日期：2024-06-26 修回日期：2024-10-08

基金項(xiàng)目：國家衛(wèi)生健康委醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展研究中心資助項(xiàng)目（No. WKZX2022JG0122）

Supported by Research Center for Development of Medicine and Health Science and Technology， National Health Commission （No. WKZX2022JG0122）

通信作者：胡波，主任醫(yī)師. E-mail： hubo3218@sohu.com

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//kns.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20241021.1556.002.html （2024-10-22）

Programmed cell death ligand-1 exerts neuroprotective effects in a mouse model of spinal cord injury by modulating T cell immunity

DONG Wenxu¹， GUO Shouyu²， HU Bo¹

（1. Department of Pediatrics， The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University， Hefei 230022; 2. Department of Cardiovascular Medicine， The Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University， Nanjing 210011， China）

ABSTRACT： Objective The aim of this study was to investigate the protective role of programmed cell death ligand-1 （PD-L1） in a mouse model of spinal cord injury （SCI） by regulating T cell immunity and the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. Methods C57BL/6 mice used to establish SCI models were divided into the sham operation group （Sham）， SCI group， SCI+PD-L1 antibody group （SCI+Ab）， and SCI+PD-L1 protein group （SCI+PRO）. c57BL/6 mice and PD-L1 knockout mice were used for SCI mapping， and they were divided into the sham operation group （Sham WT）， PD-L1 knockout sham operation group （Sham PD-L1 KO）， SCI model group （SCI WT）， and PD-L1 knockout SCI model group （SCI PD-L1 KO）. Western blotting and qRT-PCR were applied to detect the expression of PD-L1 in spinal cord tissues at different time points after SCI; mouse motor function was assessed by the Basso Mouse Motor Scale （BMS）; changes in the levels of inflammatory factors and T-cell subpopulations after SCI were analyzed using qRT-PCR and flow cytometry; and Western blotting was used to detect changes in the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway activation. Results PD-L1 expression was upregulated in spinal cord tissues of mice subjected to SCI palliation， peaking on day 7. Compared with the SCI PD-L1 KO group， mice in the SCI WT group had significantly higher BMS scores at 7， 14， and 28 days after SCI （Plt;0.05）， and the levels of inflammatory factors IL-1α， IL-2， IFN-γ and TNF-α were significantly lower on day 7 after palpation （Plt;0.05）. Compared with the SCI+PBS group， mice in the SCI+PRO group had significantly higher Foxp3 levels and significantly lower Th1 and Th17 levels. Foxp3 levels were significantly higher， but Th1 and Th17 cell levels were significantly lower， and Th2 and Treg cell levels were significantly higher （Plt;0.05）. The phosphorylation of the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway was significantly higher in the SCI WT group mice than the SCI PD-L1 KO group ones （Plt;0.05）. In contrast， the phosphorylation of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway was significantly lower in the SCI+PRO group than in the SCI+PBS group and the SCI+Ab group （Plt;0.05）. Conclusion PD-L1 plays a neuroprotective role by regulating the balance of Th1， Th17， Th2 and Treg cells and inhibiting the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway， thereby reducing the inflammatory response after SCI. PD-L1 is expected to be a new target for the treatment of SCI.

KEY WORDS： spinal cord injury （SCI）; programmed cell death ligand-1 （PD-L1）; T cell; inflammation; PI3K/Akt-mTOR signaling pathway

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，它會(huì)引發(fā)一系列繼發(fā)性病理過程，如炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元死亡等，進(jìn)一步加劇了神經(jīng)功能的喪失^［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球有超過2 700萬人遭受SCI，我國每年新發(fā)病例約6～8萬例^［2-3］。目前，SCI的治療手段仍局限于早期外科干預(yù)和并發(fā)癥管理，缺乏有效的神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)策略。研究表明，創(chuàng)傷后的過度炎癥反應(yīng)會(huì)加重組織損傷，阻礙功能恢復(fù)。但適度的免疫應(yīng)答，尤其是T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫，對于清除細(xì)胞碎片、抑制神經(jīng)元凋亡、促進(jìn)軸突再生具有積極意義^［4］。因此，如何精準(zhǔn)調(diào)控SCI后的免疫反應(yīng)，已成為神經(jīng)免疫學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)^［5］。

