摘要：為探究發(fā)展荔枝葉作為青貯飼料的可行性，4種荔枝葉（‘晚埔’‘烏葉舅’‘桶仔’‘狀元紅’）分別用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，LP）處理并設對照組。青貯3，7，14，30天后分析其發(fā)酵品質(zhì)并測定30天后荔枝葉的干物質(zhì)消化率和累積產(chǎn)氣量。結(jié)果表明：添加LP降低了4種荔枝葉的pH值和大腸桿菌數(shù)量，同時減少了氨態(tài)氮產(chǎn)生（Plt;0.01）。此外LP處理的‘晚埔’和‘狀元紅’荔枝葉中酵母菌數(shù)量比對照低。青貯30天后，LP處理的‘桶仔’和‘狀元紅’荔枝葉中霉菌數(shù)量比對照組低，且低于檢測水平。添加LP增加了4種荔枝葉的體外干物質(zhì)消化率；降低（Plt;0.01）了產(chǎn)氣量。本研究表明，LP添加有助于改善4荔枝葉的發(fā)酵質(zhì)量以及體外發(fā)酵特性，發(fā)展荔枝葉作為青貯原料可能是回收荔枝葉的一種可行方式。

關鍵詞：荔枝葉；植物乳桿菌；發(fā)酵；消化率；產(chǎn)氣量

中圖分類號：S816.5+3 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2023）07-2232-09

The Effects of Lactobacillus Plantarum on Fermentation Quality and In Vitro Digestion Characteristics of Litchi Leaves Silage

CHEN Dan-dan1， HUANG Pei-shan1， ZHANG Chao1， CHEN Xiao-yang1， ZHOU Wei1， ZHANG Qing^1，2*

（1. South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong Province 510642， China; 2. Maoming Branch， Guangdong Laboratory for Lingnan Modern Agriculture， Maoming， Guangdong Province 525000， China）

Abstract：Due to the restricting factor of feed shortage，making full use of natural woody plant resources as animal feed is becoming an extremely important strategy in the tropic. Using litchi leaves as an unconventional feed might meet the requirement of sustainable and intensive livestock production to reduce feed costs，avoid food competition between humans and animals，and promote feed supplies. Therefore，to investigate the feasibility of developing litchi leaves as silage，we investigated the fermentation quality of four varieties of litchi leaves （‘Wanpu’‘Wuyejiu’‘Tongzai’ and ‘Zhuangyuanhong’） ensiled with or without Lactobacillus plantarum （LP） on day 3，7，14 and 30. The in vitro dry matter digestibility （IVDMD） and accumulated gas production of litchi leaves silages were also investigated after 30 days of ensiling. The results showed that LP inclusive into the ensilage significantly reduced pH value，inhibited the coliform bacteria，and reduced the production of ammonia nitrogen of litchi leaves silage of the four varieties （Plt;0.01）. Moreover，LP treated litchi leaves （‘Wanpu’ and ‘Zhuangyuanhong’） had lower yeasts than the untreated litchi leaves during ensiling. The number of molds in LP treated groups （‘Tongzai’ and ‘Zhuangyuanhong’） was below the detected level after 30 days ensiling，which was lower than that of the untreated groups. The addition of LP also contributed to the IVDMD improving and markedly reduction （Plt;0.01） of gas production of all litchi leaves silages. It was concluded in this study that LP can improve the fermentation quality and in vitro digestion characteristics of litchi leaves silage;developing litchi leaves as silage material is a feasible way to recycle litchi leaves.

