摘要：葦狀羊茅（Festuca arundinacea Schred）是多年生冷季型禾草，作為草坪草、牧草、生態(tài)修復草種在溫帶有著廣泛的應用。本研究以60份不同來源的葦狀羊茅種質為材料，利用表達序列標簽-簡單序列重復（EST-SSR）引物對其進行遺傳多樣性分析，對其構建指紋圖譜，對種質資源進行鑒定與評價。結果表明：20對EST-SSR引物共擴增出173條帶，多態(tài)性條帶163條，多態(tài)性位點百分率94.220%；所有引物均可識別種質，不同的引物組合可以區(qū)分60份種質；聚類結果與地理區(qū)劃有一定的關聯(lián)，但不明顯；60份參試材料最佳亞群數(shù)為3。研究結果表明：60份種質的遺傳多樣性處于中等水平；SSR標記可以有效地鑒定葦狀羊茅種質并評價其遺傳差異，為葦狀羊茅核心種質的構建、新品種的選育奠定基礎。

關鍵詞：葦狀羊茅；EST-SSR；遺傳多樣性；聚類分析

中圖分類號：Q311 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2023）07-2041-08

Genetic Diversity Analysis of 60 Tall Fescue Varieties Based on EST-SSR Markers

YI Ran， WANG Zi-yue， LIU Ling-yun， CHANG Zhi-hui*

（College of grassland science， Beijing Forestry University， Beijing 10083， China）

Abstract：Tall fescue （Festuca arundinacea Schred） is a perennial cool-season grass with a wide range of applications in temperate zones as a turfgrass，forage grass，and ecological restoration grass. In this study，60 tall fescue varieties from different sources were analyzed for genetic diversity using expressed sequence tag-simple sequence repeat （EST-SSR） primers，and fingerprint profiles were constructed to identify and evaluate the germplasm resources. The results showed that a total of 173 bands were amplified by 20 EST-SSR primers，163 of which were polymorphic bands，with a percentage of 94.220%;all primers identified varieties and different primer combinations can identify 60 varieties;the clustering results were correlated with geographic regions，but was not obvious;and three subgroups were determined to be the optimal number for the 60 participating materials. The results indicated that the genetic diversity of the 60 varieties was at a medium level，and the SSR markers can effectively identify tall fescue varieties and evaluate its genetic differences，laying the foundation for the construction of core tall fescue varieties and the selection and breeding of new varieties of tall fescue.

Key words：Festuca arundinacea;EST-SSR;Genetic diversity;Cluster analysis

葦狀羊茅（Festuca arundinacea Schred）是禾本科（Gramineae）羊茅屬（Festuca）的多年生冷季型草本植物，廣泛種植于溫帶地區(qū)^[1]。葦狀羊茅具有發(fā)達的根系，成坪快，抗逆性強，且對重金屬有一定的吸收耐受能力，在牧草生產、草坪綠化、生態(tài)修復等多方面應用^[2-4]。

種質資源是生物品種改良工作的基礎，種質資源數(shù)量及質量是實現(xiàn)育種目標的關鍵，因此對優(yōu)良種質的廣泛搜集、鑒定評價工作尤為重要^[5]。葦狀羊茅的種質資源豐富^[6]，但由于其為異源六倍體（2n=6x=42），且具有異花授粉、高度自交不親和的特性^[7]，形態(tài)標記等傳統(tǒng)的評價方法很難對其進行差異比較，評估其種質特性^[8]。因此，不受環(huán)境影響的DNA分子標記可以為葦狀羊茅的遺傳育種研究提供了一種準確、有效的方法^[9]。簡單重復序列（Simple sequence repeat，SSR）分子標記，具有共顯性遺傳、多態(tài)性高、易檢測、特異性好、通用性高及重復性好等優(yōu)點，已被廣泛應用于植物遺傳育種中^[10]。SSR可根據(jù)其來源，分為基因組SSR和表達序列標簽SSR（EST-SSR）。相比于基因組SSR，來源于編碼區(qū)的EST-SSR可以從根本上表現(xiàn)出植物基因組功能的信息。春蘭（Cymbidium goeringii）^[11]、苔草屬（Carex L.）^[12]等多種植物的遺傳多樣性分析中得到了廣泛的應用。

目前，葦狀羊茅EST-SSR標記已被開發(fā)并應用于遺傳多樣性分析。Cuyue等^[13]利用15個EST-SSR引物和毛細管電泳對161份羊茅屬植物的遺傳多樣性進行分析，數(shù)據(jù)顯示葦狀羊茅具有豐富的遺傳多樣性。Fu等^[9]對19份牧草型和2份草坪型葦狀羊茅進行了EST-SSR標記，將21份葦狀羊茅分為6個主要類群，并通過結構分析將21份葦狀羊茅分為3個亞枝。王子玥等^[14]將EST-SSR標記與種子表型特征相結合，研究36份葦狀羊茅種質的遺傳多樣性，結果表明36份材料的異質性高，可被分為3類及1個混合群體。盡管已有相關研究，但大部分研究涉及的葦狀羊茅種質數(shù)量較少，多為20～30種。不僅如此，國內的相關研究還多以商業(yè)品種為材料，對于不同地理來源種質遺傳多樣性的研究鮮有報道。

