摘要：

目的" 通過(guò)NaOH溶液的簡(jiǎn)單處理構(gòu)建3D打印PLLA/β-TCP骨組織工程支架表面多孔結(jié)構(gòu)，增加支架的粗糙度和親水性，促進(jìn)支架表面的細(xì)胞黏附。方法" 通過(guò)3D 打印熔融沉積成型技術(shù)制備PLLA/β-TCP網(wǎng)狀支架，并通過(guò)NaOH蝕刻的方法進(jìn)行支架的粗糙化改性，依據(jù)支架表面微觀形貌、能譜、接觸角、力學(xué)、細(xì)胞黏附等觀察NaOH濃度、時(shí)間兩項(xiàng)反應(yīng)參數(shù)對(duì)支架的影響。結(jié)果" 通過(guò)熔融沉積成型技術(shù)制備的PLLA/β-TCP復(fù)合支架存在預(yù)先設(shè)置的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；經(jīng)NaOH蝕刻構(gòu)建了兼有宏觀和微觀空隙的多孔形態(tài)。NaOH濃度、時(shí)間中任意一種參數(shù)的增加都會(huì)導(dǎo)致支架表面微觀孔隙的孔徑、孔密度增加。NaOH處理參數(shù)為0.1 mol/L（9 h）時(shí)，可顯著減小支架表面水接觸角，且對(duì)支架的壓縮強(qiáng)度無(wú)顯著影響。體外細(xì)胞檢測(cè)顯示，經(jīng)NaOH蝕刻后的表面多孔復(fù)合支架在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的黏附增殖上更具優(yōu)勢(shì)。結(jié)論" 用NaOH處理3D打印PLLA/β-TCP骨組織工程支架可有效改善支架表面形態(tài)，優(yōu)化該類支架的親水性及細(xì)胞黏附。

關(guān)鍵詞：PLLA/β-TCP；3D打?。还墙M織工程支架；NaOH；細(xì)胞黏附

中圖分類號(hào)：R318.08"""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.7652/jdyxb202403012

收稿日期：2023-12-19" 修回日期：2024-02-26

基金項(xiàng)目：陜西省教育廳青年創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（No. 22JP078）；陜西省科技廳重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃一般項(xiàng)目（No. 2024SF-YBXM-270）；西安醫(yī)學(xué)院科研能力提升計(jì)劃項(xiàng)目（No. 2022NLTS091）；口頜系統(tǒng)疾病機(jī)制及防治創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目（No. 2022TD-54）

Supported by The Youth Innovation Team Project of Shaanxi Universities （No. 22JP078）， General Project of Key Research and Deve-lopment Plan of Shaanxi Provincial Science and Technology Department （No. 2024SF-YBXM-270）， Xi’an Medical College Research Capability Enhancement Program （No. 2022NLTS091）， and Innovative Team for the Mechanism and Prevention of Diseases in the Oral and Maxillofacial System （No. 2022TD-54）

通信作者：劉昌奎，教授. E-mail：liuchangkui@xiyi.edu.cn

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//kns.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20240312.1726.002.html （2024-03-14）

Construction of porous structure on the surface of PLLA/β-tricalcium

scaffold and its effect on cell adhesion

ZENG Hui1，2，3， GUO Fang1，2，3， HUANG Shuo1，2，3，

LIU Ning1，2，3， GUO Yayuan1，2，3， ZHANG Yuqi4， LIU Changkui1，2，3

（1. Department of Stomatology， Xi’an Medical College， Xi’an 710021; 2. Research Center of

Tooth and Maxillofacial Tissue Regeneration and Restoration， Xi’an 710021; 3. Engineering

Research Center for Oral Biomaterials and Advanced Equipment， Universities of Shaanxi Province，

Xi’an 710021; 4. School of Stomatology， Lanzhou University， Lanzhou 730000， China）

