摘要：目的" 研究肝纖維化小鼠脾臟對肝臟中巨噬細(xì)胞活化肝星狀細(xì)胞作用的影響。 方法" 18只雄性C57BL/6小鼠隨機分為3組，A、B組注射CCl4制備肝纖維化模型，C組注射玉米油作為正常對照組。4周后，A、B組分別行脾切除術(shù)（切脾組）或假手術(shù)（有脾組）。繼續(xù)注射2周后取材3組小鼠肝臟，制備肝臟勻漿（L-Homo）并分離肝臟細(xì)胞。Luminex檢測3組L-Homo中IL-1β、IL-13、TGF-β、TNF-α、PDGF-β、VEGF的表達(dá)；RT-qPCR與流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步觀察如上因子在

A、B組肝臟巨噬細(xì)胞（L-Mφ）及肝臟其他單個核細(xì)胞中的表達(dá)。利用A/B組L-Homo分別進(jìn)行體外處理，以模擬脾臟存在與否時肝臟微環(huán)境對巨噬細(xì)胞的影響。收集接受不同L-Homo處理的巨噬細(xì)胞，一方面利用RT-qPCR比較其中細(xì)胞因子與谷氨酰胺合成/分解酶與谷氨酰胺轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)差異；另一方面與肝星狀細(xì)胞JS1進(jìn)行共培養(yǎng)，分析其對JS1存活與胞外基質(zhì)表達(dá)的影響。組間比較使用Student’s t檢驗（兩組間）或單因素方差分析（多組間）。 結(jié)果" 與正常對照組相比，IL-1β、IL-13、TGF-β與TNF-α的濃度在模型組L-Homo中顯著升高，且在模型有脾組中顯著高于切脾組；其中巨噬細(xì)胞是表達(dá)這些細(xì)胞因子的主要細(xì)胞類型群。相較于切脾組，有脾組L-Homo體外處理上調(diào)巨噬細(xì)胞中IL-1β、TGF-β、TNF-α等細(xì)胞因子以及谷氨酰胺酶的表達(dá)，并且促進(jìn)巨噬細(xì)胞發(fā)揮活化肝星狀細(xì)胞胞外基質(zhì)分子表達(dá)的能力。結(jié)論" 脾臟參與調(diào)控L-Mφ炎性因子表達(dá)，增強其活化肝星狀細(xì)胞的能力。

關(guān)鍵詞：脾臟；肝臟巨噬細(xì)胞；炎性細(xì)胞因子；肝星狀細(xì)胞；谷氨酰胺代謝

中圖分類號：R365;R657.3""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.7652/jdyxb202404008

收稿日期：2023-11-12" 修回日期：2024-04-26

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（No. 82101915）；西安交大基礎(chǔ)臨床融合項目（No. YXJLRH2022099）；西安交大二附院自由探索項目［No. 2020YJ（ZYTS）546-01］

Supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 82101915）， Basic-Clinical Fusion Project of Xi’an Jiaotong University （No.YXJLRH2022099）， and Free Exploration Project of The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University ［No. 2020YJ（ZYTS）546-01］

通信作者：李宗芳，教授，主任醫(yī)師. E-mail： lzf2568@xjtu.edu.cn

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//kns.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20240618.1016.002.html （2024-06-19）

Effect of spleen on the ability of hepatic macrophages to activate hepatic

stellate cells in the progression of liver fibrosis

ZHANG Shaoying1， WAN Dan1， DENG Xi3， LIANG Xiao1， LIANG Fanfan1，

ZHANG Chongyu1， ZHU Jiazhen2， ZHAO Yang1， LI Zongfang1，2，3

（1. National amp; Local Joint Engineering Research Center of Biodiagnosis amp; Biotherapy;

