摘要：

目的" 分析漆黃素對(duì)大鼠靜脈血栓形成的影響。方法" 70只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及45、15、5 mg/kg漆黃素組和阿司匹林組（47 mg/kg），分別每天1次灌胃相應(yīng)藥物（假手術(shù)組和模型組分別給予5 g/L羧甲基纖維素鈉溶液10 mL/kg），連續(xù)7 d。末次給藥1 h后，麻醉大鼠，用絲線結(jié)扎下腔靜脈和左腎靜脈交叉下方部位（假手術(shù)組不結(jié)扎），縫合腹壁。2 h后重新打開(kāi)腹腔，用動(dòng)脈夾封閉距結(jié)扎處1.5 cm外的其他靜脈分支，腹主動(dòng)脈采血（以38 g/L枸櫞酸鈉∶全血為1∶9抗凝）；采血后剪取下腔靜脈和左腎靜脈交叉結(jié)扎點(diǎn)遠(yuǎn)心端1 cm靜脈血栓，分離血栓，用濾紙吸干殘血，稱重并記錄?？鼓x心后取血漿，按ELISA試劑盒檢測(cè)血漿抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）、蛋白酶C（PC）、纖溶酶原（PLG）和纖溶酶原激活物抑制劑（PAI-1）的含量。結(jié)果" 與模型組相比，45 mg/kg漆黃素組和阿司匹林47 mg/kg組血栓質(zhì)量降低（Plt;0.01）；漆黃素3個(gè)劑量組AT-Ⅲ含量升高（均Plt;0.05）；45 mg/kg漆黃素組PC含量升高，而PLG和PAI-1含量均降低（均Plt;0.05）。結(jié)論" 漆黃素具有體內(nèi)抗靜脈血栓形成的作用，其作用與AT-Ⅲ和PC上調(diào)，PLG和PAI-1下調(diào)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：漆黃素；大鼠；靜脈血栓；凝血因子

中圖分類號(hào)：R965.1""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.7652/jdyxb202403006

收稿日期：2023-07-09"" 修回日期：2023-11-21

基金項(xiàng)目：陜西省科技計(jì)劃項(xiàng)目（No. 2017SF-345）；西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院科研項(xiàng)目

（No. XYFYPT-2020-02）

Supported by the Project of Shaanxi Science and Technology Agency （No. 2017SF-345） and the Scientific Research Project of the First Affiliated Hospital of Xi’an Medical College （No. XYFYPT-2020-02）

通信作者：龍麗輝，藥理學(xué)博士，教授，主任藥師. E-mail：llhbjd@126.com

網(wǎng)絡(luò)出版地址：https：//link.cnki.net/urlid/61.1399.R.20240308.1443.004 （2024-03-11）

Effect of fisetin against venous thrombosis in rats and its mechanism

LONG Lihui， WEI Shuang， LIU Qing， YAO Yang，

DONG Juanni， CHANG Yuanyuan， WEN Enhui

（Department of Clinical Pharmacy， the First Affiliated Hospital of

Xi’an Medical College， Xi’an 710077， China）

ABSTRACT：

Objective" To analyze the effect of fisetin against venous thrombosis in rats. Methods" Seventy SD rats were randomly divided into the following groups： sham-operation group， model group， fisetin 45 mg/kg， 15 mg/kg， 5 mg/kg groups， and aspirin group （47 mg/kg）. The corresponding medication was administered by gavage once a day consecutively （the sham-operation group and the model group were given 0.5% carboxymethyl cellulose sodium solution with 10 mL/kg， respectively） for 7 consecutive days. One hour after the last administration， the rats were anesthetized， the lower part of the intersection of inferior vena cava and left renal vein was ligated with silk thread （no ligation in the sham-operation group）， and the abdominal wall was sutured. Two hours later， the abdominal cavity was reopened， the other venous branches 1.5 cm away from the ligation site were closed with the artery clamp， and blood was collected from the abdominal aorta. The anticoagulant ratio of 3.8% sodium citrate∶whole blood was 1∶9.The venous thrombus 1 cm down from the ligation point of the intersection of inferior vena cava and left renal vein was cut and the thrombus was separated. The residual blood was dried with filter paper， weighed and recorded. Plasma was taken after anticoagulant blood centrifugation. The levels of plasma antithrombin-Ⅲ （AT-Ⅲ）， protease C （PC）， plasminogen （PLG）， and plasminogen activator inhibitor （PAI-1） were detected by ELISA kits. Results" Compared with the model group， the weight of thrombus in fisetin 45 mg/kg group and aspirin 47 mg/kg group decreased （Plt;0.01）. The content of AT-Ⅲ in three fisetin groups increased （all Plt;0.05）. The content of PC in fisetin 45 mg/kg increased （Plt;0.05）. The content of PLG and PAI-1 in fisetin 45 mg/kg group decreased （both Plt;0.05）. Conclusion" Fisetin has the effect against venous thrombosis in vivo， and the effect is related to the upregulation of AT-Ⅲ and PC and the downregulation of PLG and PAI-1.