Key words：Litchi leaves;Lactobacillus plantarum;Fermentation;Digestibility;Gas production

本地飼草資源缺乏是限制熱帶畜牧業(yè)發(fā)展的主要因素。尋找新的當?shù)乜衫觅Y源，可能是應對飼料短缺的有效解決方案之一^[1]。為此，人們對當?shù)鼐G色生物的飼用價值進行了廣泛的研究，并逐漸將注意力轉(zhuǎn)移到木本植物飼料的加工上^[2]。荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是一種營養(yǎng)豐富的水果，具有很高的商業(yè)價值^[3]，主要種植于中國、泰國、越南、印度等國家，總種植面積約80萬hm^2[4]。荔枝葉是荔枝生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物，每年修剪果樹時都會大量產(chǎn)生。這些廢棄的荔枝葉不僅會影響果園的管理，還會滋生病蟲害^[5]。一些研究表明，荔枝葉常用于傳統(tǒng)醫(yī)藥和泡茶^[6]。但在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中荔枝葉的利用率并不高。在此情況下，荔枝葉的合理利用對于廢棄物實現(xiàn)資源回收和經(jīng)濟效益最大化尤為重要，且勢在必行^[6]。而為應對畜牧業(yè)當前的發(fā)展狀況，荔枝葉作為非常規(guī)飼料應用可以滿足可持續(xù)集約化畜牧生產(chǎn)的要求。主要是因為其供應可以降低飼料生產(chǎn)成本，避免人畜之間的食物競爭，促進飼料供應。相關的研究已經(jīng)表明：荔枝葉中包含了多種活性成分（包括類黃酮、多糖、酚類化合物等）^[7-9]。由于這些活性成分的存在，荔枝葉提取物具有很強的抗炎、殺菌和抗氧化作用^[8]。其中，從荔枝葉中分離出的黃酮類化合物具有較高的抗氧化活性，可以有效抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、酵母菌、黑曲霉等微生物的生長^[9]。此外，Wen等人發(fā)現(xiàn)，從荔枝葉中用乙酸乙酯提取分離出來的的黃酮類化合物和倍半萜類化合物分別具有抗菌活性和較好的抗氧化活性^[10-11]。Castellain等人還發(fā)現(xiàn)，荔枝葉提取物可以緩解小鼠的疼痛。總之，荔枝葉是一種很好的天然活性物質(zhì)資源，具有很好的藥理功效和抑菌作用^[12]。它的提取物也是飼料中常用的飼料添加劑，但是目前幾乎沒有直接使用荔枝葉作為飼料的研究^[7]。

近年來，荔枝葉中的營養(yǎng)成分也已被證實有利于農(nóng)業(yè)應用和生產(chǎn)，但作為原料的荔枝葉并未大面積的實現(xiàn)資源再生^[13]。開發(fā)荔枝葉作為木本飼料，可能是改善動物健康、提高飼料資源可持續(xù)性、緩解生產(chǎn)中粗飼料資源短缺的有效方法之一^[14]。青貯是一個復雜的過程，涉及新鮮飼料中大量附生微生物（主要是乳酸菌）的發(fā)酵，廣泛用于飼料的營養(yǎng)保存^[15]。然而，微生物發(fā)酵通常不穩(wěn)定。它可能會改變飼料的營養(yǎng)成分，導致發(fā)酵質(zhì)量下降。接種乳酸菌有利于有機酸（主要是乳酸和乙酸）的快速產(chǎn)生，降低的pH值可以抑制微生物的活性，從而實現(xiàn)新鮮飼料的營養(yǎng)保存^[16]。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，LP）作為主要產(chǎn)乳酸的一種乳酸菌，常被用作青貯飼料添加劑。因此，我們將植物乳桿菌添加到不同品種的荔枝葉中，調(diào)制成荔枝葉青貯飼料，然后測定其發(fā)酵質(zhì)量，通過模擬瘤胃消化環(huán)境，測定荔枝葉青貯的體外消化率和產(chǎn)氣量，評價荔枝葉作為反芻動物飼料的營養(yǎng)價值和應用價值，為荔枝葉開發(fā)作為非常規(guī)飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