2. Shaanxi Provincial Clinical Medical Research Center for Liver and Spleen Diseases;

3. Department of Geriatric General Surgery， The Second Affiliated Hospital of

Xi’an Jiaotong University， Xi’an 710004， China）

ABSTRACT： Objective" To investigate the effect of spleen on hepatic macrophages mediated activation of hepatic stellate cells （HSCs） in mice with liver fibrosis. Methods" Eighteen male C57BL/6 mice were randomly divided into three groups. Mice in Group A and Group B were injected intraperitoneally with CCl4 to establish liver fibrosis mouse model， while those in Group C were injected with corn oil as normal control. Four weeks later， mice with liver fibrosis received splenectomy （Spx） or sham operation （Sham）， respectively. After continuous injection for 2 weeks， liver homogenates （L-Homo） were prepared and liver cells were isolated from the three groups. Expressions of IL-1β， IL-13， TGF-β， TNF-α， PDGF-β and VEGF in the liver homogenates of the three groups were detected by Luminex multifactor analysis. The expressions of these cytokines in liver macrophages （L-Mφ） and other non-parenchymal cells of Sham and Spx mice were analyzed by Real-time quantitative PCR （RT-qPCR） and flow cytometry. Macrophage cell line RAW264.7 or bone marrow-derived macrophages （BMDMs） were treated with liver homogenates from the Sham and Spx groups. Then the differently treated RAW264.7 cells were analyzed for mRNA expressions of cytokines and glutamine metabolism-related molecules by RT-qPCR， or transwell co-cultured with hepatic stellate cell line JS1. After co-culture， the survival and extracellular matrix expression of JS1 cells were analyzed. For comparison， Student’s t test （between two groups） or one-way analysis of variance （among multiple groups） were used. Results" Compared with normal control group， the concentrations of IL-1β， IL-13， TGF-β and TNF-α in the L-Homo of model group were significantly increased and showed higher levels in Sham group than in Spx group. Moreover， the hepatic macrophages were indicated as the major source of these cytokines. Consistently， macrophages treated with liver homogenate of Sham mice had increased expressions of IL-1β， TGF-β and TNF-α and glutaminase （GLS）. After co-culture with macrophages treated with liver homogenate of Sham group rather than Spx group， JS1 expressed higher expressions of α-SMA and collagens. Conclusion" The spleen is involved in regulating the secretion of cytokines by hepatic macrophages and enhancing their ability to activate hepatic stellate cells.

KEY WORDS：" spleen; hepatic macrophage; inflammatory cytokine; hepatic stellate cell; glutamine metabolism

肝纖維化發(fā)生過程中，巨噬細(xì)胞是為肝星狀細(xì)胞提供活化信號的重要細(xì)胞，主要通過旁分泌因子提供刺激信號［1-3］。肝纖維化進(jìn)程中，啟動巨噬細(xì)胞炎性因子分泌的機制復(fù)雜多樣，深入探索有望更詳盡地解析肝纖維化進(jìn)展過程。脾臟加重肝纖維化，促進(jìn)肝臟中巨噬細(xì)胞積累的作用已多見報道［4-5］，然而，脾臟是否影響肝臟中巨噬細(xì)胞功能活化還有待進(jìn)一步闡明。本研究通過對肝纖維化進(jìn)程中脾臟存在與否的小鼠肝臟巨噬細(xì)胞進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，脾臟具有促進(jìn)肝臟巨噬細(xì)胞分泌炎性因子及活化肝星狀細(xì)胞的能力，并提出脾臟促進(jìn)肝臟巨噬細(xì)胞炎性因子表達(dá)的作用可能與其對巨噬細(xì)胞中谷氨酰胺酶的代謝調(diào)控有關(guān)，為脾臟參與肝纖維化進(jìn)展調(diào)控提供了新機制。