KEY WORDS： fisetin; rat; venous thrombosis; coagulation factor

深靜脈血栓是下肢靜脈回流障礙性疾病，可影響人們正常生活，嚴(yán)重時(shí)將危及生命。研究表明，住院危重癥患者下肢深靜脈血栓發(fā)病率為10.2%，對(duì)患者的生存構(gòu)成威脅［1］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)達(dá)國(guó)家深靜脈血栓的年發(fā)病率約1%，死亡率約12%［2］。本研究中黃櫨藥材的主要成分漆黃素，屬于黃酮類化合物，據(jù)報(bào)道其具有抗癌、抗炎、抗氧化和抗凝血等作用［3-5］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)漆黃素具有體內(nèi)外抗凝血和體外抗血栓作用［5-6］。目前尚未見(jiàn)有關(guān)漆黃素對(duì)體內(nèi)靜脈血栓影響的研究報(bào)道。本研究觀察漆黃素在體內(nèi)對(duì)靜脈血栓形成的影響及其機(jī)制。

1" 材料與方法

1.1" 藥品試劑與主要儀器

檸檬酸鈉（批號(hào)：20201008）、氯化鈉（批號(hào)：20200102）購(gòu)自天津市天力化學(xué)試劑有限公司；漆黃素（含量≥98%）（批號(hào)：K14A9558785，上海源葉生物科技有限公司）；75%乙醇（批號(hào)：20210103，三原宏松衛(wèi)生消毒用品廠）；阿司匹林腸溶片（批號(hào)：BU55501，拜爾醫(yī)藥保健有限公司）；水合氯醛（批號(hào)：20210105，上海山浦化工有限公司）；羧甲基纖維素鈉（批號(hào)：20210126，天津市科密歐試劑有限公司）；血漿抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）、蛋白酶C（PC）、纖溶酶原（PLG）和纖溶酶原激活物抑制劑（PAI-1）ELISA試劑盒（批號(hào)：20210324，南京建成生物工程研究所）。

TJ78-2型離心機(jī)（上海轉(zhuǎn)速表廠）；Multiskan FC酶標(biāo)儀（賽默飛世爾儀器有限公司）；HH-2型恒溫水浴鍋（常州越新儀器制造有限公司）；VortexGenie5渦旋震蕩器（海門其林貝爾儀器制造有限公司）；移液槍（上海萬(wàn)島儀器科技有限公司）。

1.2" 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠70只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（陜）2018-001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（陜）2020-001，動(dòng)物使用過(guò)程符合陜西省動(dòng)物管理委員會(huì)條例。動(dòng)物房室溫（25±3）℃，相對(duì)濕度（30～70）%。按性別分籠飼養(yǎng)，喂標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水。

1.3" 大鼠靜脈血栓模型制備及實(shí)驗(yàn)分組

取SD大鼠70只，隨機(jī)分成6組，假手術(shù)組10只，其余各組12只，分別為陰性對(duì)照組（假手術(shù)組）、模型組、漆黃素3個(gè)劑量組［7］（45、15、5 mg/kg）和阿司匹林（47 mg/kg）陽(yáng)性對(duì)照組（阿司匹林組）。

假手術(shù)組和模型組分別給予灌胃5 g/L羧甲基纖維素鈉溶液（10 mL/kg），漆黃素組與阿司匹林組分別給予不同濃度的漆黃素、阿司匹林5 g/L羧甲基纖維素鈉溶液。各組動(dòng)物按分組分別連續(xù)灌胃給藥7 d，1次/d。每天灌胃前，記錄各組動(dòng)物體質(zhì)量。

