吳鐘英 周國琴 李鵬

(貴陽市公共衛(wèi)生救治中心,貴州 貴陽 550004)

肝臟因受到諸如酒精、藥物或者病毒感染等引起的慢性損傷不能及時的再生性修復時便會形成以纖維化為主要特征的病理性修復[1]。在這個過程中,肝臟中纖維組織過度沉積、降解減少,從而導致纖維增生和分解不平衡的結(jié)果。反復或持續(xù)的慢性肝實質(zhì)損傷、炎癥可使細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)— 主要成分為膠原纖維合成過多而降解相對不足而最終形成肝纖維化,甚至還可能發(fā)展為肝硬化、肝功能衰竭和肝癌[2]。Sox9是一種高度保守的轉(zhuǎn)錄因子,因其與性別決定基因Y DNA結(jié)合位點具有高度相似性而得名[3]。在正常的肝臟中表達Sox9的肝祖細胞會逐漸分化成替代肝臟內(nèi)的成熟肝細胞[4]。Sox9除作為肝臟祖細胞的特征性分子之外,在多個器官(包括睪丸、胰腺、腸道、大腦、腎臟和心臟)的發(fā)育過程中起重要作用[5-7]并調(diào)控多種生物學過程,比如促進細胞增殖和癌癥的發(fā)生等[8]。本研究從CCl4誘導的肝纖維化中分離出肝細胞,并檢測到肝細胞中的Sox9在肝臟纖維化過程中的增加,在細胞水平探討Sox9在四氯化碳(CCl4)誘導的肝纖維化模型中的作用機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級雄性C57小鼠40只,4周齡,體質(zhì)量(20±2)g;本研究的動物實驗程序經(jīng)貴州醫(yī)科大學動物實驗倫理委員會批準(批準號2001161)。所有動物飼養(yǎng)在貴州醫(yī)科大學動物實驗中心恒溫22～24℃,相對濕度50%～60%,光照/黑暗周期12 h的特定無病原體條件下。

1.2主要藥物與試劑 四氯化碳(CCl4,規(guī)格:500 ml,批號:201986,徐州天鴻化工有限公司);抗Sox9(1:50 00,ab185966,Abcam,美國)。玉米油(規(guī)格:500 ml,批號:1020B053,北京索萊寶科技有限公司)。

1.3主要儀器 儀器SN267839連續(xù)波長酶標儀,美國BioTek公司產(chǎn)品;DYY-BC電泳儀、北京六一生物科技有限公司,CFX96熒光定量聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction,PCR)儀,美國伯樂公司產(chǎn)品,C600凝膠成像系統(tǒng),Azure公司。

1.4方法

1.4.1分組與造模 將40只4周齡C57小鼠適應性飼養(yǎng)7 d后,隨機分為空白組(10只)和模型組(30只)。造模方法參考文獻[9-10],模型組腹腔注射體積分數(shù)為10%的CCl4溶液(按照玉米油:CCl4=9∶1配制而成),每次注射劑量5ml/kg,3次/w,持續(xù)5 w,制造HF模型?？瞻捉M,經(jīng)腹腔注射等體積生理鹽水,3次/w,持續(xù)5 w。3～4w后,每組隨機抽取3只小鼠,對其進行肝組織染色檢驗,顯示建立CCl4誘導小鼠HF模型成功。

1.4.2動物一般狀態(tài) 實驗過程中每日觀察并記錄各組小鼠的精神、飲食、活動、體質(zhì)量、皮毛等情況。

1.4.3小鼠肝組織形態(tài)學變化 取出小鼠部分肝臟組織,以4%多聚甲醛固定24 h,流水沖洗數(shù)小時(3～8 h),濃度梯度酒精法進行脫反復脫水、二甲苯透明、浸蠟、組織包埋、組織切片、貼片、化蠟、封閉、孵育一抗、二抗等按標準流程進行。然后鏡下觀察,并染色觀察肝組織病理學變化。