ABSTRACT：

Objective" To construct a 3D printed PLLA/β-tricalcium （PLLA/β-TCP） bone tissue engineering scaffold surface porous structure through simple treatment with NaOH solution， increase the roughness and hydrophilicity of the scaffold， and promote cell adhesion on the scaffold surface. Methods" The PLLA/β-TCP mesh scaffold was prepared by 3D printing melt deposition molding technology， and the scaffold was roughed by NaOH etching. The effects of NaOH concentration and time on the scaffold were observed according to the microstructure， energy spectrum， contact angle， mechanics， and cell adhesion of the scaffold. Results" The PLLA/β-TCP composite scaffold constructed by melt deposition technology had a pre-set porous structure， and the pores were interconnected. After NaOH etching， a porous structure with both macroscopic and microscopic pores was formed. The increase in any of the NaOH concentration and time parameters would lead to the increase of pore diameter and surface roughness. When the NaOH treatment parameter was 0.1 mol/L （9 h）， it could significantly reduce the water contact angle on the surface of the scaffold， and had no significant effect on the compressive strength of the scaffold. In vitro cell testing showed that the surface porous composite scaffold etched with NaOH had more advantages in the adhesion and proliferation of BMSCs. Conclusion" Using NaOH to process 3D printing of PLLA/β-TCP bone tissue engineering scaffolds can effectively improve the surface morphology of the scaffold， and optimize its hydrophilicity and cell adhesion.

KEY WORDS： PLLA/β-tricalcium （PLLA/β-TCP）; 3D printing; bone tissue engineering scaffold; NaOH; cell adhesion

腫瘤、創(chuàng)傷或感染等造成的大面積骨缺損以及不規(guī)則骨缺損很難通過(guò)自然愈合修復(fù)［1］。骨組織工程支架具有可避免供骨區(qū)二次損傷、形態(tài)可塑等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)受到了眾多學(xué)者及臨床醫(yī)師的關(guān)注［2］。聚左旋乳酸（poly-lactic acid-co-glycolic acid，PLLA）是一種人工合成高分子有機(jī)化合物，其原料來(lái)源廣泛且降解產(chǎn)物無(wú)污染，被認(rèn)為是高分子生物可降解材料中最具有發(fā)展前景的材料之一，與熔融沉積成型（fused deposition modeling，F(xiàn)DM）3D打印技術(shù)結(jié)合時(shí)，具有極強(qiáng)的可塑性，適合作為骨組織工程支架的基底材料［3-4］。對(duì)于修復(fù)大面積骨缺損的支架需要盡可能改善其物理和化學(xué)性能以及生物活性，以獲得更好的骨愈合。因此，常在PLLA中添加諸如β-TCP等生物陶瓷材料，以增強(qiáng)材料的誘導(dǎo)成骨性及生物力學(xué)強(qiáng)度。然而，PLLA/β-TCP支架仍然顯示出較高的疏水性，從而導(dǎo)致支架表面缺乏細(xì)胞附著的識(shí)別位點(diǎn)，生物相容性不足［5-6］。

構(gòu)建合適的支架材料表面形貌，可以在一定程度上克服材料的缺點(diǎn)，優(yōu)化材料的生物相容性。研究證實(shí)，同時(shí)具有宏觀孔隙和微觀孔隙的支架更有利于細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)滲入、產(chǎn)物代謝。增加支架表面的粗糙度，可促進(jìn)依附于支架生長(zhǎng)細(xì)胞的增殖分化行為并誘導(dǎo)細(xì)胞的骨相分化［7-8］。3D 打印PLLA/β-TCP網(wǎng)狀支架可以實(shí)現(xiàn)在宏觀結(jié)構(gòu)上模仿人體骨組織的三維結(jié)構(gòu)，但如果能再構(gòu)建出支架表面的微觀孔隙，可能會(huì)進(jìn)一步改善支架的生物相容性，從而最終促進(jìn)骨愈合。有研究顯示，堿蝕刻可以增加聚合物表面粗糙度，從而更好地促進(jìn)細(xì)胞的附著和增殖［9-10］。本研究深入分析了不同反應(yīng)參數(shù)的NaOH對(duì)PLLA/β-TCP骨組織工程支架粗糙度、壓縮強(qiáng)度、親水性及細(xì)胞黏附等方面的影響，篩選在機(jī)械強(qiáng)度損失更小的情況下較優(yōu)的NaOH反應(yīng)參數(shù)，改善3D打印PLLA/β-TCP骨組織工程支架表面親水性及細(xì)胞黏附，以期為骨組織工程支架生物相容性的改善提供借鑒和參考。