程序性細(xì)胞死亡配體-1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）是一種重要的免疫檢查點(diǎn)分子，通過與其受體PD-1結(jié)合，抑制T細(xì)胞的過度激活和促炎因子的釋放，在腫瘤免疫和自身免疫性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵的免疫負(fù)調(diào)控作用^［6-7］。近年來，PD-L1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用日益受到關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1通過上調(diào)Treg細(xì)胞和抑制Th1/Th17細(xì)胞，減輕了腦缺血再灌注損傷^［8］。PI3K/Akt/mTOR信號通路作為細(xì)胞內(nèi)普遍存在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖、代謝和存活等重要生物學(xué)過程^［9］。有研究表明，PI3K/Akt/mTOR信號通路的異常激活與SCI后的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)^［10］。

目前，PD-L1與SCI中T細(xì)胞免疫失衡的關(guān)系以及保護(hù)機(jī)制尚未得到深入探討。PD-L1能否通過PI3K/Akt/mTOR通路影響SCI后的免疫反應(yīng)和組織修復(fù)，目前尚未見報(bào)道。因此，本研究擬在小鼠SCI模型中，探討PD-L1對T細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用，以及由此產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，并初步分析PD-L1與PI3K/Akt/mTOR信號通路的關(guān)系，為研發(fā)以PD-L1為靶點(diǎn)的SCI免疫治療策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

動(dòng)物：8周齡C57BL/6雄性小鼠和PD-L1基因敲除小鼠（體質(zhì)量20～25 g，分別來自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司和北京維蒂亞生物技術(shù)有限公司）。小鼠在12 h光/暗周期、（22±2）℃的溫度和（50±10）%的濕度條件下飼養(yǎng)，有足夠的食物和水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循國際動(dòng)物福利和倫理準(zhǔn)則，并得到安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)批準(zhǔn)（No.LSC20231282）。

藥品與試劑：兔源一抗GAPDH、β-actin、PD-L1、Akt、P-Akt、mTOR、P-mTOR購自Cell Signaling Technology公司；抗小鼠-CD3 FITC、CD3 PerCP、CD4 PE、IFN-γ FITC、IL-4 APC、 IL-17購自Abcam公司；小鼠調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞染色試劑盒，購自賽默飛公司；抗FoxP3單克隆抗體（小鼠源）購自Wako公司；抗β-actin單克隆抗體（小鼠源）購自Sigma公司；PD-L1蛋白（重組人源，Ramp;D Systems公司）；磷酸鹽緩沖生理鹽水（phosphate-buffered saline，PBS）（Sigma-Aldrich公司）。

儀器：Western blotting儀及成像儀（Bio-Rad公司）；PCR儀、流式細(xì)胞儀（BD Biosciences公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 小鼠脊髓損傷模型的建立

在無菌條件下，使用腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，將其四肢定于手術(shù)用托盤，常規(guī)消毒后，進(jìn)行 T10 椎板切除術(shù)以暴露下方的脊髓胸段。通過脊椎打擊器將5 g的重量桿從 5 cm高處掉落于暴露的脊髓背側(cè)表面，以造成小鼠脊椎中度損傷，隨后縫合肌肉和皮膚。小鼠雙后肢癱瘓或雙后肢抽搐、尾巴擺動(dòng)則視為造模成功^［11-12］。假手術(shù)組小鼠接受相同T10 椎板切除術(shù)，但不進(jìn)行脊髓挫傷操作。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與PD-L1治療

分組一：假手術(shù)組（Sham，n=6）、SCI組（SCI，n=6），小鼠在SCI后1 h，通過腰穿注射的方式，向SCI中心3 mm處注射20 μL含有0.005 μg/μL PD-L1抗體作為SCI+PD-L1抗體組（SCI+Ab，n=6）、注射20 μL含有0.005 μg/μL PD-L1蛋白作為SCI+PD-L1重組蛋白組（SCI+PRO，n=6）、注射20 μL生理鹽水作為 SCI+PBS組（n=6）。SCI組和Sham組小鼠不進(jìn)行任何注射。所有的注射都在SCI后每周重復(fù)一次，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束^［6］。

分組二：假手術(shù)組（Sham WT，n=6）、PD-L1敲除假手術(shù)組（Sham PD-L1 KO，n=6）、SCI模型組（SCI WT，n=6）、PD-L1敲除SCI模型組（SCI PD-L1 KO，n=6）。

1.2.3 后肢運(yùn)動(dòng)功能評價(jià)

通過Basso小鼠量表（Basso Mouse Scale，BMS）對SCI后小鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評估。將小鼠放置于空曠區(qū)域，通過BMS量表評估后肢運(yùn)動(dòng)的多個(gè)方面，包括腳踝運(yùn)動(dòng)、軀干位置和穩(wěn)定性、踩踏模式和協(xié)調(diào)性、爪子位置和尾巴位置，最低得分為 0（無腳踝運(yùn)動(dòng)），最高得分為 9（完全功能恢復(fù)）。在術(shù)前和術(shù)后第1、3、7、14、28天進(jìn)行測試，后續(xù)每周進(jìn)行1次，直到第28天^［13］。