1" 材料與方法

1.1" 實驗動物與試劑

雄性C57BL/6小鼠，6～7周，體質(zhì)量20～22 g，購自江蘇集萃藥康公司；RAW264.7細(xì)胞株購自ATCC，JS1細(xì)胞株由復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院郭津生教授贈送；高糖DMEM培養(yǎng)基、無谷氨酰胺高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自Hyclone；ANNEXIN V-FITC凋亡檢測試劑盒購自碧云天公司； PrimeScript 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM 實時定量PCR試劑盒購自Takara公司；流式抗體購自Biolegend公司；轉(zhuǎn)錄因子用固定破膜試劑盒購自BD Bioscience；Luminex多因子檢測試劑盒來自Ramp;D由上海華盈公司代為檢測；RT-qPCR用引物于上海生工合成。

1.2" 動物模型及分組

18只雄性C57BL/6小鼠隨機分為A、B、C 3組（6只/組），A、B組按照2 mL/kg體質(zhì)量劑量腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為20%的CCl4玉米油溶液制備肝纖維化模型，C組注射玉米油作為正常對照組，每周2次，連續(xù)注射6周。造模成功后，A組行脾切除手術(shù)（模型切脾組），B組行假手術(shù)，只打開腹腔而不切脾，再縫合（模型有脾組）。術(shù)后3 d繼續(xù)注射CCl4，2周后取材，制備肝臟單細(xì)胞懸液與肝臟勻漿，分別用于流式檢測、多因子分析及細(xì)胞分離。另有多批次C57BL/6小鼠用于制備骨髓來源的巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophage， BMDM）。

1.3" 小鼠肝臟勻漿的制備

取材小鼠肝臟，按照1 g肝組織/mL 培養(yǎng)基加入無血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，于1.5 mL EP管中用組織研磨棒研磨（冰上）至無明顯組織塊。10 000 rcf 離心10 min，收集上清，分裝后儲存于-80 ℃冰箱備用。

1.4" 小鼠肝臟細(xì)胞的分離

Percoll密度梯度離心法（40%+70% Percoll）制備肝臟單個核細(xì)胞懸液，按照說明書利用F4/80磁珠富集F4/80+細(xì)胞（巨噬細(xì)胞），未經(jīng)富集的陰性細(xì)胞即為肝臟其他單個核細(xì)胞，用作對照。

1.5" 小鼠BMDM細(xì)胞的制備

取材小鼠股骨、脛骨，使用注射器將骨髓從腿骨中吹出，并將細(xì)胞過篩（70 μm篩網(wǎng)）。收集細(xì)胞，利用含有20 ng/mL M-CSF的誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸，鋪板。細(xì)胞培養(yǎng)期間每3 d進(jìn)行半換液，第7天時全換液，培養(yǎng)9 d后可用于后續(xù)實驗。

1.6" 細(xì)胞培養(yǎng)

使用DMEM高糖培養(yǎng)基+100 mL/L FBS+1%青鏈霉素作為巨噬細(xì)胞RAW264.7的完全培養(yǎng)基，37 ℃、50 mL/L CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長至90%時傳代，PBS洗滌后加入適量培養(yǎng)基吹下細(xì)胞，取適量細(xì)胞傳代培養(yǎng)。肝臟勻漿處理RAW264.7或BMDM細(xì)胞，用勻漿∶完全培養(yǎng)基=1∶2的比例（補齊FBS至終濃度為100 mL/L），處理40 h。使用DMEM高糖培養(yǎng)基+150 mL/L FBS + 1%青鏈霉素作為JS1肝星狀細(xì)胞的完全培養(yǎng)基，37 ℃、50 mL/L CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞貼壁長至90%時傳代，PBS洗滌后加入胰酶消化1 min，完全培養(yǎng)基終止消化，200 rcf離心3 min，取沉淀吹散混勻后傳代培養(yǎng)。

1.7" Trans-well共培養(yǎng)

JS1細(xì)胞按照5×104/孔鋪板于24孔板，培養(yǎng)24 h后長至約1.5×105，在孔中加入trans-well小室，按照3×105/孔將經(jīng)不同組肝臟勻漿處理的RAW264.7或BMDM細(xì)胞鋪于小室中，共培養(yǎng)40 h后收集JS1細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.8" 流式分析

