摘要：

目的" 探索低溫等離子體（low temperature plasma， LTP）產(chǎn)生的活化液（plasma-activated medium， PAM）對人臍靜脈血管內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）增殖和血管生成的影響，為未來利用PAM促進創(chuàng)傷愈合和抑制腫瘤血管生成提供理論基礎。方法" 選擇HUVECs作為體外研究模型，以LTP處理不同時間（0、15、30、45、60、75 s）后的PAM培養(yǎng)液進行分組干預。采用MTT法和細胞周期法測定PAM對HUVECs活力的影響，通過血管生成實驗檢測PAM對血管生成的影響，采用熒光探針檢測細胞內活性氧（ROS）水平；構建黑色素瘤小鼠模型，免疫組織化學法檢測腫瘤組織中CD31的表達以評估血管生成情況。結果" LTP處理獲得的PAM對HUVECs血管生成具有雙向作用，表現(xiàn)為：與對照組（0 s）相比，低劑量（15 s和30 s）處理時，HUVEC細胞活力增加，而高劑量（45 s、60 s和75 s）處理時，細胞活力明顯下降（Plt;0.05）；PAM-15 s和PAM-30 s組處于S期的細胞比例明顯增高，而PAM-45 s、PAM-60 s、PAM-75 s組處于S期細胞比例顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）；PAM-15 s和PAM-30 s組HUVEC血管生成能力增強，而PAM-45 s、PAM-60 s、PAM-75 s組的細胞血管生成能力降低，血管節(jié)點、交叉點、網(wǎng)眼數(shù)和血管分支數(shù)都明顯降低（Plt;0.05）。此外，HUVECs內ROS水平隨著LTP處理時間的延長而升高。PAM處理黑色素瘤小鼠后，對照組腫瘤組織中CD31棕黃色陽性信號大面積分布，各PAM處理組腫瘤組織中CD31棕黃色顆粒分布減少。結論" 短時間LTP處理的PAM促進了HUVEC的增殖和血管生成；而長時間LTP處理的PAM則抑制細胞活力和血管生成。

關鍵詞：低溫等離子體；血管內皮細胞；血管生成

中圖分類號： R333.12""" 文獻標志碼：A

DOI：10.7652/jdyxb202403007

收稿日期：2023-09-19" 修回日期：2024-02-24

基金項目：陜西省自然科學基礎研究計劃面上項目（No. 2022JM-556）;陜西省青年基金項目（No. 2022JQ-882）；陜西省中藥管理局科研項目（No. SZY-KJCYC-2023-084）

Supported by the Natural Science Basic Research Program of Shaanxi Province （No. 2022JM-556）， the Youth Foundation of Shaanxi Province （No. 2022JQ-882）， and Traditional Chinese Medicine Administration Scientific Research Project of Shaanxi Province （No. SZY-KJCYC-2023-084）

通信作者：石興民，教授. E-mail：shixingmin142@163.com

網(wǎng)絡出版地址：https：//link.cnki.net/urlid/61.1399.R.20240318.1024.002 （2024-03-18）

Effects of low temperature plasma-activated medium on proliferation and

angiogenic capacity of vascular endothelial cells

YUAN Wang1， WANG Xiangni2，3， LIU Jinren2， WANG Xiying2，

LU Jiajia2， HE Zhirou2， XU Yulin2， SHI Xingmin2

（1. PET-CT Room， The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University， Xi’an 710061;

2. School of Public Health， Xi’an Jiaotong University， Xi’an 710061;

3.Yuncheng Vocational and Technical University， Yuncheng 044000， China）

ABSTRACT：

Objective" To explore the plasma-activated medium （PAM） produced by low temperature plasma （LTP） on the proliferation and angiogenesis of human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） so as to provide theoretical basis for the future use of PAM to promote wound healing and inhibit tumor angiogenesis. Methods" HUVECs were selected as the in vitro research model. The PAM-containing medium after LTP treatment for different time points （0 s， 15 s， 30 s， 45 s， 60 s， and 75 s） was used for intervention. The influence of PAM on HUVECs viability was assessed using the MTT assay and cell cycle analysis. The effects of PAM on angiogenesis were examined through angiogenesis experiments. Intracellular levels of reactive oxygen species （ROS） were measured using fluorescence probes. A melanoma mouse model was established， and CD31 expression was detected by immunohistochemistry. Results" As the treatment time increased， the intracellular levels of ROS also elevated. PAM derived from LTP exhibited a bidirectional effect on angiogenesis in HUVECs. Compared to the control group （0 s）， low-dose treatments （15 s and 30 s） enhanced HUVECs viability， while high-dose treatments （45 s， 60 s， and 75 s） significantly decreased cell viability （Plt;0.05）. The proportion of HUVECs in the S phase was significantly increased in the PAM-15 s and PAM-30 s groups， but markedly decreased in the PAM-45 s， PAM-60 s， and PAM-75 s groups， with statistically significant differences （Plt;0.05）. The HUVECs tube formation ability was enhanced in the 15 s and 30 s PAM groups， but diminished in the PAM-45 s， PAM-60 s， and PAM-75 s groups， characterized by the decreased numbers of vascular nodes， intersections， meshes， and branching points （Plt;0.05）. After PAM treatment in the melanoma mouse model， the control group exhibited widespread distribution of CD31 in tumor tissue， while the PAM-5 min and PAM-10 min groups displayed reduced distribution of CD31.Conclusion" Short-term exposure to PAM enhances HUVECs proliferation and angiogenesis， whereas prolonged exposure suppresses cell viability and inhibits angiogenesis.

