摘要：目的 了解引起化膿性肝膿腫（pyogenic liver abscess，PLA）的高毒力肺炎克雷伯菌（Hypervirulent Klebsiella pneumoniae，hvKp）的耐藥機(jī)制、毒力特征及致病作用，同時為該細(xì)菌臨床抗感染治療提供相關(guān)數(shù)據(jù)。方法 收集3株在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院不同科室肝膿腫患者肝臟膿腫液中分離出的肺炎克雷伯菌，用拉絲試驗確定其高毒表型；VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行藥敏試驗；全基因組測序技術(shù)確定其莢膜血清型、多位點序列分型（MLST）、毒力基因與耐藥基因等分子特征；建立小鼠感染模型進(jìn)行致病性試驗。結(jié)果 分離菌株黏性較大，黏液絲牽拉長度＞5 mm，均為高黏液表型；除146007為多重耐藥菌外，其余2株菌的抗生素敏感性較高；其全基因組序列測定顯示，分離菌株均為高毒力型，攜帶毒素質(zhì)粒rmpADC/rmpA2，鐵攝取系統(tǒng)、菌毛及分泌系統(tǒng)等多種毒力因子，3株分離株均為rmpA/rmpA2合并iucA/iutA陽性，可判定為hvKp；檢測到多種耐藥基因，如β-內(nèi)酰胺酶基因bla_TEM、bla_SHV和bla_CTX-M等；分離菌株對小鼠有較強(qiáng)致病性，剖檢死亡小鼠可見其各器官均有不同程度病變。結(jié)論 本文分離出的3株hvKp攜帶多種耐藥基因與毒力基因且致病性較強(qiáng)，提示實驗室和臨床應(yīng)及時識別并采取必要的處置策略，防止hvKp進(jìn)一步擴(kuò)散。

關(guān)鍵詞：高毒力肺炎克雷伯菌（hvKp）；全基因組測序；耐藥性；高毒力菌株；小鼠感染模型

中圖分類號：R378.99+6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.7652/jdyxb202406002

收稿日期：2024-03-11 修回日期：2024-07-14

基金項目：西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床研究項目（No. XJT1AF-CRF-2019-015），陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃項目（No. 2024JC-YBMS-732）

Supported by the Clinical Research Award of the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University， China （No. XJT1AF-CRF-2019-015） and the Natural Science Basic Research Program of Shaanxi Province （No. 2024JC-YBMS-732）

通信作者：雷金娥，主任技師. E-mail：1q2640@163.com

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//kns.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20240821.1419.002.html （2024-08-22）

Biological and genetic characteristics of three hypervirulent Klebsiella pneumoniae strains causing liver abscess

ZHANG Yuqi^1，2， WANG Juan²， HAN Lei³， LI Pu⁴， MA Wentao²， ZHANG Chun⁵， LI Yali¹， YUAN Jing¹， LEI Jin’e¹

（1. Department of Laboratory Medicine， The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University， Xi’an 710061; 2. College of Veterinary Medicine， Northwest Aamp;F University， Yangling 712100; 3. Department of Microbiology and Immunology， School of Basic Medicine， Xi’an Jiaotong University" Health Science Center， Xi’an 710061; 4. Department of Critical Care Medicine， The Second Affiliated" Hospital of Air Force Medical University， Xi’an 710038; 5. Surgical Intensive

Care Unit， The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University， Xi’an 710061， China）