1.2.4 脊髓組織的收集和處理

在SCI后的7 d將小鼠處死，并取出脊髓組織。將損傷區(qū)域（損傷中心向兩側(cè)各延伸5 mm）切成兩半，一半用于免疫組織化學(xué)/免疫熒光分析，另一半用于qPCR和Western blotting分析。用于免疫組織化學(xué)/免疫熒光分析的脊髓組織，用40g/L多聚甲醛固定24 h，然后用石蠟包埋，切成5 μm厚的切片。用于qPCR和Western blotting分析的脊髓組織，用液氮凍存，待用。

1.2.5 蛋白免疫印跡分析

將凍存的脊髓組織用蛋白提取試劑裂解并進(jìn)行蛋白定量。然后用SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用50 g/L脫脂奶粉在TBST緩沖液中封閉1 h，然后用相應(yīng)的一抗在4 ℃過夜孵育。洗滌3次后用相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗在室溫下孵育1 h，然后用ECL發(fā)光底物進(jìn)行檢測。用ImageJ軟件進(jìn)行定量分析。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

使用qRT-PCR分析檢測脊髓組織中的PD-L1和炎癥因子的mRNA表達(dá)水平。將凍存的脊髓組織用Trizol試劑提取總RNA，用cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用SYBR Green qPCR試劑盒進(jìn)行定量PCR，以β-actin作為內(nèi)參。用2^-ΔΔCT法計(jì)算相對表達(dá)量。各基因的引物序列見表1。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)分析

分離單核細(xì)胞，將單核細(xì)胞密度調(diào)至10⁷個(gè)/mL。取50 μL單細(xì)胞于流式管中，加入流式抗體IFN-γ FITC、IL-4 APC、 IL-17和FoxP3等，分別標(biāo)記Th1、Th4、Th17和Treg細(xì)胞。室溫染色30 min，離心棄上清，用多聚甲醛重懸細(xì)胞后，利用流式細(xì)胞儀檢測并計(jì)算細(xì)胞比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。行為測試使用重復(fù)測量方差分析（ANOVA），其他多重比較使用單因素方差分析（ANOVA），兩組比較使用雙尾獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PD-L1表達(dá)對SCI小鼠的影響

Western blotting和qRT-PCR檢測SCI后不同時(shí)間點(diǎn)（1、3、7、14、28 d）脊髓組織中的PD-L1的蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，與Sham組相比，SCI組的小鼠在SCI后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，PD-L1的蛋白和mRNA的表達(dá)都顯著上調(diào)（Plt;0.05），并且在SCI后的7 d達(dá)到最高水平（圖1A、1B）。用BMS評分評估SCI后不同時(shí)間點(diǎn)（1、3、7、14、28 d）小鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能，結(jié)果顯示，與Sham WT組相比，SCI WT組的小鼠在SCI后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，BMS評分均顯著降低（Plt;0.05），表明SCI造成了嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)功能障礙。SCI WT組的小鼠在SCI后7、14 d和28 d，BMS評分均顯著高于SCI PD-L1 KO組（Plt;0.05）。檢測SCI WT組和SCI PD-L1 KO組SCI后第7天的脊髓組織中的炎癥因子（IL-1α、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和TNF-α）mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，SCI PD-L1 KO組小鼠 IL-1α、IL-2、IFN-γ和TNF-α水平顯著高于SCI WT組，IL-4和IL-10水平顯著低于SCI WT組（Plt;0.05）。

2.2 PD-L1對SCI小鼠Foxp3 和 p-STAT3 表達(dá)的影響

Western blotting檢測SCI后第7天小鼠的Foxp3 和 p-STAT3 的表達(dá)情況，結(jié)果如圖2所示。與SCI+PBS組和SCI+Ab組相比，SCI+PRO組p-STAT3水平顯著降低（Plt;0.05），F(xiàn)oxp3水平顯著升高（Plt;0.05）。

2.3 PD-L1對SCI小鼠T細(xì)胞亞群的影響

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測SCI后第7天脊髓組織中的T細(xì)胞亞群（Th1、Th2、Th17和Treg）的比例情況（圖3）。與Sham組相比，SCI+PBS組和SCI+Ab組Th1和Th17細(xì)胞水平顯著升高（Plt;0.05），Th2和Treg細(xì)胞水平顯著降低（Plt;0.05）；與SCI+PBS組相比，SCI+PRO組Th1和Th17細(xì)胞水平顯著降低（Plt;0.05），Th2和Treg細(xì)胞水平顯著升高（Plt;0.05）；與SCI+PRO組相比，SCI+Ab組Th1和Th17細(xì)胞水平顯著升高（Plt;0.05）。