試驗所用的4種荔枝葉（包括‘晚埔’‘烏葉舅’‘桶仔’‘狀元紅’）種植于華南農(nóng)業(yè)大學荔枝園，并于2021年9月人工采集所得，品種選取依據(jù)市場上常見的荔枝品種（‘狀元紅’‘烏葉舅’）與新興培育品種（‘晚埔’‘桶仔’）的枝葉來展開試驗。添加的乳酸菌則是從發(fā)酵29天的黃梁木葉青貯飼料中挑選的產(chǎn)酸能力較強的菌株（pH=3.37），16S rDNA測序分析后再經(jīng)過NCBI的blast程序進行同源比對，確定菌株為植物乳桿菌。將不同品種荔枝葉用粉碎機切至2～3 cm的小段混勻備用，試驗采用完全隨機區(qū)組設計：添加（1 × 106 cfu·g^-1 FM）LP到不同的荔枝葉新鮮原料中，以不添加處理分別作為對照?；旌暇鶆蚝笱b到聚乙烯塑料袋（20 cm × 30 cm）中，每袋180 g左右，真空封口機除去空氣并室溫密封保存。分別在青貯3，7，14，30天后隨機選取3個重復測定其發(fā)酵品質(zhì)，共制作96個青貯包（4個品種×2個處理×4個青貯天數(shù)×3個重復）。

1.2 微生物數(shù)量、有機酸及化學組分分析

試驗依據(jù)Wang等人所用的測定方法^[17]。在青貯3，7，14，30天開袋，混合均勻樣品并使用5點取樣法進行取樣。其中稱取荔枝葉青貯樣品20 g，并注入180 mL無菌生理鹽水充分振蕩，然后逐級稀釋^[18]。37℃條件下用MRS瓊脂培養(yǎng)基和結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基分別培養(yǎng)乳酸菌和大腸桿菌48 h；28℃條件下MRS瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母菌和霉菌48 h，后采用平板計數(shù)法測定微生物數(shù)^[19]。試驗中所用培養(yǎng)基均購自廣州鼎國生物技術有限公司。

為測定荔枝葉的發(fā)酵參數(shù)，分別將樣品（20 g）與180 mL無菌水混合，并在4℃下過夜保存，然后用濾紙過濾。所得濾液用于測定pH值（pH計測定）、氨態(tài)氮（苯酚-次氯酸鹽比色法）和有機酸含量（島津GC-14型高效液相色譜儀）^[20]。剩余的青貯樣品放置于信封袋中，65℃條件下烘2天至恒重后，根據(jù)記錄的烘前烘后的樣本重量計算干物質(zhì)含量^[21]。蛋白組分（粗蛋白、真蛋白、非蛋白氮）、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、可溶性糖含量分別依據(jù)Wang等人的方法測定^[22]。

1.3 72小時累積產(chǎn)氣量與48小時體外干物質(zhì)消化率分析

試驗選用3頭體重600 kg、裝有永久性瘤胃瘺管的黑安格斯閹牛作為瘤胃液供體動物。按照飼料精料比5∶5每天飼喂給供體動物干物質(zhì)8 kg（青貯飼料2.2 kg；麥秸1 kg；豆腐渣0.8 kg；混合精料4 kg）作為干物質(zhì)基礎，自由喂水。根據(jù)Zhou等人的實驗方法，以不添加發(fā)酵底物的玻璃瓶作為空白對照。將39℃提前預熱的每個干燥樣品0.5 g與保存于39℃水浴中的75 mL培養(yǎng)液（從3頭瘤胃喂養(yǎng)的供體動物中提取25 mL瘤胃液+50 mL緩沖液）混合在玻璃瓶中^[23]。用N₂吹掃5 s后，使N₂充分飽和培養(yǎng)液的同時排除培養(yǎng)液中的氣泡。記錄初始培養(yǎng)管的刻度值后密封條件下將所有瓶子放置在39℃的恒溫水浴培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)72小時，并使用自動化系統(tǒng)不斷檢測整個發(fā)酵過程中的氣體排放。