ABSTRACT： Objective To understand the resistance mechanisms， virulence characteristics， and pathogenicity of hypervirulent Klebsiella pneumoniae （hvKp）， which causes pyogenic liver abscess （PLA）， and to provide related data for clinical treatment of infection caused by this type of bacteria. Methods We collected three strains of Klebsiella pneumoniae isolated from the liver abscess fluid of patients with liver abscesses in various departments of The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University. The hypervirulent phenotypes were determined by the wire test， and drug sensitivity was assessed using the VITEK 2 compact automatic microbiological analyzer. Molecular characteristics such as podocarp serotypes， multi-locus sequence typing （MLST）， virulence genes， and drug resistance genes were identified through whole-genome sequencing. Additionally， a mouse infection model was established to evaluate pathogenicity. Results The isolates were sticky， with mucous thread pulling length gt;5 mm， all of which exhibited high viscosity phenotypes. Except 146007， which is a multidrug-resistant bacterium， the other two strains had higher antibiotic sensitivity. Whole genome sequencing revealed that the isolates were of high-virulence type， carrying the toxin plasmid rmpADC/rmpA2， iron uptake system， bacterial hairs， secretion system， and other virulence factors. All the three isolates tested positive for rmpA/rmpA2 combined with iucA/iutA， indicating they could be classified as hvKp. Multiple resistance genes were detected， such as β-lactamase like bla_TEM， bla_SHV， and bla_CTX-M. The isolates were highly pathogenic to mice， as evidenced by the diseased organs of the deceased mice observed on autopsy. Conclusion The three strains of hvKp isolated in this study carried multiple drug-resistant genes and were highly pathogenic， which suggests that in laboratories and clinical practices it is imperative to promptly identify and adopt necessary disposal strategies to prevent further spread of hvKp.

KEY WORDS： hypervirulent Klebsiella pneumoniae （hvKp）; whole genome sequencing; drug resistance; high-virulence strain; mouse infection model

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kp）是一類廣泛存在于動物黏膜表面或環(huán)境（水、土壤等）中的革蘭氏陰性細(xì)菌^［1］，Carl Friedlnder在1882年首次提出Kp是引起肺炎的病原菌，且長期以來一直是最常見的醫(yī)院病原菌^［2］，其逃避免疫系統(tǒng)攻擊的能力、日益增加的抗生素耐藥性和超毒力致病型的出現(xiàn)已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的主要挑戰(zhàn)^［3］。高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae，hvKp）是一種全球性的致病菌，比經(jīng)典肺炎克雷伯菌（classical Klebsiella pneumoniae，cKp）毒性更強(qiáng)^［4］。目前hvKp在全球范圍內(nèi)尤其是亞太地區(qū)的感染率逐漸升高^［5］，可引起社區(qū)獲得性感染，包括化膿性肝膿腫、肺炎、腦膜炎和眼內(nèi)炎等^［6］，免疫功能低下和菌群失調(diào)的人群尤其易感^［7］。hvKp感染通常發(fā)生在多個部位，隨后擴(kuò)散，這使得治療和控制更加困難^［1］。其拉絲試驗通常為陽性，高黏液表型是由于其攜帶了一個毒力質(zhì)粒，該質(zhì)粒攜帶兩個CPS調(diào)節(jié)基因（rmpA和rmpA2）和許多鐵載體基因簇（iroBCD/iucABCD）^［8］。除天然耐藥外，大多數(shù)hvKp很少耐藥，且通常對常用的抗生素敏感。近幾年研究數(shù)據(jù)表明，cKp和hvKp菌株可相互作用，導(dǎo)致碳青霉烯類耐藥的hvKp株出現(xiàn)^［9］。

20世紀(jì)80年代，中國臺灣的病例首次描述了Kp感染引起的肝膿腫^［10］。隨后更多研究發(fā)現(xiàn)Kp是導(dǎo)致化膿性肝膿腫（pyogenic liver abscess， PLA）的主要病原體，其中90.9%是hvKp菌株，并且PLA的發(fā)病率與hvKp菌株的高患病率之間存在相關(guān)性^［11］。為了解導(dǎo)致化膿性肝膿腫的Kp耐藥和致病機(jī)制，本研究對西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院不同科室的肝膿腫患者分離出的3株hvKp進(jìn)行相關(guān)試驗，探討其耐藥機(jī)制和毒力特征，以期為控制hvKp的產(chǎn)生及流行提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