檢測細(xì)胞凋亡時，收集共培養(yǎng)后進(jìn)行血清饑餓處理12 h的JS1細(xì)胞，PBS洗滌后，按照凋亡檢測試劑盒說明書，用1×binding buffer重懸細(xì)胞至1×106 /mL，ANNEXIN V-FITC避光染色10 min，然后PI避光孵育5 min，1 h內(nèi)流式檢測。胞內(nèi)因子檢測時，先進(jìn)行表面分子標(biāo)記，再按照試劑說明破膜固定、進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子的標(biāo)記，完成后流式檢測。

1.9" RT-qPCR檢測基因mRNA表達(dá)

細(xì)胞總RNA提取采用Trizol法，按照Invitrogen 公司說明書進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行熒光定量PCR，擴增條件為

95 ℃ 5 min， 95 ℃ 10 s， 60 ℃ 1 min， 40個循環(huán)，2-ΔΔCt法計算各目的基因相對表達(dá)。PCR用引物均于上海生工公司合成，引物序列見表1。

1.10" 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用Graphpad Prism 8.0.2軟件作圖，IBM SPSS statistics 25 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，組間比較使用Student’s t檢驗（兩組間）或單因素方差分析（多組間，并進(jìn)行事后多重比較），以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2" 結(jié)" 果

2.1" 脾臟上調(diào)纖維化肝臟巨噬細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)

相較于正常對照組（Ctrl），模型組小鼠肝纖維化明顯，肝臟勻漿中細(xì)胞因子IL-1β、IL-13、TGF-β與TNF-α的濃度顯著升高；模型小鼠中，有脾組（Sham）纖維化程度較切脾組（Spx）嚴(yán)重，并且肝臟勻漿中IL-1β、IL-13、TGF-β與TNF-α的濃度高于切脾組（F=13.305， Plt;0.01; F=38.129， Plt;0.001; F=12.719， Plt;0.01; F=41.158， Plt;0.001；圖1A、1B）。模型有脾組小鼠肝臟中，巨噬細(xì)胞（Mφ）較其他單個核細(xì)胞（Mφ-depleted）的Il-1b、Il-13、Tgf-b、Tnf-a與Pdgf-b

mRNA表達(dá)更高；同時有脾組肝臟巨噬細(xì)胞相較切脾組肝臟巨噬細(xì)胞的Il-1b、Tgf-b與Tnf-a表達(dá)更高（Plt;0.05，圖1C），其中IL-1β與TGF-β在有脾組的升高也在流式檢測中進(jìn)行了驗證（t=3.617， Plt;0.05; t=5.920， Plt;0.01; 圖1D）。

2.2" 脾臟通過影響肝臟微環(huán)境調(diào)控肝臟巨噬細(xì)胞中炎性因子的表達(dá)

利用模型有脾組與切脾組小鼠肝臟勻漿分別對巨噬細(xì)胞RAW264.7進(jìn)行體外處理發(fā)現(xiàn)，經(jīng)有脾小鼠處理組的RAW264.7中Il-1b、Il-13、Tgf-b、Tnf-a、Pdgf-b、Vegf表達(dá)顯著高于切脾小鼠處理組（Il-1b， t=6.428，Plt;0.01; Il-13， t=3.710， Plt;0.05; Tgf-b， t=15.712，Plt;0.001; Tnf-a， t=6.805，Plt;0.01; Pdgf-b， t=7.005，Plt;0.01; Vegf， t=13.72，Plt;0.001; 圖2A），這與直接分離自兩組小鼠的原代肝臟巨噬細(xì)胞特征相似。對BMDM細(xì)胞進(jìn)行同樣處理發(fā)現(xiàn)，相較切脾組及普通培養(yǎng)基處理的對照組，經(jīng)有脾組肝臟勻漿處理的BMDM細(xì)胞增殖最為顯著，長出更多偽足（圖2C）；各細(xì)胞因子表達(dá)升高，其中Il-13、Tgf-b與Tnf-a水平顯著高于切脾處理組（Il-13， t=6.423，Plt;0.01; Tgf-b， t=38.322，Plt;0.001; Tnf-a， t=4.994，Plt;0.01; 圖2C）。