KEY WORDS： low temperature plasma; vascular endothelial cell; angiogenesis

新血管從已有血管中萌芽的過程稱為血管生成，是生長發(fā)育、炎癥反應、創(chuàng)面愈合等生理現(xiàn)象中不可缺少的環(huán)節(jié)［1］。然而，血管生成也是腫瘤進展和轉移的先決條件。腫瘤血管生成為腫瘤細胞提供氧氣和營養(yǎng)物質，也為腫瘤細胞轉移提供了途徑［2］。腫瘤血管生成活躍與人類癌癥的晚期腫瘤生長和轉移有關［3］。等離子體是中性氣體分子在強電場作用下電離而產(chǎn)生的混合體，由離子、電子和中性粒子、活性自由基、紫外線等構成，被稱為物質的“第四態(tài)”。通常將電子溫度很高，而離子和原子等重粒子溫度很低且接近于室溫的非熱平衡態(tài)等離子體稱為低溫等離子體（low temperature plasma， LTP）［4］。

LTP通過直接處理和間接處理兩種形式作用于樣本。直接處理是指將待處理樣本放置于LTP設備的正下方，使得樣本與LTP直接接觸；將LTP預先處理細胞培養(yǎng)液后產(chǎn)生的等離子體活化的培養(yǎng)液（plasma-activated medium，PAM）處理細胞或組織稱為間接處理［5］。LTP含豐富的活性氧和活性氮［6］，這些活性氧和活性氮物質可影響新生血管的形成［7］。研究表明，PAM對多種腫瘤有抑制作用［8-9］，而PAM對血管生長的影響尚不明確。因此，本研究擬探討PAM對血管生長的影響，進一步明確PAM抗腫瘤機制，為PAM在促進創(chuàng)面愈合、抑制腫瘤血管生成等方面的應用奠定理論基礎。

1" 材料與方法

1.1" 細胞系與動物

本實驗所用細胞為人臍靜脈血管內皮細胞（HUVEC），由西安交通大學醫(yī)學部癌癥研究所贈送。本課題采用的B16-F10小鼠黑色素瘤細胞，購于中科院上海細胞庫。6～8周齡雌性C57BL/6小鼠購于西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心，所有小鼠都在實驗室中特定的無病原體環(huán)境中飼養(yǎng)。動物實驗均遵循《實驗動物護理和使用指南》，通過了西安交通大學生物醫(yī)學倫理委員會批準（批準文號：2022-1593）。

1.2" 主要試劑與儀器

DMEM/F12基礎培養(yǎng)液購于中國武漢普諾賽生命科技有限公司；胎牛血清購自以色列Biological Industries公司；青霉素-鏈霉素混合液、2.5 g/L胰蛋白酶購于美國Gibco公司；細胞周期檢測試劑盒、CD31抗體購于中國江蘇凱基生物技術股份有限公司；Matrigel基質膠購于美國Corning公司，兔抗VEGFR-2、p-MEK1/2抗體、鼠抗MEK1/2抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；CTP-2000K LTP電源購自中國南京蘇曼；Tektronix TDS 2012C示波器、Tektronix P6015A高壓探頭購自美國Tektronix公司。

1.3" PAM制備及細胞分組處理

本實驗LTP產(chǎn)生裝置采用同軸雙環(huán)電極射流，空心的石英玻璃做成射流管（內徑2.0 mm，外徑4.0 mm），用于吹出氣流。寬10.0 mm、厚0.5 mm的銅皮做成高壓電極與接電電極纏繞在射流管上，高壓電極與接地電極的距離為20.0 mm，高壓電極下緣距離管口10.0 mm。采用高純度氦氣（99.999%）為工作氣體，放電波形為正弦波，放電頻率固定為39.5 kHz，石英玻璃管最下緣距離培養(yǎng)液表面25.0 mm。實驗時高壓電極的峰值電壓可通過旋鈕調整，示波器顯示電壓波形和大??；氣流量通過流速控制器控制，流量計顯示流速大小。