上述每個瓶子中的漿液通過一個42 μm孔徑的尼龍袋過濾。發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵培養(yǎng)管放入冰水中終止發(fā)酵，然后將尼龍小袋取出，自來水沖凈，再用蒸餾水沖洗干凈，置于2層潔凈的衛(wèi)生紙中間擠干多余的水分，在65℃烘箱中烘干至恒重，隨后對48小時體外干物質(zhì)消化率（In vitro dry matter digestibility，IVDMD）進行分析。干物質(zhì)消化率（Dry matter digestibility）%=（消化前樣本DM重-消化后樣本DM重）/樣本DM重×100。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 23.0軟件完成。采用雙因素的方差分析以及Duncans（鄧肯氏）新復極差法對處理和青貯天數(shù)之間的平均值差異進行多重比較（顯著水平低于5%和1%）。所有的圖均使用Graphpad prism 8軟件制作，并用AI軟件處理后導出。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯前4種荔枝葉的化學成分及微生物數(shù)量

由表1可知，‘晚埔’‘烏葉舅’‘桶仔’荔枝葉的干物質(zhì)含量均接近50.00%，4種荔枝葉中，狀元紅荔枝葉的干物質(zhì)含量最低。‘晚埔’‘烏葉舅’‘桶仔’‘狀元紅’的粗蛋白含量在8.79%～9.92%之間。而荔枝葉的可溶性糖含量均較低，含量范圍在1.62%～1.86%之間。觀察荔枝葉表面的微生物數(shù)量發(fā)現(xiàn)，乳酸菌和大腸桿菌的數(shù)量相當，超過了4.00 lg cfu·g^-1 FM，酵母和霉菌的數(shù)量則是在2.00～3.00 lg cfu·g^-1 FM之間。

2.2 青貯后荔枝葉的發(fā)酵品質(zhì)

表2～5列出了4種荔枝葉青貯后的發(fā)酵特性。與對照相比，添加LP都顯著降低了荔枝葉青貯飼料的pH值。4種荔枝的干物質(zhì)含量較穩(wěn)定，在整個青貯期間所有的處理的干物質(zhì)含量沒有明顯變化。相較于對照組，乳酸菌數(shù)量在LP處理的不同荔枝葉中都顯著增加（Plt;0.01），而大腸桿菌的的數(shù)量則顯著減少（Plt;0.01）。LP處理的‘晚埔’和‘狀元紅’荔枝葉中酵母菌的數(shù)量低于對照組。而整個厭氧發(fā)酵期間，‘烏葉舅’和‘桶仔’荔枝葉青貯飼料中幾乎未檢測到酵母菌。發(fā)酵30天以后，LP處理的‘桶仔’和‘狀元紅’荔枝葉中霉菌的數(shù)量也低于對照組，且低于可檢測水平。隨著發(fā)酵時間的延長，‘晚埔’荔枝葉中霉菌數(shù)量呈現(xiàn)下降的趨勢，發(fā)酵14天以后，未檢測到霉菌的存在。而整個青貯期間，‘烏葉舅’荔枝葉青貯飼料中霉菌的數(shù)量均低于可檢測水平。相較于對照組，隨著發(fā)酵時間的延長，LP的添加增加了乳酸和乙酸的含量。雖然在4種荔枝葉中，對照組與LP處理組之間粗蛋白含量沒有明顯差異。但是，LP的添加顯著減少（Plt;0.01）了4種荔枝葉中氨態(tài)氮的含量。

2.3 青貯后荔枝葉累積產(chǎn)氣量和干物質(zhì)消化率

如圖1所示，不同品種的荔枝葉的72小時累積產(chǎn)氣量（GP72）有一定的差異。72小時以后對照組中‘晚埔’荔枝葉的累積產(chǎn)氣量最高，其含量約為11.33 mL。而‘狀元紅’荔枝葉中的累積產(chǎn)氣量最低，在8.68 mL左右。所有荔枝葉的產(chǎn)氣量隨著時間的延長逐漸趨于平穩(wěn)，添加LP以后，所有荔枝葉的累積產(chǎn)氣量都低于對照組。