2.4 PD-L1對 SCI小鼠Akt-mTOR信號通路的影響

Western blotting檢測了SCI后第7天的脊髓組織中的PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與Sham WT組、Sham PD-L1 KO組和SCI WT組相比，SCI PD-L1 KO組p-PI3K、p-AKT和p-mTOR水平顯著升高（Plt;0.05，圖4A、4B）。與SCI+PBS組相比，SCI+PRO組p-PI3K、p-AKT和p-mTOR水平顯著降低（Plt;0.05），SCI+Ab組p-PI3K、p-AKT和p-mTOR水平顯著升高（Plt;0.05）；與SCI+PRO組相比，SCI+Ab組p-PI3K、p-AKT和p-mTOR水平顯著升高（Plt;0.05）。表明PD-L1蛋白的治療降低了Akt-mTOR信號通路的活性（圖4C、4D）。

3 討 論

SCI是一種復(fù)雜的病理過程，涉及初級機(jī)械性損傷和繼發(fā)性損傷兩個(gè)階段。繼發(fā)性損傷的特點(diǎn)是炎癥反應(yīng)持續(xù)，細(xì)胞凋亡加劇，組織修復(fù)受阻。越來越多的證據(jù)表明，SCI后的免疫失衡，尤其是T細(xì)胞亞群的數(shù)量和功能紊亂，是導(dǎo)致繼發(fā)性損傷的重要原因^［14］。PD-L1是近年來腫瘤免疫治療領(lǐng)域的明星分子。PD-L1通過與T細(xì)胞表面程序性死亡受體（programmed death-1，PD-1）結(jié)合，傳遞抑制性信號，降低T細(xì)胞的活性和細(xì)胞因子的分泌，維持機(jī)體免疫耐受^［15］。在自身免疫性疾病中，PD-L1的表達(dá)往往降低，而利用PD-L1重組蛋白或激動(dòng)劑，能有效控制自身免疫反應(yīng)，減輕組織損傷^［16］。本研究在SCI小鼠模型中，探討了PD-L1對脊髓組織T細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用及其神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，SCI后PD-L1在損傷脊髓局部表達(dá)顯著上調(diào)，提示其參與SCI病理過程的特性。敲除PD-L1后，SCI模型小鼠的運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)一步惡化，炎癥因子水平顯著上升，說明PD-L1具有抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用，這與PD-L1在腦缺血等其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的保護(hù)作用一致^［17-19］。

進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，PD-L1發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的關(guān)鍵在于重塑損傷脊髓局部的T細(xì)胞免疫。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，PD-L1蛋白治療明顯降低了促炎性Th1和Th17細(xì)胞水平，增加了抗炎性Th2和Treg細(xì)胞水平。Treg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)增加，Th17細(xì)胞分化相關(guān)的p-STAT3表達(dá)減少。這提示PD-L1通過糾正Th1/Th2和Treg/Th17平衡，抑制炎癥反應(yīng)，營造有利于組織修復(fù)的免疫微環(huán)境。這一發(fā)現(xiàn)為PD-L1調(diào)控T細(xì)胞免疫在SCI中的應(yīng)用提供了新的思路。

Akt/mTOR信號通路在炎癥反應(yīng)中具有重要的調(diào)控作用。有研究表明，PI3K/Akt通路的持續(xù)激活與SCI后炎癥因子的高表達(dá)密切相關(guān)^［20］。但PI3K/Akt通路與PD-L1之間的相互關(guān)系尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1蛋白治療可顯著抑制SCI后Akt/mTOR通路的活化，表明PD-L1的神經(jīng)保護(hù)作用可能部分通過該通路實(shí)現(xiàn)，但PD-L1與Akt/mTOR通路的具體調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步探索。此外，PD-L1對巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等其他免疫細(xì)胞的影響，以及對神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的直接保護(hù)作用，也是未來研究的重點(diǎn)。

綜上所述，本研究在SCI小鼠模型中揭示了PD-L1通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，并初步探討了其與Akt/mTOR信號通路的關(guān)系。這為深入理解SCI的免疫病理機(jī)制，開發(fā)以PD-L1為靶點(diǎn)的免疫治療新策略奠定了基礎(chǔ)。

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（編輯 張 敏）