摘要：目的" 探討脫氧膽酸（DCA）對人BAR-T細胞氧化應(yīng)激的影響及機制。方法" 體外培養(yǎng)人Barrett上皮細胞株BAR-T，采用不同濃度的DCA（100、200、300 μmol/L）和不同作用時間（30 min、60 min、3 h、6 h）干預(yù)BAR-T細胞。采用Real-time PCR法和Western blotting法檢測環(huán)氧酶-2（COX-2）的mRNA和蛋白表達；采用顯微鏡觀察和流式細胞儀檢測細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量，并與200 μmol/L DCA+ 5 mmol/L ROS清除劑 N-乙酰半胱胺酸（NAC）組進行比較；采用細胞免疫熒光法檢測細胞p65蛋白入核情況，并與200 μmol/L DCA+100 μmol/L NF-κB通路抑制劑吡咯烷二硫代甲酸銨（PDTC）組進行比較。結(jié)果" 與對照組相比，DCA可以顯著升高BAR-T細胞中ROS的含量，呈劑量依賴性，5 mmol/L NAC明顯抑制DCA誘導(dǎo)的ROS釋放。與對照組相比，相同干預(yù)時間下，DCA（200、300 μmol/L組）均可以顯著升高COX-2 mRNA表達。與1 h組相比，200、300 μmol/L DCA 6 h組均可以顯著升高COX-2 mRNA表達。與對照組比較，200 μmol/L DCA可以顯著升高COX-2蛋白表達。同時，200 μmol/L DCA可以促進p65蛋白的入核，PDTC可以抑制DCA的作用。結(jié)論" DCA可能通過升高細胞內(nèi)ROS水平，促進p65蛋白入核以激活NF-κB信號通路，進而上調(diào)COX-2的表達。

關(guān)鍵詞：脫氧膽酸（DCA）；Barrett細胞；氧化應(yīng)激；NF-κB信號通路

中圖分類號：R735.1""" 文獻標志碼：A

DOI：10.7652/jdyxb202404010

收稿日期：2023-12-20" 修回日期：2024-04-25

基金項目：國家衛(wèi)生部臨床重點項目（No. 2007353）；陜西省自然科學(xué)基金青年項目（No. 2020JQ-557）

Supported by the Clinical Key Project of the Ministry of Health （No. 2007353） and Shaanxi Provincial Natural Science Foundation Youth Project（No. 2020JQ-557）

通信作者：張軍，博士，教授，博士生導(dǎo)師. E-mail： jun3z@163.com

網(wǎng)絡(luò)出版地址：https：//link.cnki.net/urlid/61.1399.r.20240510.1648.002 （2024-05-11）

Effects of deoxycholic acid on oxidative stress in Barrett’s

oesophagus cells via ROS/NF-κB pathway

FENG Cheng1， LV Jianrui1， WANG Jin1， ZHANG Jun2

（1. Department of Anesthesiology， The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University，

Xi’an 710004; 2 Department of Gastroenterology， The Second Affiliated Hospital of

Xi’an Jiaotong University， Xi’an 710004， China）

ABSTRACT： Objective" To explore the effects and mechanisms of deoxycholic acid （DCA） on oxidative stress in human BAR-T cells. Methods" The human Barrett epithelial cell line BAR-T was cultured in vitro， and the BAR-T cells were intervened with different concentrations of DCA （100， 200， and 300 μmol/L） and different action time （30 min， 60 min， 3 h and 6 h）. The mRNA and protein expression of COX-2 were detected by Real-time PCR and Western blotting assay. The intracellular reactive oxygen species （ROS） content was detected by direct microscope observation and flow cytometry， and was compared with that of 200 μmol/L DCA + 5 mmol/L NAC （ROS scavenger N-acetylcysteine） group; cellular immunofluorescence was used to detect the entry of cellular p65 protein into the nucleus， which was then compared with 200 μmol/L DCA+ PDTC （100 μmol/L， NF-κB pathway inhibitor） group. Results" Compared to the control group， DCA increased ROS content in BAR-T cells in a dose-dependent manner. Additionally， 5 mmol/L NAC significantly inhibited DCA-induced ROS release. Furthermore， both 200 μmol/L and 300 μmol/L DCA significantly increased COX-2 mRNA expression compared to the control group at the same intervention time. The 6 h groups for both 200 μmol/L and 300 μmol/L DCA showed a significant increase in COX-2 mRNA expression compared to the 1 h group. Compared to the control group， treatment with 200 μmol/L DCA significantly increased the expression of COX-2 protein. Meanwhile， 200 μmol/L DCA promoted the nucleation of p65 protein， which was inhibited by PDTC. Conclusion" DCA activates the NF-κB signaling pathway and upregulates the expression of COX-2 by elevating the intracellular ROS expression and promoting the entry of p65 protein into the nucleus.

