摘要：為研究次生共生菌對紅色型豌豆蚜有性世代生物學特性的影響，使用同時感染Hamiltonella和Regiella的紅色型豌豆蚜作為初始蚜蟲，首先運用抗生素喂食法得到未感染克隆，再制備3個人工感染克隆。將各克隆置于短日照環(huán)境下調查性比，再使用性蚜制作9個交配組合，統計各組合中性蚜交配后壽命、單雌產卵數和受精成功率，并調查受精卵的孵化歷期和孵化率。結果發(fā)現：感染Hamiltonella或Regiella后，豌豆蚜性比會變得偏雌，且性蚜壽命也會減短；當性雌蚜感染時，其單雌產卵數顯著減少，而雄蚜感染會導致受精成功率下降；雖然次生共生菌對受精卵孵化歷期無影響，但是感染次生共生菌的受精卵孵化率顯著上升；同時感染Hamiltonella和Regiella后并未發(fā)生相加效應。因此，盡管Hamiltonella和Regiella對豌豆蚜性蚜壽命有負面影響，但它們能通過調節(jié)性比、提高受精卵孵化率的方式來增強宿主適合度。Hamiltonella和Regiella之間可能存在競爭效應。

關鍵詞：豌豆蚜；次生共生菌；有性世代；發(fā)育；繁殖

中圖分類號：Q969.36+7.2 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2023）07-2012-08

Effect of Bacterial Secondary Symbionts on the Biological Characteristics of Sexual Generations of Pea Aphid （Red Morph）

LI Yang*， YANG Yan-fen， CHEN Ming-li

（College of Biology and Agriculture， Zunyi Normal University， Zunyi， Guizhou Province 563006， China）

Abstract：To clarify the effects of bacterial secondary symbionts on the biological characteristics of sexual generations of Acyrthosiphon pisum red morph，A. pisum red morph infected with both Hamiltonella and Regiella were used as initial aphids. First，clones uninfected with bacterial secondary symbionts were obtained using the antibiotic feeding method，then 3 artificially infected clones were prepared. Each infected clone was placed under a short daylight environment to reveal the sex ratio and then 9 different mating treatments all of which were sexual aphids were prepared and after mating the longevity of the sexual aphids，reproduction and fertilisation success rate of each mating treatment were counted，and the incubation period and hatching rate of fertilised eggs were further investigated. The results showed that the sex ratio becomes female biased and the longevity of sexual aphids reduced when infected with Hamiltonella or Regiella. Infection of oviparous females reduced the number of eggs，while infection of males resulted in reduced fertilisation rates. Whether the fertilised eggs infected with bacterial secondary symbionts or not had no significant effect on the hatching calendar，however，the hatching rate of fertilised eggs infected with bacterial secondary symbionts was significantly higher than that of uninfected eggs. There was no additive effect after simultaneous infection with Hamiltonella and Regiella. These results indicate that Hamiltonella and Regiella had a negative effect on the longevity of sexual aphids of the A. pisum red morph clone，however，their ability to enhance host fitness by regulating the sex ratio and increasing the hatching rate of fertilised eggs. There might be a competitive effect between Hamiltonella and Regiella.

Key words：Acyrthosiphon pisum;Bacterial secondary symbionts;Sexual generation;Development;Reproduction

在自然界中，許多生物與其他物種保持著多樣且持久的共生關系^[1]。共生關系按照對物種的影響被分為中性作用、偏利共生、原始協作、互利共生和偏害共生^[2]。近半數節(jié)肢動物的組織或細胞內攜帶著各種微生物^[3]，雖然這些微生物并非是所有宿主維持生存所必需的生命要素，但是，對于多數蚜蟲而言，其體內共生微生物所發(fā)揮的作用至關重要，因為它們直接影響了蚜蟲的繁殖、生長和免疫等生命活動^[4]。

