令狐克燕 卓召振 匡穎 任凌雁 靳倩 李頔 駱姝琳

(貴州省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳科/產(chǎn)前診斷中心,貴州 貴陽(yáng) 550002)

據(jù)統(tǒng)計(jì),早孕期發(fā)生胚胎停育的概率占自然妊娠的15%～40%。引起自然流產(chǎn)有環(huán)境因素、母體因素、免疫功能異常和胚胎因素,以及其他一些尚不明確的原因[1-4]。胚胎因素中染色體異常是最常見(jiàn)的病因,其中50%～60%的流產(chǎn)與胚胎的染色體異常相關(guān)[5]。

傳統(tǒng)的流產(chǎn)物檢測(cè)手段包括核型分析與熒光原位雜交。核型分析需要對(duì)流產(chǎn)組織進(jìn)行培養(yǎng),耗時(shí)長(zhǎng)且容易被母體細(xì)胞污染,且僅可檢測(cè)大于5Mb的遺傳物質(zhì)改變。熒光原位雜交盡管可以省去細(xì)胞培養(yǎng),但因其現(xiàn)有探針不能對(duì)全基因組進(jìn)行檢測(cè),缺乏整體性[6-7]。

CMA是檢測(cè)片段的單核苷酸多態(tài)性和拷貝數(shù)目變異的技術(shù),它可在全基因組范圍內(nèi)同時(shí)檢測(cè)染色體的數(shù)目異常、結(jié)構(gòu)畸變、嵌合體、多倍體、雜合性缺失、單親二倍體等異常[8-9]。CMA技術(shù)無(wú)需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),可將染色體病的診斷提高到基因水平[10]。本研究在全基因組水平分析引起胚胎停育的遺傳學(xué)病因,并評(píng)估該技術(shù)在臨床流產(chǎn)診斷中的應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年2月至2023年1月在我院確診為“胚胎停育”且要求行流產(chǎn)手術(shù)的患者94例為研究對(duì)象,對(duì)流產(chǎn)組織樣本進(jìn)行CMA檢測(cè)。有2例存在母體細(xì)胞污染,1例未檢測(cè)到胎兒組織,檢測(cè)失敗。成功檢測(cè)流產(chǎn)胚胎91例,成功率高達(dá)96.80%。孕婦年齡21～45歲,孕周6～24周,超聲檢查宮腔內(nèi)見(jiàn)孕囊,有或無(wú)胎芽,無(wú)胎心搏動(dòng)。孕婦血清學(xué)TORCH檢查結(jié)果為陰性,孕期無(wú)有毒有害物質(zhì)接觸史,排除孕婦自身內(nèi)分泌系統(tǒng)異常、支原體及衣原體感染等。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者對(duì)本研究知情同意。

1.2方法 用生理鹽水洗凈流產(chǎn)胚胎組織,使用QIAGEN公司的組織提取試劑盒提取基因組DNA。應(yīng)用Affymetrix公司專注產(chǎn)前領(lǐng)域的CytoScan Optima芯片進(jìn)行檢測(cè)。該芯片探針從CytoScan HD芯片中精選出來(lái),共包括30多萬(wàn)個(gè)拷貝數(shù)分析標(biāo)記,除包含18018個(gè)CNVs探針和148 450個(gè)SNP探針外,還重點(diǎn)加密了既往產(chǎn)前和圍產(chǎn)期研究相關(guān)的396個(gè)基因區(qū)域的探針,能更好地應(yīng)用于產(chǎn)前和圍產(chǎn)期診斷。所得原始數(shù)據(jù)應(yīng)用Affymetrix Chromosome Analysis Suite Sofeware進(jìn)行分析。參照國(guó)際基因組CNVs多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)Decipher、UCSC Genome Browser、OMIM、ISCA、DGV等來(lái)評(píng)估致病性。檢測(cè)報(bào)告嚴(yán)格按照美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)指南,將CNVs分為4個(gè)等級(jí):(1)致病性CNVs;(2)可能致病性CNVs;(3)臨床意義不明CNVs;(4)良性CNVs。檢測(cè)結(jié)果為染色體結(jié)構(gòu)異常的夫婦,進(jìn)行外周血染色體核型分析,判斷是否為平衡易位或倒位攜帶者。