1.4.4Western印跡檢測小鼠肝組織中Sox9蛋白表達量 用全蛋白提取試劑盒,提取C57小鼠肝組織蛋白,經(jīng)二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,BCA)蛋白含量檢測試劑盒,測定小鼠肝臟組織中蛋白濃度。每孔加18μg樣品,數(shù)小時后蛋白分離,取膠并切割膠塊,隨后將轉(zhuǎn)膜液潤濕的海綿、濾紙、膠、PVDF膜、濾紙、海綿的依次入在轉(zhuǎn)膜夾板中夾緊,放置于轉(zhuǎn)膜槽倒入轉(zhuǎn)膜液,將電泳槽整體泡在冰水混合物中,轉(zhuǎn)膜成功后,經(jīng)5%脫脂奶粉在常溫下進行封閉4 h,再進行洗膜3次后,5 min/次。后加入兔抗-Sox9(1∶1 000)、兔抗-GAPDH(1∶1 000),4℃過夜,次日收取一抗,后洗膜3次,5 min/次。加入山羊抗兔的二抗(1∶1 000),室溫孵育2 h,洗膜3次后,圖像采集,Image J軟件分別計算Sox9與GAPDH灰度值的比值。

1.4.5實時熒光定量PCR法檢測小鼠肝組織中Sox9的表達水平 取小鼠肝組織80～100 mg,加入TRIzol后,用剪刀剪碎,放在-80 ℃冰箱預冷并轉(zhuǎn)入研磨器中,加入氯仿,12 000 g的離心力離心,可見EP管中出現(xiàn)分層,上層為透亮色,下層為粉紅色,將上層吸取液體轉(zhuǎn)移至另一個EP管中,滴加氯仿,加入冰箱預冷的異丙醇,劇烈震蕩使其充分混勻,離心力離心10 min,加入70%乙醇震蕩,離心力離心棄上清液,加入DEPC水溶解RNA,1μl溶解的RNA,超微量紫外分光光度計上測量RNA的濃度和純度。嚴格按照試劑盒要求及說明書合成cDNA,設計引物,反應條件:預變性95℃ 30 s變性95℃ 10 s退火65 ℃ 10s延伸72 ℃ 30 s,其中變性95 ℃ 10 s退火65 ℃ 10 s延伸72 ℃ 30 s這個過程循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參進行PCR擴增。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 正常對照組小鼠生長狀態(tài)良好,毛色光亮,雙眼有神,反應敏銳,飲食正常,體質(zhì)量逐增,無死亡情況。而模型組小鼠,皮毛發(fā)黃且造模,2～3W后小鼠大部分出現(xiàn)炸毛現(xiàn)象,雙眼乏神,行動緩慢、反應遲鈍,食量減退,較同時期空白組小鼠體質(zhì)量減輕。

2.2Sox9在四氯化氮誘導的肝纖維化模型中表達升高 通過qRT-PCR的使用,檢測CCl4誘導的肝纖維化小鼠模型中Sox9的表達,結(jié)果表明CCl4誘導后肝組織中Sox9顯著增加,并在肝纖維化發(fā)展中保持高水平(圖1)。如圖所示:CCl4誘導后肝組織中Sox9的表達在1W、2W、3W后逐漸升高,而正常對照組變化不明顯。

圖1 Sox9在四氯化氮誘導的肝纖維化模型中表達升高

2.3Western印跡檢測小鼠肝組織中Sox9蛋白表達量升高 提取3W、4W的肝臟組織,經(jīng)Western 印跡檢測發(fā)現(xiàn),Sox9的蛋白表達量升高明顯,明顯高于正常對照組(圖2)?？梢娫诟卫w維化過程中,Sox9發(fā)揮重要作用。

圖2 Western印跡中,正常肝組織與CCl4誘導的纖維化肝臟中Sox9分子的表達

2.4經(jīng)免疫組化驗證四氯化氮誘導的肝纖維化模型中Sox9表達量升高。然后,我們用Sox9特異性抗體對纖維化肝臟進行染色,并證實了纖維化肝臟不同細胞成分中Sox9的增加(圖3)。