2.3" 脾臟通過影響肝臟微環(huán)境增強巨噬細(xì)胞活化肝星狀細(xì)胞的能力

將肝星狀細(xì)胞JS1與經(jīng)兩組肝臟勻漿處理的RAW264.7或BMDM細(xì)胞分別進(jìn)行共培養(yǎng)，并以與未經(jīng)處理的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)作為對照組，比較JS1細(xì)胞存活及活化能力差異。結(jié)果顯示，共培養(yǎng)組與對照組細(xì)胞抗凋亡能力相當(dāng)，兩共培養(yǎng)組之間也未見顯著差異（圖3A）；與經(jīng)有脾組肝臟勻漿處理的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的JS1細(xì)胞中α-SMA （Acta2基因編碼）、Ⅰ 型及Ⅲ型膠原的表達(dá)水平顯著高于對照組或切脾組（RAW264.7： Acta2， F=12.508，Plt;0.01；Col1， F=12.151，Plt;0.01；Col3， F=21.856，Plt;0.01;BMDM： Acta2， F=4.896，Plt;0.05；Col1， F=34.528，Plt;0.001；Col3， F=23.511，Plt;0.01; 圖3B、3C）。

2.4" 脾臟對肝臟巨噬細(xì)胞炎性因子的表達(dá)調(diào)控與谷氨酰胺代謝相關(guān)

比較經(jīng)不同組肝臟勻漿處理的RAW264.7細(xì)胞中谷氨酰胺代謝相關(guān)分子的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，有脾組中谷氨酰胺轉(zhuǎn)運蛋白（Asct2）的表達(dá)與切脾組未見顯著差異，谷氨酰胺合成酶（Glul）與谷氨酰胺分解關(guān)鍵酶谷氨酰胺酶（Gls）表達(dá)較切脾組顯著上調(diào)，但Gls的上調(diào)（t=13.965， Plt;0.001）顯著強于Glul（t=3.506， Plt;0.05，圖4A），提示有脾組中谷氨酰胺分解過程發(fā)揮更加重要的作用。在RAW264.7培養(yǎng)體系中缺失谷氨酰胺（Gln-deplete）時，巨噬細(xì)胞中Il-13、Tgf-b、Tnf-a的表達(dá)水平顯著高于完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的對照組（Il-13， t=9.264， Plt;0.01; Tgf-b， t=35.767， Plt;0.001; Tnf-a， t=11.263， Plt;0.001; 圖4B）。利用谷氨酰胺缺失培養(yǎng)基培養(yǎng)BMDM細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)，其中Tgf-b與Tnf-a的表達(dá)水平顯著高于對照組（Tgf-b， t=10.364， Plt;0.001; Tnf-a， t=5.384， Plt;0.01; 圖4C）。結(jié)合有脾小鼠的原代肝臟巨噬細(xì)胞與經(jīng)有脾組肝臟勻漿處理的巨噬細(xì)胞中TGF-β與TNF-α 表達(dá)均升高，提示肝臟巨噬細(xì)胞中TGF-β與TNF-α的表達(dá)受谷氨酰胺分解代謝調(diào)控，并且在脾臟促進(jìn)肝臟巨噬細(xì)胞活化肝星狀細(xì)胞這一過程中發(fā)揮重要作用。