1" 材料與方法

1.1" 實(shí)驗(yàn)材料

PLLA（吉林省科瑞斯生物科技有限公司，中國(guó)）；β-TCP（南京埃普瑞納米材料有限公司，中國(guó)）；胎牛血清（Gibco，美國(guó)）；青霉素（Hyclone，美國(guó)）；鏈霉素（Hyclone，美國(guó)）；DMEM/F12培養(yǎng)基（Hyclone，美國(guó)）；NaOH（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國(guó)）。

1.2" 實(shí)驗(yàn)儀器

3D打印機(jī)（Professor 300，中國(guó)）；掃描電子顯微鏡（SEM）（Sigma 300，ZEISS，德國(guó)）；接觸角測(cè)量?jī)x（OCA20，Dataphysics公司，德國(guó)）；電動(dòng)液壓伺服機(jī)械測(cè)試機(jī)（SANS CMT4304，MTS公司，美國(guó)）；光學(xué)顯微鏡（TS100，尼康，日本）。

1.3" PLLA/β-TCP支架的制備

1.4" NaOH蝕刻

NaOH處理參數(shù)為濃度（mol/L）［時(shí)間（h）］，分別為：0 mol/L（0 h）、0.01 mol/L（9 h）、0.05 mol/L（9 h）、0.1 mol/L（9 h）、0.5 mol/L（9 h）、1 mol/L（9 h）、5 mol/L（3 h）、5 mol/L（6 h）、5 mol/L（9 h）。處理完成后，用流水徹底沖洗12 h，再用去離子水離心清洗3次，40 ℃烘箱內(nèi)烘干。

1.5" 復(fù)合支架的形貌表征檢測(cè)

使用Oxford Quorum SC7620濺射鍍膜儀噴金，隨后使用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察不同處理?xiàng)l件下支架的表面形貌特征，同時(shí)利用能量色散光譜（EDS）對(duì)樣品表面元素進(jìn)行分析。形貌拍攝時(shí)加速電壓為3 kV，能譜拍攝時(shí)加速電壓為15 kV。

1.6" 支架的力學(xué)性能測(cè)試

單軸壓縮實(shí)驗(yàn)參照GB/T1041-2008進(jìn)行測(cè)試，樣件尺寸為10 mm×10 mm×4 mm，測(cè)試25%應(yīng)變對(duì)應(yīng)的壓縮強(qiáng)度，測(cè)試速度1 mm/min。使用電動(dòng)液壓伺服機(jī)械測(cè)試機(jī)（型號(hào)SANS CMT4304，MTS公司，美國(guó)）對(duì)處理組及未處理組支架進(jìn)行壓縮性能測(cè)試，每組測(cè)試3個(gè)樣本。

1.7" 支架的親水性測(cè)試

采用FDM 3D打印機(jī)打印10 mm×10 mm×3 mm的PLLA/β-TCP塊狀材料，然后使用NaOH處理。將各組支架放在升降臺(tái)上，調(diào)整升降臺(tái)高度，使用接觸角儀將液滴滴在支架上，每次滴液量為2 μL。調(diào)整支架與液滴接觸的位置，使其與測(cè)量線吻合，拍照獲得靜態(tài)圖像。每組設(shè)置3個(gè)平行樣本，使用接觸角測(cè)量軟件計(jì)算各組支架的接觸角（θ）大小。

1.8" 支架表面細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將各組尺寸為10 mm×10 mm×3 mm的多孔PLLA/β-TCP支架在PBS中超聲沖洗、干燥、60Co輻照滅菌。采用3～5代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）作為細(xì)胞培養(yǎng)模型，用于體外評(píng)估（BMSCs為本實(shí)驗(yàn)室凍存）。將BMSCs細(xì)胞以5×104 cells/mL的密度滴種于支架表面，2 h后再向孔板中加入500 μL 100 mL/L FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

將支架表面接種細(xì)胞后，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h、24 h，取出支架并用PBS洗滌1次，用40 g/L的多聚甲醛溶液固定細(xì)胞