1.4" 收取靜脈血栓及血液標(biāo)本

各組大鼠在縫合腹壁2 h后，觀察各組大鼠的存活率。麻醉后重新打開(kāi)腹腔［12-13］，動(dòng)脈夾或止血鉗封閉距結(jié)扎處1.5 cm外的其他靜脈分支，剪取結(jié)扎點(diǎn)遠(yuǎn)心端的1 cm靜脈血管，分離血管內(nèi)血栓［14］，用濾紙吸干殘血，稱重并記錄。

剪下遠(yuǎn)心端的1 cm靜脈血管后，立即腹主動(dòng)脈采血6 mL/只，以38 g/L枸櫞酸鈉∶全血為1∶9抗凝，混勻，抗凝血液于3 500 r/min離心15 min，備用。

1.5" ELISA試劑盒檢測(cè)血漿中AT-Ⅲ、PC、PLG及PAI-1的含量

試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)血漿樣本中各指標(biāo)的含量。向預(yù)先包被了抗體的酶標(biāo)孔中加入樣本，再加入生物素標(biāo)記的識(shí)別抗原，于37 ℃孵育30 min，兩者與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合形成免疫復(fù)合物，經(jīng)PBST洗滌除去未結(jié)合的生物素抗原，然后加入親和素-HRP，37 ℃孵育30 min，親和素-HRP與生物素抗原結(jié)合，洗滌后結(jié)合的HRP催化TMB（四甲基聯(lián)苯胺）成藍(lán)色，隨后在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色，在450 nm波長(zhǎng)下有吸收峰，測(cè)定吸光值。吸光度與樣本中抗原的濃度均呈負(fù)相關(guān)［15］。

1.6" 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 26.0分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行兩組以上數(shù)據(jù)比較，采用非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間數(shù)據(jù)比較， Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用GraPhPad Prism 5.0軟件作圖。

2" 結(jié)" 果

2.1" 大鼠存活率及體質(zhì)量變化

觀察顯示，每天給藥后大鼠健康狀態(tài)良好，行為體征、活動(dòng)、精神狀態(tài)等均正常。末次給藥1 h后進(jìn)行手術(shù)，各組大鼠術(shù)后2 h的存活率為100%。

2.2 "大鼠靜脈血栓質(zhì)量的比較

與模型組（Model）比較，*Plt;0.05，**Plt;0.01。

2.3" 漆黃素對(duì)大鼠靜脈血栓模型AT-Ⅲ的影響

2.4" 漆黃素對(duì)大鼠靜脈血栓模型PC的影響

2.5" 漆黃素對(duì)大鼠靜脈血栓模型PLG的影響

2.6" 漆黃素對(duì)大鼠靜脈血栓模型PAI-1的影響

A：AT-Ⅲ含量檢測(cè)；B：PC含量檢測(cè)；C：PLG含量檢測(cè)；D：PAI-1含量檢測(cè)。與模型組（Model）比較，*Plt;0.05，**Plt;0.01；與假手術(shù)組（Sham operation）比較，▲Plt;0.05。

3" 討" 論

AT-Ⅲ是一種從肝臟中產(chǎn)生的糖蛋白，由多個(gè)氨基酸組成，是人體血漿內(nèi)主要的抑制凝血活性物質(zhì)，可滅活凝血系統(tǒng)的幾種酶類。AT-Ⅲ可以直接抑制滅活凝血酶，并且可擾亂血小板聚集，從而發(fā)揮抗凝血作用。據(jù)報(bào)道，AT-Ⅲ可以抑制血液中75%的凝血酶活力，血漿里AT-Ⅲ活性小于70%時(shí)，血漿的抗凝血活性下降，加大血栓形成概率［16］。AT-Ⅲ活性可反映體內(nèi)的凝血系統(tǒng)情況，在AT-Ⅲ消耗加大或生成下降時(shí)，都會(huì)加大血栓形成概率，AT-Ⅲ含量越高，抗血栓作用越好。血漿中AT-Ⅲ病理性減少或缺乏時(shí)，常見(jiàn)于先天性AT-Ⅲ缺乏癥和獲得性AT-Ⅲ缺乏（常見(jiàn)于外科手術(shù)后、血栓性疾病和血栓前狀態(tài)等）。病理性增高時(shí)，常見(jiàn)于再生障礙性貧血、腎移植、尿毒癥和血友病等疾病。本研究顯示，漆黃素抗大鼠體內(nèi)靜脈血栓形成可通過(guò)AT-Ⅲ上調(diào)作用，且各劑量組呈劑量依賴性特點(diǎn)。