3株Kp分別于2022年7月、2022年9月和2023年4月分離自西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床診斷為肝膿腫患者的肝膿腫穿刺液（肝膽外科ICU 2株，內(nèi)分泌代謝科1株），菌株經(jīng)常規(guī)分離、純化培養(yǎng)后，經(jīng)MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀鑒定為Kp，命名為147062、146007和148003，菌株凍存于西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院重大動物疫病綜合防控與凈化實驗室。

1.1.2 主要試劑及儀器

試劑：細(xì)菌DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，細(xì)菌培養(yǎng)96孔板購自廣州潔特生物過濾股份有限公司，LB肉湯、營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂（MAC）培養(yǎng)基和5%綿羊血培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司，細(xì)菌藥敏卡GM09購自法國BioMrieux公司，替加環(huán)素和頭孢他啶/阿維巴坦等藥敏試劑購自溫州康泰生物科技有限公司，注射用多黏菌素E甲磺酸鈉購自正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，Kp標(biāo)準(zhǔn)株CMCC46117購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心。

儀器：VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)、MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀購自法國BioMrieux公司，SW-CJ-290超凈工作臺購自蘇凈集團(tuán)，LS-30立式壓力蒸汽滅菌鍋購自博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，PYX-DHS-50X65-BS-Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，AUY220電子天平購自奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司，TX-XP-D型PCR儀購自杭州博日科技股份有限公司，JY300C型水平電泳系統(tǒng)購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，BD-BGC1型藍(lán)光切膠儀購自無錫博福瑞德有限公司等。

1.1.3 實驗動物

SPF級BALB/c雌性小鼠57只、雄性小鼠57只，健康狀態(tài)良好，購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司。研究經(jīng)西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院倫理審查通過（倫理審批號：XN2024-0110）。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離鑒定及形態(tài)學(xué)觀察

按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》收集標(biāo)本，經(jīng)局麻后對患者行肝膿腫穿刺引流術(shù)，并對肝膿腫引流液送檢培養(yǎng)。將分離菌株接種于血平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)20～24 h。根據(jù)菌落形態(tài)進(jìn)行革蘭氏染色等初步鑒定，采用MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀進(jìn)一步鑒定菌種，操作過程依據(jù)設(shè)備使用說明書。

將純化后的Kp及標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種于麥康凱培養(yǎng)基和5%綿羊血培養(yǎng)基，37℃溫箱培養(yǎng)12 h，觀察菌落形態(tài)，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢觀察。用接種環(huán)輕觸麥康凱平板過夜培養(yǎng)的菌落，豎直向上輕輕挑起單個菌落，黏液絲牽拉長度gt;5 mm即為陽性高毒力株，稱其為具有高黏液表型，lt;5 mm為陰性^［12］。

1.2.2 藥物敏感試驗

將培養(yǎng)好的Kp轉(zhuǎn)種至血平板并傳代，使用接種環(huán)挑取飽滿菌落并置于生理鹽水中，配制濃度為0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁濃度。使用VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)及配套的GN藥敏卡進(jìn)行藥敏試驗，替加環(huán)素和多黏菌素等藥物采用微量肉湯稀釋法，頭孢他啶/阿維巴坦采用E-test方法，操作方法依據(jù)使用說明書，嚴(yán)格按照操作規(guī)程，藥敏結(jié)果參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）2023推薦的標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)控菌：Kp標(biāo)準(zhǔn)株CMCC46117。

1.2.3 細(xì)菌全基因組測序

3株Kp接種于LB肉湯中，置于搖床37 ℃ 180 r/min過夜培養(yǎng)，使用商品DNA提取試劑盒提取分離菌株DNA，送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行3代全基因組測序。

下載測序獲得的原始數(shù)據(jù)，通過Unicycler對3代測序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝。組裝后的序列文件注釋通過在線軟件Rapid Annotations using Subsystem Technology（RAST）（http：//rast.nmpdr.org/）和本地Prokka完成；耐藥基因和毒素基因分別通過ResFinder 4.1（https：//cge.food.dtu.dk/services/ResFinder/），ISfinder（https：//www-is.biotoul.fr/），Virulence Factor Database（http：//www.mgc.ac.cn/VFs/），Pathogenwatch（https：//pathogen.watch/）， DANMEL（http：//124.239.252.254/danmel/）^［13］和本地blast進(jìn)行檢測。