圖2中顯示了不同處理的荔枝葉青貯30天后的干物質(zhì)消化率（48 h），其范圍在11.14%～13.17%之間。所有的處理中，添加LP處理后的‘晚埔’荔枝葉有最高的干物質(zhì)消化率（13.17%）。與對照相比，LP處理都顯著增加了4種荔枝葉中的體外消化率（Plt;0.01）。

3 討論

新鮮原料中的干物質(zhì)含量對于青貯飼料的發(fā)酵而言是重要的評估指標，它對發(fā)酵特性、pH值、微生物群落結(jié)構都有影響^[24]。通常，理想的干物質(zhì)含量范圍是30%～40% FM，這既可以保持LAB旺盛生長，也可以防止不良微生物（梭狀芽孢桿菌或酵母）發(fā)酵^[25]。荔枝葉的干物質(zhì)含量相對高于理想范圍值，這可能難以避免在發(fā)酵的初始階段由酵母代謝引起的營養(yǎng)損失。然而，據(jù)相關報導，高DM含量有助于飼料發(fā)酵過程中的氮轉(zhuǎn)化^[26]。Muck等人探究了苜蓿青貯飼料中干物質(zhì)含量和蛋白分配之間的關系發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的水解速率隨著DM含量的增加而線性下降^[26]。這一結(jié)果指明了荔枝葉中蛋白質(zhì)的有效保存可能與其DM含量有關。玉米作為世界上種植最廣泛的青貯飼料材料，其蛋白質(zhì)含量通常低于9% DM^[27-28]。荔枝葉的蛋白質(zhì)含量比玉米高，這表明荔枝葉可能適合作為非常規(guī)飼料，提供給反芻動物所需的蛋白營養(yǎng)。青貯飼料是微生物發(fā)酵后的產(chǎn)物。植物表面附著的乳酸菌數(shù)量對于青貯的起始發(fā)酵至關重要^[29]。它通過轉(zhuǎn)化水溶性碳水化合物（WSC）產(chǎn)生大量有機酸（主要是乳酸），然后加速酸化以抑制微生物活動^[30]。然而，未經(jīng)處理的荔枝葉可能很難獲得良好的發(fā)酵質(zhì)量。一方面，除‘桶仔’以外，荔枝葉中的LAB均低于5 lg cfu·g^-1 FM，大腸桿菌數(shù)量也相對較高（gt;4.26 lg cfu·g^-1 FM）。另一方面，荔枝葉中WSC含量均不能滿足良好發(fā)酵的基本要求（gt;38 g·kg^-1）^[30]。因此，需要有效的添加劑來促進荔枝葉青貯飼料中乳酸菌的發(fā)酵并減少營養(yǎng)損失。

pH值是評估青貯飼料發(fā)酵質(zhì)量的基本指標。LP的添加顯著降低了荔枝葉青貯飼料的pH值。雖然在LP處理的荔枝葉青貯飼料中乳酸和乙酸并沒有顯著增加，但是兩者間累積的酸濃度可能解釋了這一現(xiàn)象^[30]。乳酸和乙酸作為乳酸菌的關鍵代謝產(chǎn)物，可以迅速酸化環(huán)境，抑制微生物的活性^[31]。LP的添加有利于乳酸菌在發(fā)酵早期與不良微生物的競爭中迅速占據(jù)主導地位，加速了厭氧發(fā)酵進程，有機酸得以快速生成，從而達到良好的抑菌效果^[19，32]。與之相一致地，相較于對照組，乳酸菌在LP處理的荔枝葉青貯飼料中成為了優(yōu)勢菌種，大腸桿菌的生長活性明顯地受到抑制。同時還抑制了青貯期間荔枝葉（‘晚埔’‘烏葉舅’‘狀元紅’）中酵母菌的數(shù)量增加。而在整個發(fā)酵期間，無論是否添加LP，在‘桶仔’青貯飼料中均未檢測到酵母菌，這可能是因為‘桶仔’荔枝葉中含有的活性物質(zhì)，顯示出了良好的抑制酵母菌生長的作用。此外酵母菌的生長與青貯飼料中的可溶性糖含量密切相關?！白小笾θ~較低的可溶性糖含量可能是導致青貯飼料中酵母菌數(shù)量低于檢測水平的最主要的原因之一。隨著發(fā)酵時間的延長，霉菌的數(shù)量在所有的處理中數(shù)量較少，小于3 lg cfu·g^-1 FM。并且添加LP后，荔枝葉（‘晚埔’‘桶仔’和‘狀元紅’）中霉菌數(shù)量趨向于減少，尤其是青貯30天后，其抑菌效果明顯。上述微生物的變化可能合理地解釋了所有LP處理的荔枝葉中蛋白營養(yǎng)的保存效果比對照組好。眾所周知，青貯飼料中的氨態(tài)氮含量的增加會對家畜的生長產(chǎn)生不良影響，且不能被動物代謝利用的氨態(tài)氮排泄到環(huán)境中還會增加環(huán)境壓力^[33]。而它的產(chǎn)生主要是由于植物蛋白酶的水解和不良微生物代謝所引起的^[34]。接種LP可以降低所有荔枝葉青貯飼料中的氨態(tài)氮含量，這可能與大腸桿菌數(shù)量的減少有關^[35]。