相較于國外，我國草育種工作開展較晚。1998—2019年我國審定的葦狀羊茅品種有16，其中自育品種僅有5個，且均通過常規(guī)育種技術進行培育^[1]。常規(guī)育種技術育種程序慢，周期長，且性狀遺傳穩(wěn)定性差^[15]。因此，需要利用更為快速、便捷且準確性高的技術手段對葦狀羊茅遺傳多樣性進行研究，對其進行鑒定評價，有針對性地進行育種工作，以滿足當前對葦狀羊茅的利用需求。為了解不同地理來源的葦狀羊茅的遺傳多樣性及種質間的親緣關系，本研究利用EST-SSR標記對60份葦狀羊茅種質進行遺傳多樣性分析，通過遺傳相似系數(shù)進行聚類分析，以期對60份材料的遺傳差異進行研究，為葦狀羊茅種質評價及新品種選育工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 種質資源的收集

試驗主要以全國畜牧總站提供的52份葦狀羊茅種質為材料，分別來自于3大洲9個國家：北美洲[加拿大（3）、美國（4）]、歐洲[丹麥（2）、俄羅斯（1）、捷克（1）、葡萄牙（1）、匈牙利（1）]、亞洲[中國（36）、日本（3）]。其中中國的36份材料分別來自北京、甘肅、貴州、江蘇、寧夏、山西、陜西、四川、新疆、云南和重慶。同時，為探究以上52份種質潛在的優(yōu)良特性，試驗以8份商業(yè)品種（表1）為參考，對兩者進行聚類分析。8份商業(yè)品種均來自美國，由百綠國際草業(yè)有限公司、北京正道種業(yè)提供。為方便后續(xù)試驗，對60份材料進行重新編號（表2）。

1.2 基因組DNA提取和EST-SSR標記

每份供試材料選取15顆種子，在2021年8月12日放置在培養(yǎng)箱中進行萌發(fā)與預培養(yǎng)[25℃/20℃，16 h/8 h（光照/黑暗），光強24 000 lx，濕度65%]。一周后，將發(fā)芽盒中的植株移栽至花盆中，花盆放置在三頃園苗圃（40°00′24″ N，116°19′60″ E）。生長45天后進行取樣，每份種質隨機選擇5顆單株，選取長勢良好的嫩葉混合，液氮充分研磨。利用Omega試劑盒提取DNA，使用Nanodrop 2000檢測所提DNA濃度，60份材料的OD₂₆₀/OD₂₈₀均在1.7～2.0之間。使用2%瓊脂糖電泳凝膠檢測濃度后，將試樣濃度稀釋至30 ng·μL^-1，-20℃保存，用于后續(xù)的PCR反應。

試驗所利用的引物是從Saha等^[16]設計的157對引物中隨機挑選的27對（由北京睿博興科生物技術有限公司合成），選擇其中擴增效果良好的20對引物（表3）。10 μL PCR反應體系為5 μL 2×Taq Master Mix（北京睿博興科生物技術有限公司），0.2 μmol·L^-1正、反向引物，2 μL樣品DNA和2.6 μL無菌水。利用Bio-Rad T100 PCR儀進行PCR擴增反應，反應程序為94℃初變性3 min，94℃變性30 s，60℃～64℃特定退火溫度30 s和72℃延伸60 s，進行34個循環(huán)，之后72℃延伸10 min。對PCR產物進行8%聚丙烯酰胺非變性凝膠電泳，通過銀染法顯現(xiàn)，照燈拍照保存，用于后續(xù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

由于葦狀羊茅多為六倍體且取樣為多單株混合取樣，標記的一個位點可能在3個亞基因組中出現(xiàn)多條條帶，無法按照二倍體共顯性標記，對基因型進行記錄。因此，在某一位點上的PCR擴增產物按“有”“無”進行統(tǒng)計，有條帶的記為“1”，反之記為“0”。遺傳距離、聚類分析及其結果的相關性檢驗利用NTSYS軟件分析。觀測等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、基因多樣性指數(shù)（H）、Shannon信息指數(shù)（I）等遺傳信息利用POPGEN 32計算。引物的多態(tài)性信息指數(shù)（PIC）計算公式為：PICi=1-∑ⁱ_jP²_ij^[12]（其中P_i，P_j分別為群體中第i，j個等位基因頻率）。種群結構利用STRUCTURE 2.3.4軟件分析，設置K值從1～10，每個K值進行5次獨立運算，burn-in設置為100 000次，MCMC（馬爾科夫鏈蒙特卡羅）迭代設置為1 000 000次。

