摘要：

目的" 探討線粒體未折疊蛋白反應(yīng)（mitochondrial unfolded protein reaction，UPRmt）對腎小管上皮細胞（human kidney 2，HK-2）脂代謝的影響。方法" 采用棕櫚酸（palmitic acid，PA）誘導HK-2細胞內(nèi)脂質(zhì)聚集，分別予siRNA抑制UPRmt或巴多索?。╰he 2-cyano-3，12-dioxooleana-1，9-dien-28-oic acid，CDDO）增強UPRmt。油紅染色觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)聚集情況，

線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）測定線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）

，Mito-SOX測定線粒體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量，Western blotting檢測HSP60、LONP1、CLPP、ACOX1、PPARα、PGC1α、CPT1α蛋白表達。結(jié)果" PA誘導HK-2細胞脂質(zhì)聚集、MMP降低、ROS產(chǎn)生增多及UPRmt關(guān)鍵蛋白HSP60、LONP1表達降低；抑制UPRmt可加劇PA導致的脂質(zhì)聚集、MMP降低、ROS產(chǎn)生增多，HSP60、LONP1表達進一步降低；增強UPRmt可緩解PA導致的脂質(zhì)聚集、MMP降低、ROS產(chǎn)生增多以及HSP60、LONP1表達降低。結(jié)論" PA誘導的HK-2細胞脂質(zhì)聚集可能與線粒體功能障礙有關(guān)，UPRmt在該過程中對HK-2細胞具有保護作用。

關(guān)鍵詞：線粒體未折疊蛋白反應(yīng)（UPRmt）；棕櫚酸（PA）；腎小管上皮細胞（HK-2）；脂質(zhì)聚集；活性氧（ROS）

中圖分類號：R58""" 文獻標志碼：A

DOI：10.7652/jdyxb202403011

收稿日期：2023-08-10 "修回日期：2024-02-14

通信作者：杜曉剛. E-mail：cqmudxg@163.com

網(wǎng)絡(luò)出版地址：https：//link.cnki.net/urlid/61.1399.R.20240411.0917.002 （2024-04-12）

The role of mitochondrial unfolded protein response in palmitic acid-induced

lipid accumulation in renal tubule epithelium in vitro

WEN Ruizhi， DU Xiaogang

（Department of Nephrology，the First Affiliated Hospital of

Chongqing Medical University， Chongqing 400042，China）

ABSTRACT：

Objective" To investigate the effect of mitochondrial unfolded protein response （UPRmt）on lipid metabolism in human kidney 2 （HK-2） cells . Methods" Lipid accumulation was induced by palmitic acid （PA） in HK-2 cells. The cells were pretreated with siRNA or CDDO respectively. The intracellular lipid accumulation was observed by oil red staining; mitochondrial membrane potential （MMP） was measured by JC-1.The contents of reactive oxygen species （ROS） in mitochondria were measured by Mito-SOX， and the expressions of HSP60， LONP1， CLPP， ACOX1， PPARα， PGC1α and CPT1α were detected by Western blotting. Results" PA induced lipid aggregation， MMP decrease， ROS generation in mitochondria and the decreased expression of UPRmt proteins （e. g.， HSP60 and LONP1） in HK-2 cells. Pretreatment of HK-2 cells with siRNA could aggravate lipid aggregation， MMP decrease and ROS generation induced by PA， and further decrease the expression of HSP 60and LONP1.Pretreatment of HK-2 cells with CDDO alleviated lipid aggregation， MMP decrease， ROS generation and decreased HSP60 and LONP1 expressions induced by PA. Conclusion" Lipid aggregation in HK-2 cells induced by PA may be related to mitochondrial dysfunction and UPRmt has a protective effect on HK-2 cells in the process.