圖3 免疫組化中,對照組與四氯化氮誘導的肝組織中Sox9分子的表達

3 討 論

肝纖維化是以肝內(nèi)纖維組織過度沉積、降解減少為主要病理特征的疾病,這主要是因為肝臟受到慢性損傷時不能及時修復而引起的病理性修復。在肝纖維化形成的過程中,即有肝星狀細胞(Hepatic stellate cell,HSC)的活化,也有免疫細胞的募集和表型的改變,并伴隨著肝實質(zhì)細胞上皮向間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)變(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)。目前對肝纖維化的研究均集中在HSC的激活、肝內(nèi)免疫細胞的功能改變以及肝實質(zhì)細胞EMT的分子調(diào)控機制,并有可能通過干預這些過程達到逆轉(zhuǎn)和緩解肝纖維化進程的目的。作為肝臟結(jié)構(gòu)和功能的主要細胞,肝細胞在受到損傷后,一部分細胞會凋亡壞死,另外一部分會在損傷的肝臟微環(huán)境境中發(fā)生特異性的細胞表型轉(zhuǎn)變,即EMT的發(fā)生,而肝細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變會促進肝纖維化的形成,這個過程往往受多種促纖維化分子(比如:TGF-β)的調(diào)節(jié)[12]。Sox9是一種高度保守的轉(zhuǎn)錄因子,被認為與肝纖維化過程中細胞外基質(zhì)產(chǎn)生關(guān)系密切。正常肝內(nèi)膽管存在表達Sox9的肝祖細胞,通過細胞譜系示蹤顯示,在正常的肝臟中表達Sox9的肝祖細胞會逐漸分化成替代肝臟內(nèi)的成熟肝細胞,在CCl4和膽管結(jié)扎兩種損傷模型中,表達Sox9的肝祖細胞就會增殖分化為肝實質(zhì)細胞來修復損傷的肝臟[13]。Sox9除作為肝臟祖細胞的特征性分子之外,在多個器官的發(fā)育過程中起重要作用并調(diào)控多種生物學過程,比如在神經(jīng)嵴細胞的遷移過程中起到調(diào)節(jié)EMT24-26和促進細胞增殖和癌癥的發(fā)生等[14]。但在不同發(fā)育階段, Sox9的任何不正常的表達量或異位表達都可能導致疾病[15]。另外,在損傷的修復過程中需要干細胞的活化,Sox9可能通過影響干細胞的功能導致組織細胞的惡變,如Sox9在膀胱癌中的表達是明顯上調(diào)的,但在在膀胱損傷修復中是激活的[16]。沉默或降低細胞中Sox9的水平后,細胞分裂和細胞的增殖有關(guān)的磷酸化組蛋白3 表達量均明顯減少[17]。Sox9作為一種轉(zhuǎn)錄因子,在不同器官的纖維化發(fā)展過程中調(diào)節(jié)成纖維細胞中的骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)和膠原。最新報告顯示,通過對Sox9缺失的HSC的轉(zhuǎn)錄組學和實驗分析和功能分析,超過30%的Sox9調(diào)控的基因與ECM有關(guān)[18]。我們已證明,在CCl4誘導的肝纖維化模型中,Sox9的蛋白濃度會隨著纖維化的嚴重程度而改變。到目前為止,肝細胞Sox9在肝纖維化進展中的失調(diào)仍有許多待確定。在這里,我們從CCl4誘導的肝纖維化中分離出肝細胞,并檢測到肝細胞中的Sox9在肝臟纖維化過程中的增加。那么,Sox9在小鼠肝纖維化中的作用能否在人類身上表達一致:人類肝損傷后Sox9的檢測結(jié)果與在小鼠身上觀察到的結(jié)果是否相同;在我們的研究者中發(fā)現(xiàn),小鼠肝臟中Sox9表達的量與纖維化的嚴重程度密切相關(guān);那么,Sox9在疾病早期的表達量,是否與預測人類肝纖維化的進展程度有關(guān)。同時,Sox9表達量,與其他纖維化風險指標比較是否更有優(yōu)勢、表現(xiàn)更好,不得而知。并且可能有助于肝纖維化患者的分層,如肝纖維化、肝硬化風險評分,需要更多的研究及關(guān)注。