2 結果與分析

2.1 擴增所得條帶

利用表3中的20對引物對60份葦狀羊茅種質進行EST-SSR擴增，每對引物均可擴增出清晰且多態(tài)性高的條帶，共擴增出173條帶，不同引物擴增出的條帶在4（NFA088）～14（NFA001）之間；其中多態(tài)性條帶163條，平均每對引物擴增8.15多態(tài)性條帶，多態(tài)性位點百分率94.220%。

2.2 指紋圖譜

對所擴增條帶進行“0”“1”規(guī)則讀數(shù)，對比讀數(shù)結果后發(fā)現(xiàn)，所有引物均可鑒別種質；NFA001，NFA006，NFA012，NFA029可鑒別超過20份種質，其中NFA012所鑒別種質最多，可達36份。對引物的鑒別結果進行分析，不同的引物組合可以區(qū)分60份種質，例如NFA001和NFA029引物組合。

2.3 遺傳多樣性分析

對60份葦狀羊茅種質進行遺傳多樣性分析。60份種質多態(tài)性信息Na，Ne，H，I的平均值分別為1.932，1.424，0.259，0.401（表4）。Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)是反映作物種質資源間多樣性的的主要指標，其數(shù)值越大，說明種質資源遺傳多樣性越豐富。結果表明，參試的60份葦狀羊茅種質之間的遺傳多樣性水平高。60份種質的平均遺傳距離為0.258。不同引物的PIC值在0.111（NFA088）～0.417（NFA073）之間，平均值為0.259，這表明所用引物有較高的多態(tài)性。

2.4 UPGMA聚類分析

對60份葦狀羊茅種質EST-SSR分子標記結果進行UPGMA聚類分析（圖2）。對聚類結果進行相關性檢驗，其相關性系數(shù)為r=0.813，說明聚類結果可靠。進一步分析發(fā)現(xiàn)，60份種質在遺傳相似系數(shù)在0.71處可分為4類和1個混合群體；當遺傳相似系數(shù)在0.75處，可進一步將第Ⅰ類分為4亞類。T2和T42遺傳相似系數(shù)最高，為0.89。

2.5 主成分分析

對60份種質按其地理來源分類，其中Pop1為北美洲種質，Pop2為歐洲種質，Pop3為亞洲種質；之后對其進行主成分分析，結果發(fā)現(xiàn)前三個主成分貢獻率依次為12.14%，9.58%，8.64%，占總遺傳變異的30.35%。60份不同來源的種質混合在一起，并未有明顯的分類，說明參試種質之間存在基因交流。

2.6 種群結構分析

利用STRUCTURE結構軟件進一步分析60份材料的結構，確定其最佳亞群數(shù)。結果發(fā)現(xiàn)，當K=3時，ΔK出現(xiàn)最大峰值（圖4），因此確定60份材料的最佳亞群數(shù)為3（圖5）。

3 討論

經過近十年的發(fā)展，我國已初步建立了完整的草種業(yè)體系，但仍存在已育成草類植物的新品種少，難以滿足我國對草種多功能、多區(qū)域的需求的難題^[17]。我國草類植物種質資源豐富，對其遺傳背景進行多角度的分析評價，挖掘其中的優(yōu)異基因，可幫助我們培育更適合我國需求的新品種。目前我國對葦狀羊茅遺傳多樣性的分析仍不足，且多利用商業(yè)品種進行研究。因此，急需針對我國葦狀羊茅種質遺傳背景的相關研究。本研究以60份來自9個國家的種質為材料，其中36份為我國葦狀羊茅種質，從地理區(qū)劃、EST-SSR標記兩方面來探究種質資源間的差異。

本研究中，Shannon信息指數(shù)平均值為0.401，低于王子玥等^[14]的0.420。出現(xiàn)以上結果可能是由于王子玥等的研究所使用的種質以野生種居多，而本研究中的種質多為引進種；相較于野生種，引進種可能由于來源相同或相近，種內基因交流較種間交流多，導致其遺傳多樣性水平較該研究低。60份參試材料的遺傳相似系數(shù)為0.524～0.880，說明參試種質的遺傳多樣性處于中等水平。60份種質之間相似系數(shù)變化低于王子玥等^[14]的研究結果，但高于Fu等^[9]的研究結果。Fu等所使用材料為商業(yè)品種，21份材料的育種起源相近，故而其相似系數(shù)變化較小；但王子玥等所使用的材料來自于17個國家，其遺傳背景可能因此更為豐富。