KEY WORDS： mitochondrial unfolded protein reaction （UPRmt）; palmitic acid （PA）; human kidney 2 （HK-2） cell; lipid accumulation; reactive oxygen species （ROS）

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）已經(jīng)成為影響健康的嚴重問題。CKD患者可有各種類型的代謝紊亂，其中脂代謝紊亂以血液三酰甘油水平輕至中度升高為主［1］，高脂血癥是CKD進展的危險因素。但是，脂代謝紊亂加劇CKD進展的具體機制還需進一步研究。當各種刺激導致線粒體功能障礙時，線粒體內(nèi)將產(chǎn)生大量錯誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)，即線粒體應(yīng)激［2］。此時線粒體未折疊蛋白反應(yīng)（mitochondrial unfolded protein reaction，UPRmt）激活，UPRmt主要通過熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）如HSP60、HSP90等以及蛋白酶如CLPP（caseinolytic peptidase P）、LONP1（lon protease1）等的作用使錯誤折疊或未折疊的蛋白正確折疊或降解，以維持線粒體的正常結(jié)構(gòu)和功能［3-4］。既往研究表明，UPRmt與脂代謝密切相關(guān)。BHASKARAN等［4］研究發(fā)現(xiàn)，不飽和脂肪酸飲食能增強UPRmt關(guān)鍵蛋白CLPP以及脂肪酸β-氧化關(guān)鍵酶脂酰輔酶A氧化酶1（acyl-coenzyme A oxidase 1， ACOX1）的表達，以增強脂肪酸氧化代謝。而高脂飲食則導致CLPP以及脂肪酸利用的關(guān)鍵酶CRAT （carnitine O-acetyltransferase）的表達減弱，從而導致脂肪酸代謝障礙［5］?；诖?，本研究擬探討UPRmt在高脂導致的HK-2細胞脂質(zhì)異常聚集中的作用及機制。

1" 材料與方法

1.1" 試劑和儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基購自中國Boster公司，胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司，油紅O染料和棕櫚酸（PA）購自美國Sigma公司，抗HSP60、過氧化物酶體增殖劑激活受體α（peroxisome proliferators-activated receptor α， PPARα）、ACOX1抗體購自中國正能公司，抗肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1α（carnitine palmitoyltransferase 1α，CPT1α）抗體購自美國CST公司，抗過氧化物酶體增殖物活化受體協(xié)同刺激因子1α（peroxlsome proliferator-activated receptor-γ-coactlvator-1α，PGC1α）抗體購自美國Abcam公司，線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）購自中國Solarbio公司，Mito-SOX探針購自中國Yeason公司。全波長酶標儀購自美國Thermo公司。電泳儀購自美國Bio-Rad公司。熒光顯微鏡購自德國Zesis公司。

1.2" 細胞系及實驗分組

腎小管上皮細胞（HK-2）細胞由重慶醫(yī)科大學重大代謝性疾病和轉(zhuǎn)化醫(yī)學實驗室阮雄中教授惠贈，本課題組保存。HK-2細胞用含有100 mL/L FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基在細胞板上培養(yǎng)至顯微鏡下觀察細胞匯合度達60%～80%，進行實驗分組，即對照組、PA組、PA+NC組、PA+siRNA組、CDDO組、CDDO+PA組。

1.3" 各組HK-2細胞的干預處理

PA組用450 μmol/L PA刺激，觀察HK-2細胞內(nèi)脂質(zhì)聚集。用含有100 mL/L FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基在細胞板上培養(yǎng)HK-2細胞，在顯微鏡下觀察，待細胞匯合度達60%～80%，加入適量PA（450 μmol/L）于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。

對照組用含100 mL/L FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)；PA+NC組為siRNA陰性對照細胞干預HK-2細胞后，450 μmol/L PA刺激；PA+siRNA組為siRNAHSP60細胞用450 μmol/L PA刺激；CDDO組為2.5 μmol/L 馬多索?。–DDO）干預培養(yǎng)；CDDO+PA組為CDDO干預細胞1 h后，用450 μmol/L PA刺激。各組細胞于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h并進行相關(guān)實驗檢測。

其中siRNAHSP60HK-2細胞按以下步驟獲得。HK-2細胞用含有100 mL/L FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞匯合度達60%～80%，將適量的siRNAHSP60、RNA oligo 與GP-siRNA-Mate plus轉(zhuǎn)染試劑直接混合后加入培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)細胞，6～8 h后換液。24 h收集細胞并檢測HSP60蛋白表達，鑒定siRNAHSP60HK-2細胞。siRNA陰性對照細胞僅加入siRNA陰性對照試劑。