KEY WORDS：" deoxycholic acid （DCA）; Barrett cell; oxidative stress; NF-κB signaling pathway

當食管黏膜面對慢性、嚴重的胃食管反流時，食管遠端的鱗狀上皮細胞被柱狀上皮所取代發(fā)生腸化生，形成

Barrett食管（Barrett’s esophagus，BE），也是食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）唯一的癌前病變［1-2］。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，歐美等地人群每年約有2%診斷為BE，其中0.5%～1%將進展為EAC［3］。近年來全球的EAC發(fā)病率迅速增加，在西方國家包括部分亞洲地區(qū)甚至已超過鱗狀細胞癌的發(fā)生率。而EAC患者大多數(shù)診斷即為晚期狀態(tài)，預(yù)后較差，總體生存率約20%。若可以早期診斷進行治療，則5年總生存率高達83%～90%［4］。

臨床發(fā)現(xiàn)單獨的抑酸治療并不能完全預(yù)防BE進展為EAC，而除胃酸因素外，膽汁酸的刺激可能成為重要的驅(qū)動因素。人體中的膽汁酸包括膽酸、鵝脫氧膽酸和脫氧膽酸（deoxycholic acid， DCA），后者是一種次級膽汁鹽，具有較強的細胞毒性［5］。研究發(fā)現(xiàn)，膽汁酸的持續(xù)刺激可誘發(fā)并維持慢性炎癥和腫瘤微環(huán)境，因此EAC也被稱為炎癥相關(guān)性腫瘤?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）被認為是聯(lián)系炎癥和EAC的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，ROS的釋放可以誘導(dǎo)DNA損傷和基因突變的累積，還將內(nèi)源性和外源性腫瘤因子帶入正常的細胞中。ROS的持續(xù)釋放，不但可引起核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路蛋白的磷酸化，而且可通過多種途徑誘導(dǎo)細胞增殖和誘變并抑制凋亡，這些均可以促進正常細胞發(fā)生惡變。環(huán)氧酶-2（cyclooxygenase，COX-2）是前列腺素生物合成中的限速酶，在炎癥介質(zhì)等外界物質(zhì)刺激下生成，并通過促進細胞增殖、降低細胞凋亡率、刺激血管生成和增加侵襲性等促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)，服用塞來昔布和阿司匹林的人群，其BE和EAC的發(fā)病率顯著低于未使用人群。因此，氧化應(yīng)激和COX-2蛋白在BE腺癌變過程中發(fā)揮重要作用。目前關(guān)于膽汁酸的研究多聚焦于EAC，本研究將目光鎖向癌前病變BE，旨在探討DCA在BE中的作用及其相關(guān)機制。

1" 材料與方法

1.1" 實驗材料

上皮細胞培養(yǎng)基-2（美國ScienCell公司），胎牛血清（FBS，美國Gibco公司），DCA（美國Sigma-Aldrich公司），ROS檢測試劑盒（中國碧云天公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光染料檢測試劑盒［Takara生物工程（大連）有限公司］，N-乙酰半胱氨酸（NAC）（西安沃爾森生物技術(shù)有限公司），吡咯烷二硫代甲酸銨（PDTC）（美國Sigma公司），兔抗人COX-2單克隆抗體（美國Abcam公司），兔抗人NF-κB p65多克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司）。

1.2" 細胞培養(yǎng)

人Barrett食管上皮BAR-T細胞株由西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科王進海教授惠贈，系經(jīng)端粒酶活性處理的永生化細胞株。將人BAR-T細胞培養(yǎng)于含80 mL/L FBS的上皮細胞培養(yǎng)基-2中，50 mL/L CO2飽和濕度，37 ℃恒溫的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用含EDTA的2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗，所有實驗均重復(fù)3次。

