◎ 杜丹丹，蘇馨蓮，王兆明,，周 輝,

（1.蒙城綠色食品產業(yè)研究院，安徽 蒙城 233500；2.合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院，安徽 合肥 230009）

魔芋葡甘聚糖（Konjac Glucomannan，KGM）是從魔芋中提取的一種中性多糖，其具有良好的保水性、流變性、增稠性和膠凝性，被廣泛應用于食品、生物醫(yī)學、工業(yè)、農業(yè)等領域[1]。魔芋葡甘聚糖可作為制作仿生食品的原料，如魔芋素毛肚、素蝦仁等。由于魔芋葡甘聚糖具有降低血糖水平、抗肥胖、抗癌、抗膽固醇、提高免疫力和改善便秘等功效，魔芋產品在市場上備受消費者的喜愛[2-3]。然而，魔芋產品貨架期短，需相關人員進一步研究魔芋制品易感腐敗微生物，開發(fā)綠色防腐技術，以延長其產品貨架期。

丁香、大蒜、肉桂在食品工業(yè)中作為調味劑被廣泛使用，丁香、大蒜、肉桂精油均具有較好的抗菌活性[4]。SUSANA 等[5]發(fā)現(xiàn)，在沙拉醬中使用丁香精油納米乳液可以抑制酵母菌的生長繁殖。SAGAR等[6]比較了涂有丁香納米乳液和未涂精油納米乳液的雞爪，觀察到涂有丁香納米乳液的雞爪保質期更長，且納米乳液在較長時間內保持了產品的質量和感官屬性。大蒜精油可抑制腐乳中蠟樣芽孢桿菌的生長，在天然定向防腐劑方面具有很大的潛力[7]。研究表明，肉桂精油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等致病菌具有較強的抑菌性[8]，使用肉桂精油作為活性劑的納米乳液，對不同微生物表現(xiàn)出了優(yōu)異的抗菌性能[9-10]。PUNCHARAT 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，與丁香精油相比，丁香精油納米乳液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌表現(xiàn)出更好的抗菌活性。

本試驗以玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸鈉和植物精油（肉桂精油、大蒜精油、丁香精油）為基本成分，制備精油納米乳液，并將其應用于魔芋素毛肚保鮮，再通過菌落總數(shù)、乳液表征等指標，評價植物精油納米乳液對魔芋素毛肚的保鮮效果，以篩選出抑菌效果最佳的納米乳液，為魔芋制品的綜合利用與開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

魔芋膠（成都晗晨生物科技有限公司）；檸檬酸（浙江一諾生物工程有限公司）；乙酰化雙淀粉己二酸酯（河南萬邦化工科技有限公司）；氫氧化鈣（江西明源高新技術材料有限公司）；玉米蛋白、大豆分離蛋白（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；肉桂精油、大蒜精油、丁香精油（仲景食品有限公司）；PCA 培養(yǎng)基、CFC 培養(yǎng)基、不動桿菌培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基（青島海博生物技術有限公司）。

1.2 儀器設備

高剪切乳化均質機（上海三申醫(yī)療器械有限公司）；全自動旋蒸儀（鄭州長城科工貿有限公司）；離心機（安徽寶萊科技有限公司）；HH 數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠）；真空包裝機（安盛科技有限公司）。

1.3 樣品制備

1.3.1 魔芋樣品制備

將9 g 淀粉與10.5 g 魔芋粉混勻，再加入300 mL 蒸餾水，在60 ℃下水浴糊化30 min，再加入1% Ca(OH)2溶液50 mL，高速攪打混勻，在90 ℃下水浴蒸煮2 h，使用400 mL 2%檸檬酸溶液脫堿30 min，漂洗之后，加入適量香辛料（食用油、鹽、五香粉和辣椒粉），攪拌均勻，真空包裝備用。

1.3.2 植物精油納米乳液制備

本研究參考HUA 的方法[11]，用玉米醇溶蛋白和75%乙醇配制成20 mg·mL-1的玉米醇溶蛋白溶液，磁性攪拌器攪拌過夜；用酪蛋白酸鈉和純水配制成4 mg·mL-1的酪蛋白酸鈉，磁性攪拌器攪拌過夜。磁性攪拌器攪拌酪蛋白酸鈉的同時，用移液槍將20 mg·mL-1的玉米醇溶蛋白溶液按1∶10 的比例逐滴滴入4 mg·mL-1的酪蛋白酸鈉溶液，繼續(xù)磁性攪拌30 min。將混合液倒入旋轉式蒸發(fā)器中進行乙醇蒸發(fā)，水浴溫度40 ℃，轉速20 r·min-1，蒸發(fā)至液體基本上無氣泡。為防止液體倒流現(xiàn)象，乙醇蒸發(fā)過程中需要加入一些氣體。蒸發(fā)完成后，倒入量筒中，加純水至蒸發(fā)前混合液體積，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。向上述溶液中分別加入1% v/v 肉桂、丁香、大蒜精油，以15 000 r·min-1的速度在均質機中均質3 min（每均勻40 s，停止20 s）。