1.2.4 菌株生長曲線

自5%綿羊血培養(yǎng)基上挑取分離菌株菌落，用無菌生理鹽水稀釋后按照1∶100接種于150 mL LB肉湯中，以37℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)，繪制該菌株在12 h內(nèi)的生長曲線。

1.2.5 小鼠致病性試驗

1.2.5.1 細(xì)菌半數(shù)致死量（LD₅₀）的測定

將3株菌濃度均稀釋為2×10⁷、2×10⁶、2×10⁵、2×10⁴、2×10³和2×10² "CFU/mL。將114只18～20 g的雌、雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為148003攻毒組（36只）、146007攻毒組（36只）、147062攻毒組（36只）和對照組（6只），每組雌、雄性小鼠比例相同。采用腹腔注射方式分別將不同濃度菌液注射給攻毒組，每只0.2 mL，對照組注射同樣劑量的生理鹽水，給予與攻毒組小鼠相同飼養(yǎng)條件。攻毒后，連續(xù)7 d觀察各組小鼠的死亡情況，繪制小鼠生存曲線圖。

1.2.5.2 小鼠器官及切片觀察

在無菌條件下，分別取攻毒組和對照組小鼠的肝、脾、肺、腎、腸等組織，置于40 g/L多聚甲醛溶液固定后，用酒精脫去組織塊中的水份，置于二甲苯中后浸蠟包埋，將石蠟塊切成薄片，燙平后鋪于載玻片上烘干并脫蠟，用蘇木精和伊紅染色，脫水透明后封固并觀察試驗小鼠的組織病理變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行初步整理，以培養(yǎng)時間為X軸、A_{600 nm}值為Y軸，利用軟件Origin 2022繪制分離株的生長曲線；應(yīng)用IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行機(jī)率單位加權(quán)回歸法（Bliss法）計算LD₅₀;計數(shù)資料以n表示，P lt; 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 分離菌株的形態(tài)學(xué)特征

3株分離菌株經(jīng)37℃培養(yǎng)18～24 h，在5%綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上呈灰白色、較大、凸起、黏液狀、不溶血的菌落，在麥康凱平板上形成隆起、粉紅色、黏液狀菌落（圖1），分離Kp經(jīng)革蘭染色后觀察到為革蘭陰性、較粗的短桿菌，呈單個、成雙或短鏈狀排列（圖2）。經(jīng)MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀進(jìn)一步鑒定后，確定3株分離菌株均為Kp。分離菌株黏液絲牽拉長度均＞5 mm，該試驗呈陽性，即分離菌株均為陽性高黏性毒力株；對照CMCC46117標(biāo)準(zhǔn)株黏液絲牽拉長度＜5 mm（圖3）。

2.2 藥物敏感試驗結(jié)果

3株Kp中，2株來自肝膽ICU（146007和147062），1株來自內(nèi)分泌科（148003），藥敏結(jié)果提示，菌株146007的耐藥程度明顯高于148003和147062，148003和147062對所檢測藥物19種抗菌藥物均敏感，包括氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢替坦、氨曲南、亞胺培南、美羅培南、慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明，菌株146007對以上所有檢測藥物均耐藥，僅對替加環(huán)素、黏菌素、頭孢他啶/阿維巴坦鈉敏感。

2.3 細(xì)菌全基因組測序結(jié)果

全基因組序列測定顯示，3株Kp基因組大小、編碼基因數(shù)量和GC含量等特征穩(wěn)定（表1）。

菌株148003、146007和147062的MLST分別為ST23、ST11和ST23；均攜帶毒素耶爾森氏桿菌素和需氧桿菌素；莢膜分別為KL113、KL64和KL107；O位點分別為O1/O2v1、O1/O2v1和O1/O2v2；血清型分別為O2a、O2a和O2afg；均攜帶毒素質(zhì)粒repB_KLEB；分離株攜帶鐵攝取系統(tǒng)、菌毛及分泌系統(tǒng)等多種毒力因子（表2）。