蚜蟲體內的共生微生物主要分為初生共生菌和次生共生菌。初生共生菌（Buchnera）是多數蚜蟲生存和繁殖所必需的微生物，它能為宿主提供維管束汁液中缺乏的營養(yǎng)物質，以維系宿主正常發(fā)育，依靠垂直傳播由親代傳遞給子代。同時，宿主也為Buchnera提供生存空間和養(yǎng)分。研究表明，去除Buchnera后，蚜蟲適合度會顯著下降^[4]。相對于初生共生菌的單一種類，蚜蟲次生共生菌種類較多，它們不僅可以垂直傳播，還能水平傳播^[5]。大部分蚜蟲克隆都含有1～2種次生共生菌^[6]，次生共生菌并非是蚜蟲生長和代謝所必需的微生物，但是它們能通過各種機制影響宿主的生長和繁殖。例如：Regiella不僅可以增加桃蚜（Myzus persicae）和黑豆蚜（Aphis craccivora）對科曼尼蚜繭蜂（Aphidius colemani）的抵抗力^[7-8]，還能提高豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）在白車軸草（Trifolium repens）上的適合度^[9]；Spiroplasma不僅能降低新蚜蟲厲霉（Pandora neoaphidis）對豌豆蚜的感染率^[10]，而且對豌豆蚜性比也有顯著的調控作用。Hamiltonella能降低煙蚜繭蜂（Aphidius gifuensis）對豌豆蚜的寄生成功率^[11]，并且能提高豌豆蚜對高溫脅迫的抗性^[12]；Rickettsiella可以使紅色型豌豆蚜變成綠色^[13]。

豌豆蚜隸屬于半翅目（Hemiptera）蚜科（Aphididae），主要取食豆科植物，最初分布于南歐和北非地區(qū)，受人類貿易活動的影響，現在幾乎所有溫帶地區(qū)均有其分布^[14]，成為當前全球重要的農業(yè)害蟲之一^[15]。在中國大部分地區(qū)，在春、夏季長日照條件下，豌豆蚜靠孤雌生殖進行繁衍，在秋季低溫、短日照作用下，性母產生性雌蚜和雄蚜，2者交配后產下受精卵越冬。有性生殖不僅能幫助豌豆蚜越冬，也是其提高遺傳多樣性的途徑。有性生殖階段各蟲態(tài)的生長發(fā)育對于來年春季蚜蟲種群的發(fā)生和發(fā)展具有重要影響^[16]。目前已知豌豆蚜有紅、綠、黃3種體色，且3者間生物學特性差異明顯^[17-18]。另外，基因流動導致豌豆蚜不同寄主種群間的適合度也有差異^[19]。研究發(fā)現，次生共生菌可以通過豌豆蚜性母傳遞給性雌蚜和雄蚜，再由性雌蚜傳遞給卵^[20-21]。目前，有一些學者研究了次生共生菌在綠色型豌豆蚜孤雌生殖階段的抗逆性作用，證明次生共生菌能給蚜蟲帶來額外的生態(tài)效益^[9-11]。但是，關于Regiella和Hamiltonella對紅色型豌豆蚜有性世代生物學特性的影響研究還很少，為了評估Regiella和Hamiltonella對紅色型豌豆蚜有性生殖階段生長和繁殖產生的影響。本研究使用具有相同遺傳背景的紅色型豌豆蚜克隆作為試驗材料，人工制備感染不同類型次生共生菌的克隆，對各感染克隆有性世代的生物學特性進行觀察和研究，旨在探索次生共生菌對紅色型豌豆蚜發(fā)育和繁殖的生態(tài)影響機制，擬為豌豆蚜和共生微生物的協同進化機制研究及豌豆蚜防控策略的制定提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 蟲源采集和人工感染體的制備

分別在新疆自治區(qū)呼圖壁縣和寧夏自治區(qū)固原縣的紫花苜蓿（Medicago Sativa）種植地采集10個紅色型豌豆蚜克隆，帶回實驗室，移入光照培養(yǎng)箱（溫度為20℃，光周期為L∶D=16∶8，光照強度為7 000～8 000 lx，濕度：50%～60%）中，使用5 cm左右的蠶豆（Vicia faba）幼苗進行單克隆繼代飼養(yǎng)，蠶豆品種為‘七星長龍’。

使用診斷PCR法^[22]對各克隆次生共生菌感染情況進行調查后，最終選擇采集自新疆自治區(qū)呼圖壁縣的N克?。ㄍ瑫r感染Hamiltonella和Regiella）、R克?。▎为毟腥綬egiella），以及采集至寧夏自治區(qū)固原縣的H克隆（單獨感染Hamiltonella）進行后續(xù)實驗。同時感染Hamiltonella和Regiella的N克隆標記為N（H+R）。