1.4 腐敗菌鑒定和分離

參考江楊陽[12]的方法略作修改。將5 g 樣品混合在45 g 無菌生理鹽水中，均質，將1 mL 樣品液加入裝有9 mL 無菌生理鹽水試管中，適量稀釋。取3 種相鄰濃度梯度（10-4、10-5、10-6）的樣品液各0.1 mL涂敷在PCA（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌）培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基（全部真菌）、CFC 培養(yǎng)基（假單胞菌）和不動桿菌培養(yǎng)基（不動桿菌）等平板上封口膜密封培后，放到適宜溫度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d，通過各培養(yǎng)基上菌落生長情況及菌落總數(shù)，判斷導致樣品腐敗的主要微生物及優(yōu)勢菌種。

1.5 抑菌效果

將10 g 樣品分別添加適量3 種乳液拌勻真空分裝后，以不加精油乳液的樣品作為對照組，將4 組樣品分別在25 ℃與4 ℃下貯藏，25 ℃下貯藏的樣品在2、4、6、8、10、12 d 進行分析，4 ℃下貯藏的樣品在3、6、9、12、15、18 d 進行分析。將不同時間的樣品接種于優(yōu)勢腐敗菌的選擇性培養(yǎng)基上進行菌落總數(shù)檢定，根據(jù)菌落生長情況，篩選出對優(yōu)勢腐敗菌抑菌效果最好的精油乳液。

1.6 抑菌活性

（1）最低抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）的測定采用二倍稀釋法[13]。以96孔無菌培養(yǎng)板為基礎，在每個孔板中加入100 μL 相應菌株的液體培養(yǎng)基，第1 行加入100 μL 無菌水作為陰性對照，第12 行加入100 μL 菌培養(yǎng)液作為陽性對照；抑菌劑倍比稀釋方法：在第2 行加入 3 種植物精油納米乳液100 μL，吹吸3 次后，吸取100 μL 加入下一行中（初始精油納米乳液濃度為50 mg·mL-1）。直到11 排，11 排吹吸混勻，取100 μL 棄用。最后，于2～12 行各加入菌懸液100 μL，在36 ℃下培養(yǎng)36～48 h。

（2）最小抑菌濃度的判斷。如果菌液是透明的，則該濃度下精油納米乳液顯示出抑菌作用；如果菌液渾濁，有沉淀物或絮狀懸浮物，或在液面以下或孔壁上形成一層菌膜，則該濃度下精油納米乳液無抑菌作用。在此基礎上，分別測定每種抑菌劑在培養(yǎng)板上對單株細菌的MIC 值。

1.7 乳液濃度優(yōu)化

對篩選出的乳液設置0.2%、0.4%、0.6%、0.8% v/v和1.0% v/v 的精油濃度梯度，以原樣品為對照組進行抑菌活性檢定，篩選出合適的精油濃度。

1.8 植物精油納米乳液表征

（1）粒徑、PDI、Zeta電位測定。為了避免多次散射，用蒸餾水將乳液稀釋100 倍。利用Zeta 電勢分析儀測量溶液的顆粒大小、多分散度分布指數(shù)（Polydiseperse Index，PDI）、Zeta 電位。每個樣品重復3 次取平均值。

（2）貯藏穩(wěn)定性。取50 mL 各濃度梯度乳液于密封樣品瓶中，在4 ℃和25 ℃下分別放置0、4、8、12、16 d，在每個測定點處測定粒徑和Zeta 電位。

1.9 數(shù)據(jù)與分析

結果采用平均值表示，用Origin 2021 對數(shù)據(jù)進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 3 種植物精油納米乳液的抑菌效果

《蒟蒻（魔芋）素食品》（Q/LHJS0001S—2019）規(guī)定，魔芋制品中菌落總數(shù)不應高于5 l g CFU·g-1。由圖1 可知，室溫組（25 ℃）各微生物的對數(shù)生長期主要在0～4 d，冷藏環(huán)境（4 ℃）下微生物對數(shù)生長期主要在0～9 d，在對數(shù)生長期，大腸桿菌與金黃色葡萄球菌都在迅速增長。在之后的貯藏期內，菌落總數(shù)趨于穩(wěn)定，如室溫組的金黃色葡萄球菌甚至出現(xiàn)菌落數(shù)回落的現(xiàn)象，說明第12 d，樣品內的營養(yǎng)物質減少或有害廢物積累到一定程度后使腐敗菌不再生長，金黃色葡萄球菌的生長已經(jīng)達到了峰值室溫下對照組樣品在第4 d 便已超過閾值，為5.5 l g CFU·g-1，肉桂、丁香、大蒜納米精油乳液分別將魔芋制品中菌落總數(shù)超標的期限延長至12、10、8 d，說明3 種精油納米乳液對樣品的微生物生長均具有抑制效果，且肉桂精油的抑菌能力明顯高于其他2 種精油，因此選用肉桂精油進行濃度優(yōu)化實驗。由4 ℃冷藏組的菌落生長情況可以看出，低溫對腐敗菌的生長有抑制效果，與植物精油納米乳液對樣品腐敗菌的抑制具有協(xié)同作用。