1.3" Real-time PCR檢測COX-2 mRNA的表達

取對數(shù)生長期BAR-T細胞接種于6孔板，細胞生長至培養(yǎng)瓶的80%進行干預(yù)，分對照組和DCA組（100、200、300 μmol/L，濃度參照本課題組MTT實驗結(jié)果而選定［6］），分別干預(yù)0、1、3、6 h。按說明應(yīng)用Trizol提取細胞總RNA，取1 μg RNA，在20 μL反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行Real-time PCR檢測。β-actin引物序列：上游5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′，下游5′-AGGAAGGAAG-GCTGGAAGAGTG-3′；COX-2引物序列：上游5′-TGCCTGGTCTGATGTATGTATG-3′，下游5′-AGTATTAGCCTGCTTGTCTGG-3′，引物均由北京奧科生物公司合成。每組設(shè)置1個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。從擴增曲線獲得Ct值，計算2-ΔΔCt分析基因相對表達，ΔΔCt＝（Ct靶基因-Ct內(nèi)參基因）實驗組-（Ct靶基因-Ct內(nèi)參基因）對照組。

1.4" 熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測細胞ROS水平

將BAR-T細胞接種于6孔板分組干預(yù)，分別為對照組、ROSup陽性組、DCA組（100、200、300 μmol/L）、NAC（5 mmol/L）+DCA（200 μmol/L）。干預(yù)30 min后，按照每1 mL無血清培養(yǎng)基中加入10 μL H2DCFDA的比例加入，避光于培養(yǎng)箱孵育30 min，每10 min晃動1次以促進細胞攝入探針，然后棄掉培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，胰蛋白酶消化并制成單細胞懸液，每組500 μL，流式細胞儀檢測各組的熒光強度；另外將BAR-T細胞接種于6孔板同樣分組干預(yù)30 min加入探針避光孵育后，不消化細胞直接在熒光顯微鏡下，選擇FITC波長，觀察6孔板中每孔內(nèi)細胞的熒光強度。

1.5" 細胞免疫熒光檢測p65蛋白表達入核情況

BAR-T細胞分為對照組、200 μmol/L DCA組和PDTC（100 μmol/L）+DCA（200 μmol/L）組。干預(yù)30 min，每孔加入40 g/L多聚甲醛1 mL固定后，加入5 mL/L TritonX-100 1 mL，使用與二抗來源相同的含100 mL/L血清的PBS封閉30 min后，直接滴加1∶500稀釋比的兔抗人NF-κB p65抗體避光孵育，4 ℃過夜。滴加二抗，避光于室溫孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）底物顯色法顯色，滴加配制好的0.5 μg/mL DAPI使其充分覆蓋爬片，避光孵育5 min棄去，PBS輕柔洗滌細胞4×5 min，充分洗去多余的DAPI。顯微鏡下觀察。

1.6" 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計分析處理。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，不同作用時間和濃度對BAR-T細胞COX-2 mRNA表達的影響采用多因素方差分析方法，不同濃度組BAR-T細胞COX-2蛋白表達和ROS水平比較采用單因素方差分析后，兩組間采用LSD-t檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2" 結(jié)" 果

2.1" DCA對BAR-T細胞COX-2 mRNA和蛋白表達的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示，不同濃度DCA組干預(yù)相同時間時，隨DCA作用濃度的逐漸增加，COX-2 mRNA的表達逐漸上調(diào)，尤其是200 μmol/L和300 μmol/L干預(yù)6 h組較對照組均顯著上調(diào)（均為Plt;0.05），而300 μmol/L組的上調(diào)稍低于200 μmol/L組，100 μmol/L DCA組雖然也有上調(diào)但是與正常組相比差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義；其次DCA相同干預(yù)濃度的不同作用時間組間比較，COX-2 mRNA的表達上調(diào)均呈現(xiàn)時間依賴性，COX-2 mRNA的表達在200 μmol/L和300 μmol/L干預(yù)6 h組均較干預(yù)1 h組顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；200 μmol/L DCA刺激細胞6 h的COX-2蛋白表達較正常組明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05，圖1）。這與mRNA表達變化結(jié)果一致。提示DCA可以上調(diào)BAR-T細胞COX-2 mRNA和蛋白表達，并且這種上調(diào)作用呈現(xiàn)時間依賴性。