1.4" 油紅染色檢測細胞內(nèi)脂質(zhì)聚集情況

將各實驗組細胞用40 g/L多聚甲醛固定，PBS緩沖液潤洗細胞后，用配制好的油紅工作液室溫避光染色1 h，洗去染液后置于PBS緩沖液中；600 mL/L異丙醇溶液漂洗玻片1～2 s脫色，除去多余的背景染液；蘇木素染色液染細胞核2～3 min，PBS緩沖液潤洗后，甘油明膠常規(guī)封片。于顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.5" JC-1染色檢測線粒體膜電位并定量分析

將各實驗組細胞用PBS緩沖液潤洗并更換為1 mL新鮮細胞培養(yǎng)液，加入1 mL的JC-1染色工作液，充分混勻后，置于細胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min；配制適量的JC-1染色緩沖液（1×）并預冷；孵育結(jié)束后，吸去上清液，用預冷的JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次；加入2 mL新鮮的細胞培養(yǎng)液。顯微鏡下觀察并采集圖像。

另設(shè)置JC-1染色陽性對照：羰基氰化物間氯苯腙（carbonyl cyanide 3-chloro phenylhydrazone CCCP）是氧化磷酸化解偶聯(lián)劑，即陽性對照組用10 μmol/L的CCCP處理HK-2細胞20 min后，用PBS緩沖液潤洗1次，每孔加入1 mL的JC-1染色工作液，充分混勻后，置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育20 min后，吸去上清液，用配制好的預冷JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次；更換為2 mL新鮮細胞培養(yǎng)液。顯微鏡下觀察并采集圖像。

用圖像處理軟件（Image J）對JC-1熒光信號進行定量分析。通過測量紅色和綠色熒光強度的比值，可獲得線粒體膜電位的相對變化。

1.6" Mito-SOX染色檢測細胞內(nèi)ROS含量

將各實驗組HK-2細胞用PBS緩沖液潤洗1次，每孔加入1 mL線粒體超氧化物紅色熒光探針工作液，充分覆蓋12孔板，37 ℃避光孵育10 min；用預熱的HBSS（含Ca2+、Mg2+離子）緩沖液潤洗細胞3次；顯微鏡下觀察并采集圖像，并用圖像處理軟件（Image J）對Mito-SOX熒光信號進行定量分析。通過測量各組細胞紅色熒光強度并計算其比值，可獲得線粒體ROS含量的相對變化。

1.7" Western blotting檢測細胞中的蛋白表達

將各實驗組HK-2細胞裂解后提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。等量蛋白上樣進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，快速轉(zhuǎn)膜液400 mA濕轉(zhuǎn)35 min，快速封閉液常溫封閉10 min，加入HSP60、LONP1、CLPP、PPARα、ACOX1、PGC1α、CPT1α、GAPDH抗體（工作液稀釋比均為1∶1 000）中4 ℃孵育過夜后，二抗（1∶1 000）孵育1 h，ECL化學發(fā)光液顯影，F(xiàn)usion軟件對顯示條帶的灰度值進行定量分析。以GAPDH為內(nèi)參， 計算目的蛋白相對表達變化。

1.8" 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，所有實驗均至少重復3次，采用SPSS 22.0軟件進行所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，采用Graphpad軟件作圖。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2" 結(jié)" 果

2.1" PA誘導HK-2細胞內(nèi)脂質(zhì)聚集增多

2.2" PA導致HK-2細胞線粒體損傷

2.2.1" PA導致HK-2細胞線粒體膜電位降低

2.2.2" PA導致HK-2細胞線粒體ROS產(chǎn)生增多

2.2.3" PA導致HK-2細胞UPRmt受損

2.3" 抑制UPRmt可加劇PA導致的線粒體損傷和β-氧化功能障礙以及脂質(zhì)聚集

2.4" 增強UPRmt可緩解PA導致的線粒體損傷和β-氧化功能障礙以及脂質(zhì)聚集

3" 討" 論

細胞內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)取決于細胞攝取脂質(zhì)和利用脂質(zhì)的動態(tài)平衡。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PA可上調(diào)HK-2細胞CD36（介導脂質(zhì)攝?。┍磉_，并伴有細胞內(nèi)脂質(zhì)過度聚集［6］，表明高脂環(huán)境下細胞內(nèi)脂質(zhì)攝取增加。既往研究發(fā)現(xiàn)，HK-2細胞只能依賴有氧代謝提供能量，而脂肪酸的β-氧化是HK-2細胞能量來源的主要方式［7］。