產(chǎn)氣量和體外干物質(zhì)消化率可以有效模擬飼料在瘤胃中的動態(tài)發(fā)酵過程，由于其方便性和代表性，被廣泛用于評估青貯飼料的營養(yǎng)價值^[36-37]。發(fā)酵產(chǎn)氣主要是瘤胃微生物在利用各種營養(yǎng)物質(zhì)的過程中產(chǎn)生的。它通常與瘤胃中的營養(yǎng)水平和日糧組成有關^[38]。在本研究中，不同品種的荔枝葉青貯飼料的GP72存在差異，這可能與荔枝葉中化學成分及比例不同有關。為了提高青貯飼料的發(fā)酵質(zhì)量，添加劑通常需要減少瘤胃發(fā)酵過程中的體外產(chǎn)氣量^[16]。一方面，產(chǎn)氣意味著反芻動物不能很好地吸收青貯飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)；另一方面，所產(chǎn)生的氣體主要是氫氣、二氧化碳、甲烷，排放到空氣中可能會加劇溫室效應，不利于生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展^{[21，39]}。LP的添加可以有效的減少體外產(chǎn)氣量以及改善荔枝葉的發(fā)酵品質(zhì)。

體外干物質(zhì)消化率通常用于評估飼料的能量分配潛力，其差異是由于不同牧草的碳水化合物類型不同造成的^[40]。由于發(fā)酵底物類型限制了還原性糖的可及性，纖維素酶（將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖）的功能也受到限制^[41]。而這種差異并沒有體現(xiàn)到四種不同的荔枝葉青貯飼料中，這可能是因為不同品種荔枝葉所包含的發(fā)酵底物類型和含量沒有較大的差別。LP的添加對于改善荔枝葉的體外干物質(zhì)消化率至關重要，它提高了所有荔枝葉中的體外干物質(zhì)消化率，這可能是由于LP的應用促進了酶促糖化反應，其中糖和蛋白質(zhì)被酶促生成糖蛋白，增加了青貯飼料的瘤胃可發(fā)酵底物。Yi等人的研究結(jié)果也支持這一種說法^[42]。

4 結(jié)論

綜上所述，添加植物乳桿菌可以增加荔枝葉青貯飼料青貯發(fā)酵質(zhì)量和體外干物質(zhì)消化率，同時還可以減少四種荔枝葉青貯飼料的體外產(chǎn)氣量。無論添加或不添加植物乳桿菌處理，4種荔枝葉青貯飼料中霉菌和酵母菌在發(fā)酵期間均生長較緩慢。荔枝葉作為飼料具有良好的發(fā)酵品質(zhì)，植物乳桿菌處理的荔枝葉青貯發(fā)酵效果更好。

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（責任編輯 閔芝智）