2.2" DCA對BAR-T細胞內(nèi)ROS的影響

顯微鏡下熒光強度顯示，與對照組相比，陽性對照ROSup和DCA均顯著增加BAR-T細胞中ROS的熒光亮度；隨著DCA作用濃度的升高細胞內(nèi)熒光強度逐漸增強；同時NAC可以抑制DCA的這種作用（圖2）。

流式細胞儀檢測結(jié)果與顯微鏡下熒光強度趨勢一致（圖3）。與對照組相比，100 μmol/L DCA并沒有顯著增加細胞內(nèi)ROS含量（P=0.763），200、300 μmol/L DCA組均顯著增加了細胞內(nèi)ROS含量（Plt;0.001），這種作用呈濃度依賴性。此外，鏡下觀察300 μmol/L DCA組細胞貼壁性較差，細胞縮圓，細胞之間間隙增大。這提示300 μmol/L DCA對細胞活性有一定影響。與200 μmol/L DCA組相比，NAC+DCA組細胞內(nèi)ROS含量顯著降低（Plt;0.001），說明NAC可以抑制DCA誘導(dǎo)的細胞內(nèi)ROS含量增加。

2.3" 細胞免疫熒光方法檢測p65蛋白核定位

200 μmol/L DCA處理細胞30 min的p65特異性染色顯示，p65蛋白在細胞核中大量表達，同時熒光強度顯著增強；而對照組細胞中，p65蛋白定位于細胞質(zhì)中，說明NF-κB信號通路處于靜息狀態(tài)；與對照組相比，DCA干預(yù)組的p65蛋白由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移進入細胞核中，PDTC可以抑制DCA誘導(dǎo)的p65入核過程（圖4）。

3" 討" 論

EAC是一種高致死率的惡性腫瘤，在北歐、北美和西歐等地的EAC的發(fā)病率甚至超過食管鱗狀細胞癌［7］。雖然我國仍以食管鱗狀細胞癌為主，但是我國在全球?qū)儆谝粋€高EAC發(fā)病率和死亡率的國家［8］。在長期慢性反酸的患者體內(nèi)，食管上皮被新生的柱狀上皮取代，形成了BE［9］。雖然這種柱狀上皮有利于抵抗反流物產(chǎn)生的損傷，但是這種腸化生改變更容易進展為惡性病變。BE作為EAC的癌前病變備受關(guān)注。

研究發(fā)現(xiàn)，雖然大部分胃食管反流病患者是混合反流類型，但是有進展為BE趨勢的患者多為膽汁反流型［10］。膽汁酸中DCA和熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）是較受關(guān)注的兩種因素［11］。UDCA具有細胞保護和抗凋亡作用。疏水性的膽汁酸DCA具有細胞毒性，通過破壞食管黏膜屏障或者線粒體膜損傷黏膜細胞，還可以通過調(diào)控細胞內(nèi)信號通路而影響細胞功能［12］。DCA導(dǎo)致的表層細胞死亡會刺激基底層細胞的增殖，從而恢復(fù)鱗狀上皮。同時，大量損傷和死亡細胞將吸引炎癥細胞的聚集，如T淋巴細胞和中性粒細胞，這些炎癥細胞在黏膜和黏膜下層大量浸潤并釋放炎癥因子。而且大量免疫細胞還釋放ROS，從而加劇細胞DNA的損傷［13］。本研究探討DCA對培養(yǎng)BAR-T細胞的影響。本課題組前期研究檢測了不同濃度DCA（50、100、150、200、250、300 μmol/L）作用于BAR-T細胞不同時間（1、3、6、12 h）時細胞活性的變化［6］，并結(jié)合其他文獻［14］，本研究選擇濃度為100、200、300 μmol/L的DCA進行實驗。研究證實一定濃度范圍的DCA對BAR-T細胞的活性無明顯影響，這提示BAR-T細胞對DCA可能具有一定的凋亡抵抗作用。這可能是促進BE腺癌變的機制之一。