對高脂環(huán)境下，HK-2細胞是否存在線粒體脂質(zhì)的氧化利用障礙從而導致細胞內(nèi)的脂質(zhì)聚集尚存疑惑。ACOX1以及CPT1α都是脂肪酸β氧化的限速酶［8-9］；PPARα通過調(diào)節(jié)靶基因的表達增加脂肪酸β-氧化活性［10］；PGC1α對 PPARα有協(xié)同刺激作用，可增加脂肪酸β-氧化酶的轉(zhuǎn)錄活性［11］。上述蛋白均是脂肪酸β-氧化的關(guān)鍵蛋白和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。本研究Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，PA（450 μmol/L）刺激HK-2細胞24 h時，細胞內(nèi)的脂肪酸β氧化關(guān)鍵蛋白ACOX1、PPARα、PGC1α的表達降低（P＜0.05），提示高脂環(huán)境下HK-2細胞的脂肪酸氧化利用存在障礙。因此，高脂環(huán)境下HK-2細胞內(nèi)脂質(zhì)異常聚集還可能與細胞的脂質(zhì)氧化利用減少有關(guān)。

高脂環(huán)境下線粒體脂肪酸氧化利用障礙，可能與線粒體功能損傷有關(guān)。本研究進一步研究了高脂環(huán)境下HK-2細胞線粒體損傷情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PA可導致HK-2細胞線粒體膜電位降低以及ROS產(chǎn)生增加。適當?shù)哪る娢皇蔷S持線粒體結(jié)構(gòu)及功能正常的重要條件［12］。當線粒體功能異常時，常伴隨出現(xiàn)線粒體膜電位降低，而異常的線粒體內(nèi)會產(chǎn)生大量的ROS，大量堆積的ROS導致線粒體功能異常及膜電位降低進一步加劇，由此形成惡性循環(huán)［13］。本研究證實，高脂環(huán)境下HK-2細胞存在線粒體功能損傷，這可能是線粒體脂肪酸氧化障礙的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

UPRmt對于維持應(yīng)激狀態(tài)下線粒體穩(wěn)態(tài)，具有重要保護作用［14］。但是在脂質(zhì)應(yīng)激時，UPRmt的具體變化和作用仍需進一步研究。HSP60、LONP1和CLPP都是UPRmt的關(guān)鍵蛋白，在線粒體應(yīng)激時產(chǎn)生，共同維持線粒體內(nèi)的蛋白質(zhì)平衡。其中，HSP60具有兩種功能，保證蛋白質(zhì)的正確折疊以及穩(wěn)定其他蛋白質(zhì)，防止其在應(yīng)激過程中的變性。CLPP是一種酪蛋白水解酶，其與ClpX形成ClpXP復合物后具有蛋白水解活性。LONP1是一種由DNA編碼的蛋白酶。本研究結(jié)果顯示，PA刺激HK-2細胞時，雖然CLPP表達無明顯變化，但熱休克蛋白HSP60以及蛋白酶LONP1表達降低。這提示高脂環(huán)境下HK-2細胞的UPRmt受損。

