于青 羅少龍 屈萍 賈雨薇 韓凱

(寶雞市婦幼保健院,陜西 寶雞 721000)

遺傳代謝性疾病又稱先天代謝缺陷,多發(fā)生于新生兒時(shí)期。因機(jī)體遺傳物質(zhì)發(fā)生突變,造成多種酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白異?；蚣?xì)胞功能缺陷或異常,最終出現(xiàn)體內(nèi)生化代謝途徑異常的一種疾病[1-2]。由于新生兒遺傳代謝性疾病的篩查包含氨基酸、脂肪酸、有機(jī)酸等40多種物質(zhì),傳統(tǒng)的生化免疫法檢測(cè)一次只能檢測(cè)一種物質(zhì),耗時(shí)較長(zhǎng)、費(fèi)用較高,且由于受新生兒剛出生機(jī)體代謝物濃度影響,生化免疫法檢測(cè)時(shí)機(jī)體容易出現(xiàn)誤診、漏診,導(dǎo)致此病診斷的難度加大[3]。高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)技術(shù)可在5 min內(nèi)對(duì)幾十種代謝性小分子物質(zhì)進(jìn)行定性和定量檢測(cè),有效提高了篩查的精準(zhǔn)度和效率,已成為目前新生兒遺傳代謝性疾病的篩查的主要手段[4]。本文探討高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(HPLC-MS/MS)在新生兒遺傳代謝性疾病篩查的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年9月至2022年4月我院接受遺傳代謝性疾病篩查的301例新生兒,其中男167例,女134例,均出生3～9 d,平均出生時(shí)間(4.53±0.38)d,早產(chǎn)兒8例,足月兒293例,門(mén)診新生兒30例,住院部新生兒271例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò),新生兒監(jiān)護(hù)人均知情同意。

1.2標(biāo)本采集 新生兒出生2～7 d內(nèi),經(jīng)充足喂養(yǎng)48 h后,新生兒科專業(yè)護(hù)士將新生兒足跟采血部位進(jìn)行酒精消毒,然后用無(wú)菌采血針采集樣本,取第二滴血滴于干血片,晾干后繼續(xù)滴第二個(gè)孔位,至少采集三個(gè)血斑,采集過(guò)程中,重復(fù)滴血的樣本視為不合格樣本,會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,應(yīng)重新采集[5];采集的血斑直徑應(yīng)大于8 mm,血斑自然晾干后放置4℃冰箱保存,并及時(shí)檢測(cè);對(duì)初篩陽(yáng)性結(jié)果的標(biāo)本,要求立即召回重新采集樣本進(jìn)行復(fù)查。

1.3檢測(cè)及篩查方法

1.3.1儀器與試劑 高效液相-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(型號(hào):QSight 210MD,廠家:perkinelmer),自動(dòng)進(jìn)樣器(型號(hào):QSight HC Autosample MD;廠家:perkinelmer);手動(dòng)打孔器;非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測(cè)試試劑盒 (串聯(lián)質(zhì)譜法)試劑盒(廠家:perkinelmer),甲醇、水等試劑均購(gòu)自O(shè)ceanpak。

1.3.2檢測(cè)方法 手動(dòng)打孔器打孔后,將樣本置于96孔聚丙烯板內(nèi),每孔加入經(jīng)甲醇溶解的內(nèi)標(biāo)萃取液100 μl ,封口膜封閉96孔板后,45℃恒溫震蕩30～45 min;吸取75 uL萃取液至新的96孔板中,封口膜封閉96孔板,HPLC-MS/MS上機(jī)檢測(cè)。

1.4結(jié)果判定 質(zhì)譜結(jié)果參照健康兒童分析結(jié)果的參照范圍確定,對(duì)初篩結(jié)果高于、低于參考范圍的,均認(rèn)定為陽(yáng)性結(jié)果,要及時(shí)聯(lián)系患者家屬進(jìn)行二次復(fù)查,并結(jié)合尿液有機(jī)酸檢測(cè)、酶活性檢測(cè),如再次復(fù)查為陽(yáng)性,建議通過(guò)基因檢測(cè)進(jìn)行診斷。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)通過(guò)EXCEL表格統(tǒng)計(jì)并分析,初篩陽(yáng)性率(%)=初篩陽(yáng)性例數(shù)/總篩查人數(shù),召回率(%)=初篩陽(yáng)性召回例數(shù)/總初篩陽(yáng)性例數(shù);各類(lèi)型遺傳代謝性疾病初篩陽(yáng)性率(%)=各類(lèi)型初篩陽(yáng)性例數(shù)/總初篩陽(yáng)性例數(shù);各類(lèi)型遺傳代謝性疾病確診率(%)=確診例數(shù)/總篩查例數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1新生兒遺傳代謝性疾病篩查情況 301例參與新生兒遺傳代謝性疾病篩查的標(biāo)本中,初篩陽(yáng)性例數(shù)共21例,初篩陽(yáng)性率為0.70%,初篩陽(yáng)性患兒共召回20例,召回率為95.24%,召回患兒再次采用HPLC-MS/MS進(jìn)行新生兒遺傳代謝性疾病復(fù)查,10例患兒仍為陽(yáng)性,復(fù)查患兒全部進(jìn)行基因測(cè)序診斷,最后診斷結(jié)果有3例為確診患兒,見(jiàn)表1。