于50 mL/L CO2、37 ℃、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱，用含100 mL/L胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)HUVEC細胞，含有100 mL/L胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素混合液的RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)B16F10細胞。HUVEC用于體外研究，B16F10用于建立小鼠黑色素瘤模型。

待HUVEC生長匯合至80%～90% 時，2.5 g/L胰酶消化后調整細胞密度為5×104個/mL，于96孔板中加入200 μL/孔細胞懸液，孔板邊緣孔用無菌PBS填充后于培養(yǎng)箱中過夜。按上述PAM制備步驟，使用LTP分別處理HUVEC細胞培養(yǎng)液15 s、30 s、45 s、60 s和75 s，從而得到LTP不同處理時間的PAM，并將HUVEC細胞實驗分組為PAM-0 s（對照組）、PAM-15 s、PAM-30 s、PAM-45 s、PAM-60 s和PAM-75 s組，通過顯微鏡觀察各組PAM對細胞形態(tài)的影響。B16F10細胞的培養(yǎng)、傳代操作原則同HUVEC細胞。

1.4" MTT法檢測HUVEC細胞活力

制備好PAM后，吸棄原96孔板中的培養(yǎng)液，更換為不同處理時間的PAM，培養(yǎng)24 h后取出96孔板，每孔中加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，輕輕將孔內液體吸出，每孔加入150 μL的 DMSO，設置酶標儀晃動時間為3 min，波長值為490 nm，測出吸光度（A490 nm）值，計算細胞活力。細胞活力=A490 nm處理組/A490 nm對照組×100%。

1.5" 碘化丙啶（propidium，PI）單染法測定細胞周期變化

消化收集各組PAM處理24 h的HUVEC細胞，取4 mL冰浴預冷的750 mL/L乙醇于離心管中低速渦旋震蕩，并逐滴分別加入1 mL細胞懸液，混勻后4 ℃固定12 h后，1 000 r/min離心5 min，小心棄去上清液，加入5 mL預冷的PBS，清洗2次。每管細胞樣品中加入0.5 mL PI染色液，緩慢并充分重懸細胞沉淀，37 ℃避光孵育30 min，隨后上機進行流式檢測。

1.6" 血管生成實驗

采用Matrigel基質膠模擬細胞外基質。消化收集各組PAM培養(yǎng)24 h的HUVEC細胞，經(jīng)重懸后，調整細胞密度為4×105個/mL，均勻鋪于Matrigel基質膠預包備的96孔板中，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在培養(yǎng)2、4、6、8、10 h時，使用倒置相差顯微鏡觀察并拍照記錄隨機視野中的完整血管腔環(huán)樣結構，用Image J軟件對視野內的成管節(jié)點數(shù)、交叉點數(shù)、血管分支數(shù)、主段長度等進行測量，并作統(tǒng)計分析。

1.7" 細胞內ROS檢測

采用特異性熒光探針DCFH-DA檢測PAM處理各組細胞內總ROS的含量。用不同處理時間的PAM培養(yǎng)各組細胞4 h，棄去舊培養(yǎng)液，每孔加入200 μL的PBS輕柔洗滌2次后棄掉，每孔加入100 μL的DCFH-DA（10 μmol/L）探針工作液，在37 ℃培養(yǎng)箱內孵育30 min后，加入PBS輕柔地沖洗2次，洗去未結合的探針，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8" PAM處理黑色素瘤小鼠

將C57BL/6 小鼠背部用脫毛儀剔除毛發(fā)后，按照常規(guī)消化細胞的步驟消化正常的B16F10細胞，PBS緩沖液重懸細胞至5×105個/mL，于C57BL/6小鼠背部皮下注射100 μL 的B16F10細胞懸液。在建模約7 d后，小鼠皮下腫瘤平均直徑達到5 mm時，根據(jù)LTP處理PAM時間的不同，將荷瘤小鼠隨機分為PAM-0 min（對照組）、PAM-3 min、PAM-5 min、PAM-10 min組，每組8只。瘤內注射不同處理時間的PAM 200 μL，其中PAM 對照組為未處理的培養(yǎng)液，每日注射1次，連續(xù)注射7 d。在注射結束后次日，處死小鼠，剝離腫瘤組織做CD31免疫組織化學檢測。