本研究進一步觀察UPRmt對高脂環(huán)境下HK-2細胞線粒體損傷及細胞內(nèi)脂代謝的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與PA組相比，采用siRNA敲低HK-2細胞中的HSP60以抑制UPRmt時，線粒體膜電位進一步降低，ROS的產(chǎn)生明顯增加，線粒體脂肪酸氧化的關(guān)鍵蛋白ACOX1、PGC1α以及PPARα的表達進一步降低（P＜0.05），同時，細胞內(nèi)的脂質(zhì)聚集進一步增多。相反，采用CDDO增強UPRmt，則可明顯緩解PA誘導的線粒體膜電位降低、ROS增多、脂肪酸β-氧化功能障礙以及脂質(zhì)聚集，表明UPRmt可減輕高脂誘導的HK-2細胞線粒體損傷。因此，高脂環(huán)境下HK-2細胞一旦UPRmt受到抑制，線粒體功能受損，進而影響線粒體對脂肪酸的氧化利用，導致細胞內(nèi)脂質(zhì)異常聚集增多，這可能是脂質(zhì)腎損害的重要機制。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，PA可導致HK-2細胞線粒體膜電位降低，ROS產(chǎn)生增多，二者可能是導致線粒體脂肪酸β-氧化功能障礙，細胞內(nèi)脂肪酸利用減少，從而出現(xiàn)細胞內(nèi)脂質(zhì)聚集的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。而UPRmt對于線粒體的結(jié)構(gòu)和功能具有保護作用，當使用siRNA敲低UPRmt的關(guān)鍵蛋白HSP60時，可阻斷UPRmt對于線粒體功能的保護作用，而使用CDDO增強UPRmt可明顯緩解PA誘導的線粒體膜電位降低、ROS增多、β-氧化功能障礙以及脂質(zhì)聚集。未來仍需進一步研究在高脂狀態(tài)下，UPRmt減輕PA誘導的脂肪酸β-氧化功能障礙以減輕HK-2細胞內(nèi)脂質(zhì)聚集的具體機制，以期為臨床治療合并脂代謝紊亂的CKD患者提供治療的方法以及實驗基礎(chǔ)和理論支持。

參考文獻：

［1］ FERRO C J， MARK P B， KANBAY M， et al. Lipid management in patients with chronic kidney disease［J］. Nat Rev Nephrol， 2018， 14（12）： 727-749.

［2］ O’MALLEY J， KUMAR R， INIGO J， et al. Mitochondrial stress response and cancer［J］. Trends Cancer， 2020， 6（8）： 688-701.

［3］ MNCH C. The different axes of the mammalian mitochondrial unfolded protein response［J］. BMC Biol， 2018， 16（1）： 81.

［4］ ARNOULD T， MICHEL S， RENARD P. Mitochondria retrograde signaling and the UPRmt： where are we in mammals？［J］. Int J Mol Sci， 2015， 16（8）： 18224-18251.

［5］ BHASKARAN S， UNNIKRISHNAN A， RANJIT R， et al. A fish oil diet induces mitochondrial uncoupling and mitochondrial unfolded protein response in epididymal white adipose tissue of mice［J］. Free Radic Biol Med， 2017， 108： 704-714.

［6］ LIU T， CHEN X M， SUN J Y， et al. Palmitic acid-induced podocyte apoptosis via the reactive oxygen species-dependent mitochondrial pathway［J］. Kidney Blood Press Res， 2018， 43（1）： 206-219.

［7］ BHARGAVA P， SCHNELLMANN R G. Mitochondrial energetics in the kidney［J］. Nat Rev Nephrol， 2017， 13（10）： 629-646.

［8］ CHEN X F， TIAN M X， SUN R Q， et al. SIRT5 inhibits peroxisomal ACOX1 to prevent oxidative damage and is downregulated in liver cancer［J］. EMBO Rep， 2018， 19（5）： e45124.

［9］ SCHLAEPFER I R， JOSHI M. CPT1A-mediated fat oxidation， mechanisms， and therapeutic potential［J］. Endocrinology， 2020， 161（2）： bqz046.

［10］ WANG Y P， NAKAJIMA T， GONZALEZ F J，et al. PPARs as metabolic regulators in the liver： lessons from liver-specific PPAR-1 mice［J］. Int J Mol Sci， 2020， 21（6）： 2061.

［11］ FINCK B N， GROPLER M C， CHEN Z J， et al. Lipin 1 is an inducible amplifier of the hepatic PGC-1alpha/PPARalpha regulatory pathway［J］. Cell Metab， 2006， 4（3）： 199-210.

［12］ WANG P， DENG J W， DONG J， et al. TDP-43 induces mitochondrial damage and activates the mitochondrial unfolded protein response［J］. PLoS Genet， 2019， 15（5）： e1007947.

［13］ SELI E， WANG T R， HORVATH T L. Mitochondrial unfolded protein response： a stress response with implications for fertility and reproductive aging［J］. Fertil Steril， 2019， 111（2）： 197-204.

［14］ LIN Y F， HAYNES C M. Metabolism and the UPRmt［J］. Mol Cell， 2016， 61（5）： 677-682.

（編輯" 國" 榮）