3" 討" 論

肝纖維化是在各種損傷因素刺激下導(dǎo)致肝臟組織發(fā)生病理性改變、肝功能損傷的炎性過程。肝臟受損時，肝星狀細(xì)胞從靜息態(tài)的纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為活化態(tài)的成肌纖維細(xì)胞，表達(dá)平滑肌肌動蛋白（α-SMA），分泌大量膠原等細(xì)胞外基質(zhì)分子，導(dǎo)致胞外基質(zhì)過度沉積、形成肝纖維化［6］。肝臟巨噬細(xì)胞是為肝星狀細(xì)胞活化信號的主要細(xì)胞，以旁分泌炎性因子及促纖維化因子的形式為毗鄰的肝星狀細(xì)胞提供活化與增殖信號。其中，巨噬細(xì)胞分泌的PDGF、VEGF刺激活化的肝星狀細(xì)胞增殖、存活及遷移［7-9］；IL-4、IL-13、TGF-β等直接刺激活化的肝星狀細(xì)胞合成膠原［1-2， 10］；IL-1β、TNF-α為活化的肝星狀細(xì)胞提供存活信號［3， 11］；TNF-α還會上調(diào)肝星狀細(xì)胞中組織金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP1）促進(jìn)纖維化進(jìn)展［12］。我們的前期研究在大鼠與小鼠肝纖維化模型中均證實，脾臟加重肝纖維化進(jìn)展，并通過為纖維化肝臟提供單核-巨噬細(xì)胞（MoMFs）影響肝臟中巨噬細(xì)胞的數(shù)量及組成［4-5］。然而，脾臟對巨噬細(xì)胞的功能及活化如何影響尚未闡明。本研究發(fā)現(xiàn)，脾臟存在時纖維化肝臟巨噬細(xì)胞表達(dá)更高水平的細(xì)胞因子IL-1β、IL-13、TGF-β與TNF-α，提示脾臟也可能通過促進(jìn)肝臟巨噬細(xì)胞對肝星狀細(xì)胞的活化作用參與肝纖維化進(jìn)展。

鑒于在體研究巨噬細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞之間相互作用不易實現(xiàn)，本研究利用纖維化有脾組或切脾組小鼠的肝臟勻漿體外處理巨噬細(xì)胞，嘗試模擬脾臟存在與否的纖維化小鼠肝臟微環(huán)境對巨噬細(xì)胞的影響。結(jié)果證實經(jīng)有脾組小鼠肝臟勻漿處理的巨噬細(xì)胞表達(dá)更高水平的IL-1β、TGF-β與TNF-α，這與其在肝內(nèi)原代巨噬細(xì)胞的情況類似。同時明確，經(jīng)肝纖維化有脾組小鼠肝臟勻漿處理的巨噬細(xì)胞具有更強的上調(diào)肝星狀細(xì)胞表達(dá)胞外基質(zhì)作用的能力，進(jìn)一步表明脾臟可能通過影響肝臟微環(huán)境參與調(diào)控肝臟巨噬細(xì)胞分泌炎性因子及活化肝星狀細(xì)胞的能力。

研究表明，谷氨酰胺治療可以有效減輕肝損傷和氧化應(yīng)激［13］；谷氨酰胺分解則會活化肝星狀細(xì)胞，加重肝纖維化［14］。同時，谷氨酰胺水平與巨噬細(xì)胞黏附、吞噬、M2型極化等功能調(diào)控相關(guān)［15-16］。本研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺分解過程中首先被活化的谷氨酰胺酶GLS的表達(dá)在經(jīng)纖維化脾臟組小鼠肝臟勻漿處理的巨噬細(xì)胞中顯著升高；谷氨酰胺缺失時，巨噬細(xì)胞表達(dá)更高水平炎性因子。這些結(jié)果提示，脾臟組肝臟巨噬細(xì)胞中GLS升高，分解谷氨酰胺可能是上調(diào)細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子表達(dá)的重要機制［17］。這一結(jié)論的得出仍需要進(jìn)一步的實驗研究為肝臟巨噬細(xì)胞谷氨酰胺分解與其活化肝星狀細(xì)胞作用之間的聯(lián)系提供證據(jù)。

同時，更深一層研究中，隨著更多參與肝臟免疫調(diào)控的脾臟來源細(xì)胞或分子的揭示，脾臟調(diào)控肝臟巨噬細(xì)胞效應(yīng)功能、促進(jìn)其活化肝星狀細(xì)胞作用的機制將被更好地闡明。

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（編輯" 張" 敏）