2.2新生兒遺傳代謝性疾病篩確診患兒詳細(xì)情況 HPLC-MS/MS二次復(fù)查后,經(jīng)基因診斷,3例新生兒遺傳代謝性疾病確診的標(biāo)本中,2例為氨基酸代謝異常病種,分別為精氨酸血癥和瓜氨酸血癥,1例為有機(jī)酸代謝異常病種,即甲基丙二酸血癥,具體復(fù)查結(jié)果及基因診斷結(jié)果如表2所示:

表2 新生兒遺傳代謝性疾病篩確診患兒的詳細(xì)情況

3 討 論

遺傳代謝性疾病可發(fā)病于任何年齡段,但多見(jiàn)于新生兒,早期無(wú)特征性臨床表現(xiàn),常被誤診為感染、精神疾病、心血管疾病等常見(jiàn)的其他疾病,耽誤最佳治療時(shí)間[6]。因此,早篩查、早發(fā)現(xiàn)新生兒遺傳代謝性疾病,對(duì)臨床早干預(yù)、早防控患兒病情惡化意義重大。HPLC-MS/MS技術(shù)作為目前新生兒遺傳代謝性疾病篩查的最佳手段,主要是通過(guò)液相將待檢測(cè)物質(zhì)進(jìn)行初步分離,后將物質(zhì)電離為帶電粒子,識(shí)別并定量測(cè)定帶電粒子的離子峰強(qiáng)度,在短時(shí)間內(nèi)將幾十種代謝產(chǎn)物精準(zhǔn)識(shí)別,實(shí)現(xiàn)了臨床新生兒遺傳代謝性疾病精準(zhǔn)、快速檢測(cè)的要求[7]。

本文結(jié)果顯示,對(duì)301例新生兒進(jìn)行遺傳代謝性疾病篩查,初篩陽(yáng)性患兒21例,初篩陽(yáng)性率為0.70%,其中召回復(fù)查的患兒中,經(jīng)二次復(fù)查,仍有10例為陽(yáng)性,這和已有報(bào)道的上海、淄博等地的篩查結(jié)果差異較大,其原因可能是不同地區(qū)新生兒足跟血采集方式、參考范圍、文化水平不同引起。經(jīng)基因診斷結(jié)果顯示,復(fù)查陽(yáng)性病例中,有3例被確診,確診率為0.9%,總陽(yáng)性確診率高于文獻(xiàn)中報(bào)道多個(gè)地區(qū)的總陽(yáng)性確診率,由此分析,本地區(qū)屬新生兒遺傳代謝性疾病的高發(fā)地區(qū),應(yīng)大范圍開(kāi)展此項(xiàng)目的篩查,同時(shí)應(yīng)普及此項(xiàng)目篩查的重要性。

本文結(jié)果還顯示,確診患兒分別患有精氨酸血癥,瓜氨酸血癥和甲基丙二酸血癥,這符合以往的研究結(jié)果,即HPLC-MS/MS技術(shù)在新生兒遺傳代謝性疾病干血片篩查中,對(duì)判定精氨酸血癥、瓜氨酸血癥、以及甲基丙二酸血癥有顯著特異性[8]。但本結(jié)果中,HPLC-MS/MS技術(shù)假陽(yáng)性率較高,為進(jìn)一步提升篩查性能,需確保標(biāo)本采集質(zhì)量、合理優(yōu)化技術(shù)方法,嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)流程、加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室管理,與多個(gè)相關(guān)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)協(xié)作交流,降低HPLC-MS/MS技術(shù)在新生兒遺傳代謝性疾病篩查的假陽(yáng)性率。

綜上,采用HPLC-MS/MS技術(shù)提高了新生兒遺傳代謝性疾病的篩查效率,對(duì)臨床早發(fā)現(xiàn)、早治療患兒尤為重要,對(duì)降低出生缺陷、提高全民健康素質(zhì)意義深遠(yuǎn),值得在臨床大力推廣應(yīng)用。