除此之外，在本研究中，PIC最高的引物是NFA073，這與王子玥等^[14]的結果也有不同。在該研究中，PIC值最高的是NFA021；該引物在本研究中的PIC值處于中等水平，這可能是種質來源不同導致的。鄧紹勇等^[18]利用EST-SSR標記對10個梔子（Gardenia jasminoides）品種構建指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)不同引物組合可以完成梔子所有品種的區(qū)分；張俊超等^[19]也利用不同EST-SSR引物組合對52份老芒麥（Elymus sibiricus）材料進行區(qū)分。本研究對60份種質構建指紋圖譜，結果發(fā)現(xiàn)不同引物組合可以對種質進行區(qū)分，說明EST-SSR分子標記可以有效、便捷地對葦狀羊茅進行區(qū)分，為其識別工作提供幫助。

了解物種間的親緣關系是種質創(chuàng)新的基礎^[20]。親本的親緣關系越遠則有更大可能獲得雜種優(yōu)勢，但雜交成功率也會隨之減低^[21]。經聚類分析，60份種質可被分為4類和1個混合群體。將聚類結果與地理區(qū)劃相結合，發(fā)現(xiàn)本研究中的UPGMA聚類結果與地理區(qū)劃有一定的關聯(lián)，但不明顯。例如，來自亞洲的T11，T12，T40，T34，T17被聚為一類，歐洲群體的T4，T6聚為一類。

對北美洲、歐洲、亞洲的種質進行遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，亞洲種質的遺傳多樣性最高，其遺傳相似系數(shù)變化為0.32；其次為北美洲種質，遺傳相似系數(shù)變化為0.22；歐洲種質的遺傳多樣性最小，僅為0.16。一個物種在其起源中心的遺傳多樣性最為豐富^[22]；葦狀羊茅原產于歐洲大部分地區(qū)、地中海地區(qū)^[23]，我國新疆、貴州等地亦有葦狀羊茅的分布^[24]。在本研究中，亞洲種質的遺傳多樣性最高，一方面是由于新疆、貴州等地有葦狀羊茅的自然分布，另一方面可能是引進種在當?shù)嘏c野生種進行了基因交流，增加了種質的遺傳多樣性。盡管歐洲為葦狀羊茅的起源中心，但在本研究中歐洲種質的遺傳多樣性最低，出現(xiàn)這種情況可能是由于6份種質均從俄羅斯引進，已經過相似的自然與人工選擇，拉近了其遺傳多樣性。本研究中，北美洲種質的遺傳多樣性為中等水平，這可能是多次從不同地區(qū)引種導致的。

針對其中的中國種質，相同區(qū)域的種質并沒有完全聚為一類。葛大朋等^[25]對西藏石榴（Punica granatum）進行UPGMA聚類劃分，所得結果與地理來源有一定的關聯(lián)，但并不完全一致；陳志祥等^[26]發(fā)現(xiàn)多數(shù)不同地理來源的木豆（Cajanus cajan）種質并未聚為一類；Liu等^[27]對中國鱷梨（Persea americana）進行研究，也有同樣發(fā)現(xiàn)。這與本研究所得結果相同。相同來源的種質緊密聚類，表明其遺傳具有特異性；同一區(qū)域的種質被分在不同分支中，表明其的進化來源可能不同。葦狀羊茅具有異花授粉，高度自交不親和的特征。因此這樣的聚類結果，可能也與國內葦狀羊茅的引種、種間雜交而造成的基因交流有關。與其他種植遺傳相似系數(shù)最低的T23，相較于其他種質，可能存在與其它物種進行基因交流較多的情況。

另外，本研究選擇了8份特征類型不同的商業(yè)品種，與其聚為一類的種質，可能存在同源或具有相似的優(yōu)良性狀，可在未來為該利用類型育種計劃提供新的種質來源。例如與牧草型葦狀羊茅品種‘法恩’聚為一類的T28，可能具有抗旱耐熱、產量高的優(yōu)良性狀；與草坪型葦狀羊茅品種‘鈦極’緊密聚類的T5，可能更為耐蔭抗旱。

核心種質能以最小數(shù)量，最大程度地代表全部資源的遺傳多樣性^[28]，這有利于種質資源的保存、提高利用效率^[29]。對參試材料進行初步篩選，發(fā)現(xiàn)T21，T22，T29，T37所包含的等位基因最多，具有核心種質的潛力，可進一步擴充種質資源庫，利用不同算法對葦狀羊茅種質構建核心種質。

4 結論

對60份葦狀羊茅進行地理區(qū)劃、EST-SSR標記等不同角度的遺傳多樣性分析，結果發(fā)現(xiàn)地理區(qū)劃與分子標記結果有所差異，參試種質遺傳多樣性處于中等水平，但仍可為葦狀羊茅育種計劃提供新材料。篩選發(fā)現(xiàn)T21，T22，T29，T37所包含的等位基因最多，具有核心種質潛力。

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（責任編輯 劉婷婷）