圖1 添加3 種精油納米乳液的樣品菌株濃度分析圖

2.2 精油納米乳液抑菌效果分析

根據(jù)各個培養(yǎng)基的菌落生長情況，發(fā)現(xiàn)孟加拉紅培養(yǎng)基、CFC 培養(yǎng)基、不動桿菌培養(yǎng)基的各梯度菌落生長情況幾乎為0，而PCA 培養(yǎng)基的菌落生長情況良好。根據(jù)菌落的顏色與形態(tài)判斷導致樣品腐敗的主要微生物為金黃色葡萄球菌，另有極少量腸桿菌存在。MIC 測定結果驗證了3 種精油納米乳液對樣品平板計數(shù)分離出來的2 種單菌株的抑菌能力大小，并具體顯示了其產生抑菌效果的濃度范圍。由表1 可知，肉桂精油納米乳液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌較敏感，丁香精油納米乳液對大腸桿菌較為敏感，大蒜精油納米乳液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌敏感度較低。金黃色葡萄球菌的總體抑菌效果為肉桂精油>丁香精油>大蒜精油；大腸桿菌的總體抑菌效果為丁香精油=肉桂精油>大蒜精油，說明肉桂精油納米乳液的抑菌效果較好。因此，選擇肉桂精油納米乳液進行表征和優(yōu)化。

表1 3 種精油對2 種細菌的最小抑菌濃度表

2.3 肉桂精油納米乳液濃度優(yōu)化實驗

設置肉桂精油體積濃度梯度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%。由圖2 可知，在室溫條件下，肉桂精油納米乳液的抑菌能力與精油濃度成正相關，且濃度為0.8%與1.0%時的菌落生長情況相近，說明在0.8%的肉桂精油濃度下納米乳液的抑菌能力已接近飽和。

圖2 不同濃度肉桂精油納米乳液的抑菌能力圖

2.4 植物精油納米乳液表征

粒度、PDI、Zeta 電位是評價乳狀液系統(tǒng)均勻度和穩(wěn)定性的重要指標[14]。當PDI＜0.3，Zeta 電位≥30 mV 或≤-30 mV 時，該體系的穩(wěn)定性良好[11]。由圖3 可知，肉桂精油納米乳液Zeta 電位的絕對值均＞30 mV；肉桂精油納米乳液的粒徑隨著肉桂精油體積濃度的增大而增大；肉桂精油體積濃度為0.2%、0.4%、0.6%和0.8%時，PDI＜0.3，表明這4 個濃度梯度的肉桂精油納米乳液體系較為穩(wěn)定。

圖3 各濃度梯度肉桂精油納米乳液的Zeta 電位、粒徑與PDI 圖

肉桂精油納米乳液在室溫（25 ℃）和冷藏（4 ℃）條件下貯藏過程中的平均粒徑以及Zeta 電位變化見圖4、圖5。2 種貯藏條件下肉桂精油的體積濃度為0.2%、0.4%、0.6%和0.8%的乳液在貯藏過程中粒徑變化較??；肉桂精油體積濃度為0.4%、0.6%、0.8%乳液的Zeta電位的絕對值在貯藏期高于30 mV。一般認為，Zeta 電位絕對值在25 mV 以上的乳液體系，具有足夠的電斥力以避免乳液顆粒聚集[15-16]。同時，Zeta 電位值為負，表明液滴帶有負電荷，在貯藏過程中可以提供靜電斥力抑制乳液發(fā)生絮凝的現(xiàn)象。因此，添加肉桂精油0.4%、0.6%、0.8%的納米乳液貯藏穩(wěn)定性較好。

圖4 肉桂精油納米乳液貯藏過程中平均粒徑變化圖

圖5 肉桂精油納米乳液貯藏過程中Zeta 電位變化圖

3 結論

本研究通過比較分析3 種植物精油納米乳液對魔芋素毛肚的抑菌能力，篩選出最適精油。結果顯示，①魔芋素毛肚的致腐微生物主要為金黃色葡萄球菌，同時存在少量大腸桿菌，換言之，金黃色葡萄球菌為魔芋制品中的優(yōu)勢腐敗菌。②經(jīng)過平板涂布計數(shù)與MIC 測定實驗證明，肉桂精油對金黃色葡萄球菌與大腸桿菌的組合具有最好的抑菌效果。③對肉桂精油濃度梯度進行優(yōu)化實驗，通過抑菌能力實驗、粒徑、Zeta 電位、PDI 和貯藏穩(wěn)定性等方法發(fā)現(xiàn)，0.8%體積濃度的肉桂精油納米乳液的綜合性能最強，抑菌效果最好。因此，本研究結果可以為魔芋制品的綠色保鮮研究提供參考。