4 h，然后用乙醇對(duì)支架表面細(xì)胞進(jìn)行梯度脫水。SEM拍照并觀察支架表面細(xì)胞形態(tài)。

1.9" 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布。各組數(shù)據(jù)均用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD-t 檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2" 結(jié)" 果

2.1" 支架成分分析

2.2" 支架形貌分析

NaOH處理參數(shù)。A：0 mol/L（0 h）；B：0.01 mol/L（9 h）；C：0.05 mol/L（9 h）；D：0.1 mol/L（9 h）；E：0.5 mol/L（9 h）；F：1 mol/L（9 h）；G：5 mol/L（3 h）；H：5 mol/L（6 h）；I：5 mol/L（9 h）。

2.3" 親疏水性分析

與0 mol/L（0 h）組相比，*P＜0.05，***P＜0.001。

2.4" 抗壓強(qiáng)度測(cè)試

各組支架的抗壓強(qiáng)度如表1所示。由表可知，隨著NaOH處理強(qiáng)度的增大，支架的抗壓強(qiáng)度減小。當(dāng)NaOH處理時(shí)間為9 h，處理濃度在0.1 mol/L內(nèi)時(shí)，對(duì)支架的抗壓強(qiáng)度未產(chǎn)生顯著影響（Pgt;0.05）；處理濃度大于0.5 mol/L時(shí)，支架的抗壓強(qiáng)度則顯著減小（Plt;0.05）。當(dāng)NaOH處理濃度均為5 mol/L時(shí)，短時(shí)間處理（3 h）即對(duì)支架的抗壓強(qiáng)度產(chǎn)生顯著影響（Plt;0.05）。

不同上標(biāo)字母標(biāo)注的組間抗壓強(qiáng)度有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；

相同上標(biāo)字母標(biāo)注的組間抗壓強(qiáng)度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5" 細(xì)胞黏附

24 h后，未經(jīng)處理的支架表面細(xì)胞顯示剛剛開(kāi)始擴(kuò)散，而經(jīng)NaOH處理后的支架表面可見(jiàn)細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞已產(chǎn)生大量絲狀延伸，錨定于材料表面的凸起和凹陷內(nèi)。以上現(xiàn)象反映了經(jīng)NaOH蝕刻后的支架與蝕刻前相比，具有更好的生物相容性，更適合BMSCs的增殖黏附。

A：未處理組種植細(xì)胞6 h；B：NaOH處理組種植細(xì)胞6 h；C：未處理組種植細(xì)胞24 h；D：NaOH處理組種植細(xì)胞

24 h。

3" 討" 論

PLLA/β-TCP復(fù)合材料常被作為骨組織工程支架的基底材料，而支架表面的相容性是生物材料應(yīng)用中的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題［11-13］。NaOH處理是一種簡(jiǎn)單的調(diào)整支架物理和生物性能的方法［14］。NaOH對(duì)PLLA/β-TCP網(wǎng)狀支架的表面蝕刻可能是通過(guò)以下三種途徑實(shí)現(xiàn)的：一是PLLA主鏈上的酯鍵發(fā)生皂化反應(yīng)，其中NaOH中的氫氧根離子破壞其主鏈，形成羥基和羧基，這些官能團(tuán)與水相互作用，從而增強(qiáng)了材料的親水性［15］；二是固相氫氧化鈉晶體戳入PLLA表面，從而在表面產(chǎn)生凹坑和孔洞；三是當(dāng)NaOH處理濃度和時(shí)間持續(xù)增加時(shí)，伴有β-TCP從復(fù)合材料內(nèi)析出，形成孔洞或可能伴隨有孔洞的堵塞和塌陷。本研究中電鏡觀察結(jié)果也顯示，當(dāng)?shù)蜐舛榷虝r(shí)間NaOH處理支架時(shí)，NaOH針狀結(jié)構(gòu)均勻分散在聚合物表面；隨著處理濃度的增加，NaOH聚集成簇狀結(jié)構(gòu)，且晶體形狀大小決定了表面蝕刻孔隙的形狀和大小；當(dāng)高濃度長(zhǎng)時(shí)間處理支架時(shí)，支架孔隙被顆粒堵塞或直接廣泛水解塌陷。由于氫氧化鈉晶體聚集在材料表面，因此在進(jìn)行任何表征方法之前都需要徹底清洗支架。