2.3.1 攜帶毒力基因分析結(jié)果

3株分離株均攜帶鐵攝取系統(tǒng)、菌毛及分泌系統(tǒng)等多種毒力因子，包括fimD（Ⅰ型菌毛）、entF、fepA（腸桿菌素）、iutA（氣桿菌素鐵載體）和iroN（沙門菌素）等毒力基因在內(nèi)；其中148003不攜帶氣桿菌素iuc、clpV、gsp和icm，146007不攜帶allB，147062不攜帶impG和ompA（表3）。

2.3.2 攜帶耐藥基因分析結(jié)果

耐藥基因分析顯示：菌株148003和147062均攜帶2種喹諾酮類藥物耐藥基因，1種β-內(nèi)酰胺酶基因和1種磷霉素類藥物耐藥基因；而菌株146007攜帶多種耐藥基因，包含β-內(nèi)酰胺酶基因、喹諾酮類藥物耐藥基因、磷霉素類藥物耐藥基因、磺胺類藥物耐藥基因、四環(huán)素類藥物耐藥基因、甲氧芐啶類藥物耐藥基因和氨基糖苷類藥物耐藥基因（表4）。

2.4 小鼠致病性試驗結(jié)果

148003、146007和147062在12 h培養(yǎng)過程中，菌液A_{600 nm}值持續(xù)上升，對數(shù)生長期菌液對應(yīng)A_{600 nm}值分別在1.1～1.7、0.5～1.5和0.7～2.25之間，1～8 h為對數(shù)生長期，8 h后進(jìn)入平臺期（圖4）。

小鼠攻毒試驗結(jié)果顯示，攻毒組小鼠3 h后精神萎靡、食欲不振甚至廢絕、扎堆，對照組小鼠正常。繪制小鼠生存曲線（圖5），攻毒組小鼠在7 h時開始死亡，22 h后不再出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；148003的小鼠集中在8～16 h死亡，146007的小鼠集中在10～17 h死亡，147062的小鼠集中在7～14 h死亡，表明菌株148003和147062可更快導(dǎo)致小鼠死亡，146007致小鼠死亡的時間較慢。利用IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行機(jī)率單位加權(quán)回歸法（Bliss法）計算得出Kp 148003對小鼠的LD₅₀為2.88×10⁴ CFU/mL，146007對小鼠的LD₅₀為1.29×10⁵ CFU/mL，147062對小鼠的LD₅₀為4.22×10⁴ CFU/mL，表明菌株148003和147062對小鼠具有較強(qiáng)的致病力，146007致病力稍弱。

腹腔注射Kp 148003、146007和147062后，試驗小鼠出現(xiàn)精神沉郁，活動減少，被毛凌亂無光澤，眼睛半睜，眼神無光，眼部伴有滲出物等癥狀，采食和飲水量明顯減少的現(xiàn)象；對照組無異常。剖檢148003的2×10⁷ CFU/mL組死亡小鼠可見肝臟、肺臟腫脹，脾臟變化不明顯，雙腎腫大，腸道有鼓氣現(xiàn)象；146007的2×10⁷ CFU/mL組死亡小鼠可見肝臟、脾臟腫脹并伴有一定程度的出血現(xiàn)象，肺臟出血嚴(yán)重，雙腎腫大，腸道鼓氣并有輕微出血現(xiàn)象；147062的2×10⁷ CFU/mL組死亡小鼠可見肝臟、肺臟腫脹并伴有一定程度的出血現(xiàn)象，脾臟腫大出血嚴(yán)重，雙腎變化不明顯，腸道鼓氣、出血現(xiàn)象明顯；剖檢對照組小鼠發(fā)現(xiàn)無明顯病變（圖6）。