1.9" CD31免疫組織化學檢測

取1.8項所取腫瘤組織制作石蠟切片（厚度5 μm）。經(jīng)脫蠟至水、抗原修復、30 mL/L甲醇過氧化氫溶液阻斷內源性過氧化物酶，山羊血清封閉處理后，加CD31一抗（1∶5 000）于4 ℃孵育過夜后取出切片，經(jīng)PBS沖洗，滴加生物素化抗兔二抗，37 ℃孵育10 min，滴加新鮮配置的DAB顯色液，室溫顯色5 min，自來水沖洗切片終止顯色，滴加蘇木素復染3 min，乙醇梯度脫水，二甲苯中透化后，晾干，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察，每個切片隨機選取3個視野，進行圖片采集和分析。

1.10" 統(tǒng)計學分析

采用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析，結果以平均值±標準差表示。采用單因素方差分析（ANOVA）比較組間差異，若組間差異顯著，則選擇Dunnett進行事后兩兩分析，Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2" 結" 果

2.1" PAM對HUVEC細胞形態(tài)的影響

2.2" PAM對HUVEC細胞活力的影響

與PAM-0 s（對照組）相比，*Plt;0.05。

2.3" PAM對HUVEC血管生成的影響

2.4" PAM對HUVEC細胞周期的影響

與PAM-0 s（對照組）相比，*Plt;0.05。

與PAM-0 s（對照組）相比，*Plt;0.05，**Plt;0.01，****Plt;0.000 1。

2.5" PAM對HUVEC細胞內ROS水平的影響

2.6" PAM對腫瘤生長的影響

2.7" PAM對腫瘤組織中CD31表達的影響

與PAM-0 s（對照組）相比，*Plt;0.05，**Plt;0.01。

3" 討" 論

近年來大量研究表明，LTP能顯著抑制癌細胞的增殖和轉移，可以抑制癌癥的進展和發(fā)展。LTP對癌細胞有選擇性殺滅的能力，對正常細胞損傷極?。?0］，因此在腫瘤治療方面顯示出極大的潛力。LTP抗腫瘤作用機制主要表現(xiàn)為破壞DNA結構等誘導腫瘤細胞凋亡、降低癌細胞的侵襲及遷移等［11］。腫瘤生長、發(fā)育和轉移與血管生成相關，腫瘤微環(huán)境中的內皮細胞通過調節(jié)血管生成在癌癥發(fā)生和進展中發(fā)揮著關鍵作用。CD31參與血管形成等多個生理過程，且抗原在血管細胞上廣泛分布，因此，采用免疫組織化學法檢測其表達可作為判斷機體血管生成的指標［12］。在本研究中，PAM-45 s、PAM-60 s、PAM-75 s組HUVEC 的活力顯著抑制，影響細胞周期并抑制血管生成；黑色素瘤小鼠PAM-5 min、PAM-10 min組的腫瘤組織中CD31的表達降低。

研究表明，PAM處理可以增加細胞內ROS的產(chǎn)生。ROS在調控氧化還原信號通路中起關鍵作用，低濃度ROS是一種細胞內信號分子，參與調節(jié)內皮細胞的增殖、遷移與分化，刺激內皮細胞VEGF的表達［13］，促進血管生成和組織修復［14］，而高濃度的ROS有強烈的細胞毒作用，可以使內皮細胞凋亡與壞死，抑制血管生成［15］。ROS已被證明通過靶向轉錄因子或腫瘤抑制基因參與血管生成，如激活蛋白1 （AP-1）、缺氧誘導因子1α （HIF-1α）等［16-17］。本研究中PAM以時間和劑量依賴方式抑制血管內皮細胞的增殖，用不同時間的PAM孵育HUVEC 24 h后，采用特異性熒光探針檢測細胞內ROS變化，結果表明，與對照組相比，各PAM處理組細胞內H2O2熒光強度均升高；45 s、60 s和75 s處理組細胞內NO水平明顯增高。即細胞內ROS水平隨著PAM處理時間的延長而增高。

KALGHATGI等［18］研究表明，短時間DBD-LTP處理可以促進內皮細胞增殖，與本研究結果一致。這提示LTP可能是一種劑量依賴性促進或抑制內皮細胞介導血管生成的新療法，這為將LTP應用于腫瘤治療提供了新思路。在后續(xù)的實驗中將開展LTP誘導B16細胞、HepG2細胞后，與HUVEC共培養(yǎng)，探索抑制黑色素瘤、肝癌等實體腫瘤血管生成的最佳劑量及機制，為LTP用于抑制腫瘤血管生成的臨床應用奠定實驗基礎。

綜上，短時間PAM能促進HUVEC細胞的增殖能力和血管生成；而長時間PAM處理則抑制HUVEC的細胞活力，影響細胞的血管生成；PAM處理抑制黑色素瘤小鼠血管生成。這可能與PAM處理改變了細胞內ROS的含量，影響了參與血管形成的相關因子有關。后續(xù)需要進一步對機制進行研究。

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（編輯" 國" 榮）