同時(shí)具有宏觀和微觀孔隙的支架更有利于組織長(zhǎng)入、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及血管化［16］。本研究采用熔融沉積3D打印的方式成功制備出具有宏觀三維多孔結(jié)構(gòu)且孔隙相互聯(lián)通的PLLA/β-TCP 骨組織工程支架，但此時(shí)仍然缺乏微觀孔隙。經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的NaOH處理，構(gòu)建了PLLA/β-TCP支架表面上的微觀孔隙，從而降低了支架表面接觸角，增加了支架表面潤(rùn)濕性。這對(duì)于支架的生物相容性及成骨功能非常重要。研究表明，相較于疏水性聚合物，親水性表面更有利于成骨細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)［17-19］。

以往的研究證實(shí)，高孔隙率的支架對(duì)成骨有積極影響，但也往往會(huì)降低支架的生物力學(xué)強(qiáng)度［20］。本研究考慮了NaOH處理濃度和處理時(shí)間兩項(xiàng)參數(shù)對(duì)支架的影響。目的是優(yōu)化NaOH處理PLLA/β-TCP支架的反應(yīng)參數(shù)，以獲得最佳的體外效果，同時(shí)對(duì)機(jī)械強(qiáng)度的影響最小。結(jié)果表明，其中任意一種參數(shù)的增加都會(huì)導(dǎo)致支架表面孔徑、孔隙密度和表面粗糙度的增加，從而導(dǎo)致材料表面接觸角減小，當(dāng)另一項(xiàng)參數(shù)的適當(dāng)減小則可以抵消這一效應(yīng)。兩個(gè)不同反應(yīng)參數(shù)的聯(lián)合作用可以產(chǎn)生相似的材料表面接觸角。適度親水的表面（水接觸角為40°～80°）相較于過(guò)度疏水或親水的表面更有利于細(xì)胞黏附及增殖［21］。本項(xiàng)目中，NaOH處理參數(shù)為0.1 mol/L（9 h）、0.5 mol/L（9 h）、1 mol/L（9 h）、5 mol/L（3 h）接觸角范圍在40°～80°。從抗壓強(qiáng)度的測(cè)試結(jié)果可以看出，低濃度NaOH處理對(duì)支架的力學(xué)性能影響相對(duì)較??；而高濃度處理則會(huì)對(duì)支架的力學(xué)性能產(chǎn)生較大影響，尤其是當(dāng)NaOH濃度為5 mol/L，處理時(shí)間在6 h以上時(shí)，支架的抗壓強(qiáng)度大幅度下降，從原來(lái)的（40.00±1.73）MPa下降至（15.00±1.73）MPa以下?？梢?jiàn)PLLA/β-TCP支架對(duì)于NaOH濃度的變化是較為敏感的，選擇合適的NaOH處理濃度及時(shí)間是至關(guān)重要的。綜合分析，在各處理組中，當(dāng)NaOH的處理?xiàng)l件為0.1 mol/L（9 h）時(shí)，顯示出對(duì)力學(xué)性能影響較小且對(duì)細(xì)胞具有較強(qiáng)親和力的潛力，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在之后的細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)也可以看出，經(jīng)0.1 mol/L（9 h）NaOH處理的支架顯示出較強(qiáng)的細(xì)胞黏附能力，這與支架表面的粗糙度和親水性增加是密不可分的。

綜上所述，本研究通過(guò)3D打印熔融沉積成型技術(shù)制備了PLLA/β-TCP骨組織工程支架。通過(guò)NaOH蝕刻的方法，構(gòu)建了支架表面的粗糙或孔洞狀形態(tài)，改善了支架表面的親水性，顯著增加了其用于細(xì)胞附著和基質(zhì)沉積的表面積與體積比，為BMSCs在支架上提供了更好的細(xì)胞附著性。因此，用NaOH處理3D打印PLLA/β-TCP骨組織工程支架是一種簡(jiǎn)單但可行的表面活化方法，是優(yōu)化該類支架細(xì)胞黏附性能的一種有效策略。

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（編輯" 張" 敏）