2 結(jié) 果

CMA檢測(cè)結(jié)果:在91例樣本中,檢出正常核型41例(45.05%),異常樣本50例(54.95%),其中數(shù)目異常47例,占異常核型比例94.00%。數(shù)目異常包括常染色體三體28例,占異常核型比例56.00%;特納綜合征8例,占異常核型比例16.00%。三倍體8例,占異常核型比例16.00%;嵌合體3例,占異常核型比例6.00%。結(jié)構(gòu)異常3例,占異常核型比例6.00%。見(jiàn)表1。

表1 50例自然流產(chǎn)胚胎組織CMA檢測(cè)異常結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3 討 論

CMA是一項(xiàng)遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù),該技術(shù)可以對(duì)全基因組進(jìn)行高分辨率檢測(cè),能夠?qū)ψ儺愡M(jìn)行精確定位并計(jì)算實(shí)際基因含量,通過(guò)與正?；蚪M進(jìn)行比對(duì)分析,可以對(duì)相關(guān)臨床癥狀做出合理解釋[11]。

本研究共檢測(cè)94例樣本,檢測(cè)失敗3例,有2例為母體細(xì)胞污染,可能因手術(shù)過(guò)程中胎兒組織受到母血污染所致;1例未檢測(cè)到胎兒組織,可能是稽留流產(chǎn)導(dǎo)致胎兒組織細(xì)胞腐敗所致。成功檢測(cè)91例,其中染色體異常50例,異常檢出率為54.95%,與報(bào)道的異常檢出率30%～60%相符合[12]。檢測(cè)出染色體非整倍體最多,有36例,占異常核型72.00%。

大多數(shù)常染色體非整倍體為胚胎致死性,以16和22號(hào)三體最為常見(jiàn),多數(shù)在孕早期發(fā)生流產(chǎn),少數(shù)13、18、21三體及Turner綜合征或因合并結(jié)構(gòu)畸形于孕中期或晚期被檢出或發(fā)生流產(chǎn)[13]。有研究認(rèn)為染色體非整倍體三體型與母齡增加有較大關(guān)系,卵子老化,減數(shù)分裂紡錘絲與著絲粒結(jié)合錯(cuò)誤導(dǎo)致[14],也有研究發(fā)現(xiàn)非整倍體三體型在低齡組中也占有很大比例。美國(guó)婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會(huì)2007年主張對(duì)所有年齡段孕婦進(jìn)行非整倍體篩查而不僅局限于高齡組[15]。本研究中,非整倍體異常胚胎的孕婦只有2名年齡>35歲,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,因此認(rèn)為年齡并不是導(dǎo)致染色體異常的唯一因素。絕大多數(shù)染色體非整倍體為新發(fā)突變,再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)極低,而D組(13、14、15)和G組(21、22)染色體易發(fā)生羅伯遜易位,再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高[16]。如涉及D、G組染色體非整倍體異常,建議夫婦雙方行核型分析,排除羅伯遜易位的可能,以便對(duì)再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估。

另有研究對(duì)流產(chǎn)組織采用高通量測(cè)序技術(shù)(NGS)的方法進(jìn)行檢測(cè),能發(fā)現(xiàn)芯片平臺(tái)未覆蓋到的CNVs,進(jìn)而發(fā)現(xiàn)新的染色體疾病[17]。但NGS由于無(wú)法進(jìn)行SNP的檢測(cè),對(duì)于整倍體異常和雜合性缺失無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)[18]。本研究共檢測(cè)到三倍體異常8例,占異常核型比例16.00%,如果用NGS的方法進(jìn)行檢測(cè),則會(huì)發(fā)生漏檢。

綜上所述,流產(chǎn)胚胎的遺傳學(xué)診斷是病因?qū)W診斷的主要方法。將CMA技術(shù)應(yīng)用于自然流產(chǎn)患者的臨床診斷中,操作簡(jiǎn)單,分辨率較高,能夠顯著提高染色體異常的檢出率。用流產(chǎn)組織或死亡胚胎組織進(jìn)行檢測(cè),取材方便,對(duì)患者傷害較小,易于被患者及家屬接受。在檢測(cè)時(shí)不需要進(jìn)行培養(yǎng),縮短了等待時(shí)間。因此該項(xiàng)技術(shù)具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值,為自然流產(chǎn)患者病因診斷及再生育風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供更加準(zhǔn)確的臨床建議和遺傳指導(dǎo),前景廣闊,值得推廣。