目前認為EAC由氧化應(yīng)激和炎癥驅(qū)動而發(fā)生［15］，因此EAC也被稱為炎癥相關(guān)性腫瘤。從食管炎到BE到EAC的發(fā)展過程中，一方面ROS等氧化應(yīng)激產(chǎn)物的含量逐漸升高，另一方面抗氧化酶呈現(xiàn)出功能障礙和數(shù)量減少的趨勢。由于大量的抗氧化酶功能障礙，使得食管上皮細胞對膽汁酸的暴露更加敏感，進一步促進細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終導(dǎo)致DNA的損傷和有害突變基因的積累。另外，有一些抗氧化酶如GPX3和GPX7同時還具有抗腫瘤的作用［16］。在慢性膽汁酸的刺激下，這些細胞抗氧化酶的功能失調(diào)不但促進氧化應(yīng)激的發(fā)生，同時還促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，ROS反應(yīng)產(chǎn)生的氧固醇、氧化磷脂等脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物可以激活還原型輔酶Ⅱ氧化酶（NADPH oxidase， NOX）的活性而加劇氧化應(yīng)激［17］，NOX可以將分子形式的氧轉(zhuǎn)化為超氧離子，即NF-κB信號通路的上游激活物。NF-κB在經(jīng)典途徑中，靜息狀態(tài)下細胞質(zhì)中的p50-p65與抑制NF-κB活化的阻礙蛋白IκB形成穩(wěn)定的三聚體。在受到外界刺激后，引起IκB-α的磷酸化，進而與p50-p65二聚體分解。p50-p65二聚體轉(zhuǎn)移入核，與相應(yīng)靶基因上的位點特異性結(jié)合，從而調(diào)控細胞的各種生物學(xué)功能。NF-κB是聯(lián)系炎癥與Barrett相關(guān)性食管腺癌的關(guān)鍵信號分子［18］。大量研究證實，隨著BE癌變進展，NF-κB的活化逐漸增強［19］。本研究也證實了NF-κB的激活可能與DCA上調(diào)的ROS有關(guān)。DCA顯著增加BAR-T細胞內(nèi)ROS的含量，呈劑量依賴性，而ROS清除劑NAC可以抑制這種作用。同時，DCA可以促進NF-κB靶蛋白的入核，NF-κB抑制劑PDTC可阻止DCA的這種作用。這說明DCA通過增加細胞內(nèi)ROS含量促進p65的入核過程，進而發(fā)揮促氧化應(yīng)激的作用。

環(huán)氧合酶（COX）是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素過程中的限速酶。目前發(fā)現(xiàn)COX有兩種異構(gòu)體，即COX-1和COX-2。COX-2是一種誘導(dǎo)型酶，只有受到外界刺激，如細胞因子、炎癥介質(zhì)和生長因子等的誘導(dǎo)后其表達才增加。COX-2通過促進細胞增殖、刺激血管的生成和增加腫瘤細胞侵襲性，在癌癥發(fā)生發(fā)展中有關(guān)鍵作用［20］。流行病學(xué)研究證實，選擇性COX-2抑制劑塞來昔布的應(yīng)用可降低EAC發(fā)展的風(fēng)險［21］。有研究發(fā)現(xiàn)，DCA通過調(diào)控PPARα和CREB（cyclic AMP responsive element-binding protein 1），誘導(dǎo)COX-2的表達［22］。本研究證實DCA可以上調(diào)BAR-T細胞中COX-2的表達，這可能是通過直接刺激細胞釋放大量ROS并激活NF-κB信號通路而實現(xiàn)。這提示DCA可能通過多條信號通路以誘導(dǎo)COX-2的表達。

目前脫氧膽酸的研究多聚焦在EAC中，本研究將目光鎖定癌前病變BE，探討了DCA在食管黏膜癌變之前產(chǎn)生的作用，這為尋找潛在的抗氧化藥物提供理論基礎(chǔ)和治療思路，具有更好的臨床意義。本研究的不足是僅在細胞層面探討了DCA對BE氧化應(yīng)激的影響，后期將完善動物研究的論證；本研究也僅探討了DCA對ROS清除的影響，后期研究需進一步完善DCA對ROS生成的相關(guān)調(diào)控。

綜上所述，脫氧膽酸通過促進BAR-T細胞內(nèi)大量ROS的釋放形成了氧化應(yīng)激狀態(tài)，同時激活NF-κB信號通路上調(diào)COX-2的表達。本研究初步探討了DCA的促氧化應(yīng)激作用，為尋找更安全有效的抗氧化藥物治療提供理論基礎(chǔ)和作用靶點。

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（編輯" 國" 榮）