觀察HE染色切片可見，菌株148003攻毒后的小鼠肝臟無出血現(xiàn)象，脾臟、肺臟出血輕微，腎臟出血較嚴(yán)重，腸道病變不明顯；菌株146007攻毒后的小鼠肝臟有出血現(xiàn)象，脾臟有輕微出血現(xiàn)象，肺臟出血較嚴(yán)重，肺泡腔內(nèi)可見大量紅細(xì)胞，腎臟出血較148003和147062嚴(yán)重，腸道有輕微出血現(xiàn)象；菌株147062攻毒后的小鼠肝臟出血較明顯，脾臟出血較148003和146007嚴(yán)重，肺臟出血輕微，腎臟有明顯出血現(xiàn)象，腸道出血較148003和146007嚴(yán)重；對照組小鼠切片無明顯異常（圖7）。

3 討 論

Kp是一種人類機(jī)會性病原體，可導(dǎo)致嚴(yán)重的醫(yī)院獲得性感染^［14］。hvKp是一種進(jìn)化的致病型，其比cKp更具毒性^［15］，但耐藥性降低，相關(guān)數(shù)據(jù)顯示hvKp可能會代替cKp成為臨床主要的致病類型^［16］。hvKp在全球的傳播，使其成為全球毀滅性發(fā)病率和死亡率的潛在原因^［17］。關(guān)于推定的hvKp感染的報告主要根據(jù)其臨床特征和/或陽性線測試（使用接種環(huán)從細(xì)菌菌落產(chǎn)生長度gt;5 mm的黏性），本研

究中3株分離菌株該測試均為陽性。

hvKp菌株的超強(qiáng)毒力部分由毒力質(zhì)粒上的基因或染色體島內(nèi)的基因介導(dǎo)^［18］，大菌株集的生物信息學(xué)分析認(rèn)為與高毒力相關(guān)的基因包括rmpA、rmpA 2、iroBCDN、iutA、iucABCD和ybt基因等，可編碼3種不同的鐵載體系統(tǒng)：沙門菌素（iroBCDN）、需氧菌素（iutA、iucABCD）和耶爾森菌素（ybt）^［19］。本研究的分離菌株均存在不同的攜帶狀況，這些鐵吸收系統(tǒng)可以幫助菌株在缺鐵條件下提供足夠的鐵離子，而發(fā)達(dá)的菌毛可以讓細(xì)菌黏附在人體組織上，促進(jìn)細(xì)菌入侵人體^［20］。全基因組序列測定顯示3株分離菌基因組大小、編碼基因數(shù)量和GC含量等特征穩(wěn)定；MLST、血清型、莢膜血清型和O位點等均不同，但均攜帶毒素質(zhì)粒repB_KLEB。分離菌株148003、146007和147062均攜帶rmpADC/rmpA 2，當(dāng)rmp A/rmp A2合并iuc A/iut A陽性可判定為hvKp^［21-22］，因此可判定在本研究中分離的3株Kp均為hvKp。

小鼠感染模型結(jié)果顯示，分離菌株具有良好的繁殖能力，菌株148003和147062對小鼠的致病力強(qiáng)于146007，提示菌株毒力水平與攜帶的毒力質(zhì)粒高度相關(guān)；不同菌株對小鼠器官的損害不同，這可能與其攜帶不同血清型及莢膜有關(guān)；HE切片結(jié)果提示各器官表現(xiàn)出的傷害并不同，這可能說明分離菌株是先定植于機(jī)體一定部位，引起一定傷害后經(jīng)體內(nèi)傳播引起肝膿腫。這與葉靜等^［23］的研究結(jié)果相似，他們認(rèn)為部分hvKp伴有遷徙性感染，這不僅增加了治療的難度，也提高了患者感染的風(fēng)險。因此，需要對hvKp的感染機(jī)制進(jìn)行更為詳盡的研究，包括對hvKp遷移路徑的探索、在不同宿主環(huán)境下生存和繁殖能力的分析、與宿主免疫系統(tǒng)之間的相互作用等，以更好地理解hvKp的感染機(jī)制，為臨床治療和防控提供更為有效的手段。