PC是血漿中的主要抗凝物質(zhì)之一，其被激活后為APC（激活后的PC），進(jìn)而通過(guò)促進(jìn)多種凝血因子酶解，抑制凝血系統(tǒng)而發(fā)揮抗血栓形成作用［17］。PC途徑的缺失會(huì)使靜脈血栓形成增加，生理作用時(shí)使凝血系統(tǒng)受到抑制，使血栓延緩形成。本研究顯示，漆黃素大劑量組可使PC上調(diào)，發(fā)揮了抗血栓形成作用；中、小劑量漆黃素組的PC有升高趨勢(shì)。

纖溶是分解液化血液凝固過(guò)程中所形成的纖維蛋白的一種過(guò)程，纖溶激活物和抑制物以及纖溶的一系列酶促反應(yīng)，總稱為纖溶系統(tǒng)。纖溶系統(tǒng)主要由PLG、PAI-1及t-PA等組成。PLG于肝臟中合成，存在于血漿中，是一種單鏈糖蛋白，其主要作用是在各種纖溶酶原激活劑作用下，在纈氨酸、精氨酸處裂解，并且形成纖溶酶，對(duì)纖維蛋白原和一些凝血因子裂解和降解，并且使纖維蛋白凝塊溶解，起著溶栓和抗凝血的生理作用。血漿中PLG病理性增高時(shí)，表明其激活受阻，常見(jiàn)于血栓性疾病和血栓前狀態(tài)，如心絞痛、糖尿病和深靜脈血栓形成等疾病。病理性降低時(shí)，表明其激活過(guò)度，常見(jiàn)于DIC、纖溶亢進(jìn)癥和先天性PLG缺乏癥等疾病。

PAI-1屬于一種單鏈球形糖蛋白，在體內(nèi)主要分布于肝臟和脾臟，血漿中也含有PAI-1，但其含量極少，只有3%～5%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，PAI-1可以抑制t-PA使其快速失活［18］，是纖溶系統(tǒng)的關(guān)鍵抑制因子，產(chǎn)生促血栓形成作用。PAI-1可以特異性與t-PA按1∶1比例結(jié)合形成復(fù)合物，使其失活，從而抑制PLG的激活。本研究結(jié)果顯示，漆黃素可以通過(guò)下調(diào)PLG和PAI-1，從而產(chǎn)生抗血栓形成作用。本實(shí)驗(yàn)中所用陽(yáng)性對(duì)照藥物阿司匹林可能不通過(guò)AT-Ⅲ、PLG途徑發(fā)揮抗血栓形成作用，此結(jié)論與阮灝等［19］在益氣活血復(fù)方抗血栓作用機(jī)制研究中的結(jié)果一致。

因嚙齒類動(dòng)物和人類的基因具有相似性，且血管方便操作，其價(jià)格低、繁殖培養(yǎng)快、可操作性強(qiáng)和手術(shù)耐受性大等因素，本實(shí)驗(yàn)選用SD大鼠，結(jié)扎其下腔靜脈，使其下腔靜脈血管管腔內(nèi)形成血栓，建成大鼠靜脈血栓模型。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，手術(shù)操作完成縫合大鼠后，為防止其體溫過(guò)低致死，將其放在電暖氣旁，并保證其四肢不要束縛太緊。麻醉后的大鼠可能會(huì)出現(xiàn)咬舌現(xiàn)象，為防止其舌頭堵住氣管致死，注意保持舌頭自由垂向口外，使其呼吸平穩(wěn)。手術(shù)結(jié)扎操作完成后，在等待的2 h過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)大鼠容易蘇醒，可補(bǔ)充少量麻醉劑以維持其麻醉狀態(tài)。

本研究采用體內(nèi)靜脈血栓造模方法以及ELISA法，測(cè)定血栓形成過(guò)程中相關(guān)因子的含量表達(dá)，證明了漆黃素能調(diào)節(jié)AT-Ⅲ、PC等因子的體內(nèi)水平。但具體機(jī)制還需從漆黃素誘導(dǎo)凝血過(guò)程相關(guān)基因表達(dá)級(jí)聯(lián)效應(yīng)以及漆黃素的構(gòu)效關(guān)系等方面進(jìn)行進(jìn)一步探索性研究。

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（編輯" 國(guó)" 榮）