本研究中分離出1株碳青霉烯類耐藥的hvKp菌株146007。已有研究證明，碳青霉烯類藥物的廣泛使用可誘導(dǎo)Kp產(chǎn)生獲得性Kp碳青霉烯酶^［24］，當(dāng)這種酶被誘導(dǎo)產(chǎn)生后，它就可水解碳青霉烯類藥物，從而降低藥物對Kp的抗菌效果，甚至使其完全失效。這一過程提示了Kp對抗生素環(huán)境的適應(yīng)性演化，也是當(dāng)前臨床抗感染治療面臨的一大挑戰(zhàn)。因此，深入研究碳青霉烯類藥物誘導(dǎo)獲得性Kp碳青霉烯酶產(chǎn)生的機(jī)制，對于理解和應(yīng)對Kp耐藥性具有至關(guān)重要的意義。

研究發(fā)現(xiàn)，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases，ESBLs）在Kp中廣泛存在^［25］。本研究中分離的3株Kp攜帶多種耐藥基因，其中包括β-內(nèi)酰胺酶基因如超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因bla_CTC-M-65、bla_LAP-2等和碳青霉烯酶基因bla_KPC-2等，提示菌株存在耐藥性加強(qiáng)的可能，也可以推測可能導(dǎo)致菌株產(chǎn)生多重耐藥性，且碳青霉烯類基因位于可移動元件質(zhì)粒上，這或許使菌株的耐藥基因易于傳播^［26］。既往研究認(rèn)為，絕大多數(shù)hvKp菌株對常用抗菌藥物耐藥率極低^［27］，這與我們的臨床信息相似，但與相關(guān)研究有差異^［28-30］，提示在治療過程中不應(yīng)優(yōu)先使用高代抗生素以增加其耐藥性。其中分離株146007的高耐藥性和攜帶多種耐藥基因值得臨床高度關(guān)注，在實際治療中或許應(yīng)注意該菌株的傳播和定植。

hvKp在我國報道以來，其研究大多集中于流行病學(xué)分析層面，臨床和致病性等研究數(shù)量較多，但還不夠明確^［31］，且目前常見的診斷方法主要是臨床癥狀結(jié)合拉絲試驗、基因檢測、鐵載體含量測定等，并未有一種精確診斷的方法^［32］。本研究對西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院不同科室的肝膿腫患者分離出的高毒力Kp進(jìn)行了耐藥性檢測、全基因組測序和小鼠致病性試驗，為致肝膿腫高毒力Kp的臨床治療提供了數(shù)據(jù)參考。結(jié)果提示對于hvKp的耐藥、毒力及致病機(jī)制仍需進(jìn)行更深層次的研究。首先，可以從多個維度對hvKp的耐藥機(jī)制進(jìn)行深入探究，例如解析與耐藥相關(guān)的基因和基因簇，揭示hvKp耐藥性的分子基礎(chǔ)，為開發(fā)新的抗菌藥物提供靶點。其次，可以分析其在不同環(huán)境條件下的生長和代謝特性，以了解其對環(huán)境的適應(yīng)性和毒力的變化，也可由構(gòu)建基因敲除或過表達(dá)菌株，驗證特定基因在毒力中的作用。最后，可以通過研究其在感染過程的黏附、侵入和繁殖過程來探究其致病機(jī)制，或是研究其與宿主細(xì)胞的相互作用，了解其在細(xì)胞內(nèi)的存活和擴(kuò)散方式，之后建立動物感染模型，模擬hvKp在體內(nèi)的感染過程，以更直觀地觀察其致病機(jī)制和病理變化。同時，臨床醫(yī)務(wù)工作者也應(yīng)加強(qiáng)對該細(xì)菌的監(jiān)測，并采取嚴(yán)格的感染控制措施，以防止hvKp的傳播更具威脅性。

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（編輯 張 敏）