使用抗生素喂食法^[23]去除N（H+R）克隆體內的次生共生菌，得到未感染次生共生菌的N克隆，標記為N（U）。之后使用顯微注射器，參照Oliver等的方法^[24]，將R克隆的體液分別注射到5頭N（U）克隆的體內，后者被分別轉移至不同的蠶豆苗上連續(xù)飼養(yǎng)8代，每代更換一次蠶豆苗，8代后，使用診斷PCR法確認最終感染情況，選擇1個單獨感染Regiella的克隆進行后續(xù)實驗，該克隆標記為N（R）。再用相同的方法制作單獨感染Hamiltonella的N克隆以及重新感染Hamiltonella和Regiella的N克隆，分別標記為N（H）和N（new H+R）。

1.2 試驗設計

1.2.1 試驗裝置 本研究的實驗使用瓊脂法^[25]進行，誘導有性世代使用的培養(yǎng)基為直徑12 cm，高4 cm的塑料容器，豌豆蚜交配使用的培養(yǎng)基為直徑6 cm，高2 cm的塑料容器。葉片均采集自株高15 cm左右的蠶豆植株‘七星長龍’。本研究中紅色型豌豆蚜性蚜的誘導和交配均使用瓊脂法進行，該方法目前已被運用于豌豆蚜和其他昆蟲的研究^{[17-18，26]}。

1.2.2 次生共生菌對紅色型豌豆蚜性別分化的影響 將N（H+R），N（H），N（R），N（U）和N（new H+R）的3頭3齡若蟲分別移入載有2片蠶豆葉的培養(yǎng)基，置于光照培養(yǎng)箱（15℃，L∶D=10∶14，光照強度7 000～8 000 Lux，濕度50%～60%）中作為G0進行飼養(yǎng)，當G0產蚜開始后，隨機選擇1頭若蚜，轉移到新的培養(yǎng)基上作為G1（性母）進行飼養(yǎng)，每隔5 d更換一次容器蓋，并添加1片新鮮蠶豆葉。當G1產下的若蟲（G2）發(fā)育為成蟲之后，統計各克隆性雌蚜和雄蚜的個體數，計算性比。本研究中的性比=雄蚜數/性雌蚜數。每個克隆重復10次。

1.2.3 次生共生菌對紅色型豌豆蚜性蚜交配后壽命和繁殖的影響 使用1.2.2中的方法誘導出N（H+R），N（H），N（R），N（U）和N（new H+R）克隆的性蚜，本研究中所有雄蚜均為有翅型，為了防止雄蚜在實驗開始前交配，當雄蚜發(fā)育至4齡時，把相同克隆的雄蚜集中移入新的培養(yǎng)基中，待其發(fā)育至成蟲后備用。將各克隆前一天羽化的1頭雄蚜和性雌蚜按照表1所示的組合同時放入載有2片蠶豆葉的培養(yǎng)基中，觀察交配情況，觀察時間為上午9：00～11：00，觀察當天提前1小時將室內空調溫度設置為15℃，光線調至7 000 lx左右，共有3名實驗人員觀察蚜蟲交配情況，當發(fā)現交配后立刻記錄培養(yǎng)基編號，待交配完成，將該培養(yǎng)基重新移入培養(yǎng)箱（15℃，L∶D=10∶14，光照強度7 000～8 000 Lux，濕度50%～60%）中繼續(xù)飼養(yǎng)，連續(xù)觀察3 d，每個組合觀察到12個重復為止。之后，每天上午檢查1次性蚜存活情況，直至性蚜全部死亡，記錄各組合性蚜交配后壽命和產卵數，進行比較分析。發(fā)育正常的受精卵會在產后7 d左右變成黑色，這是由于受精卵產生了黑色角質層，而未受精卵則保持淡綠色^[19]。在性蚜死亡7 d后，統計各培養(yǎng)基黑化卵的數量，計算各交配組合的受精成功率，并進行比較分析，本研究中的受精成功率=（黑化卵數/總產卵數）×100%。

1.2.4 次生共生菌對紅色型豌豆蚜受精卵孵化歷期和孵化率的影響 將各交配組合的受精卵分別轉移至墊有濾紙的方形小盒（長×寬×高=2 cm×2 cm×1 cm）中，放置于光照培養(yǎng)箱（3℃，L∶D=0∶24，濕度 50%～60%）保存。3個月后，將光照培養(yǎng)箱設置為19℃，07：00～15：00；6℃，15：00～07：00；光照強度7 000～8 000 lx，濕度50%～60%，誘導卵孵化，每天下午檢查1次孵化情況，統計各交配組合受精卵的孵化歷期和孵化率。本研究中的孵化率=（孵化數/黑化卵數）×100%。

1.3 數據處理

本研究所有數據均采用JMP V15進行分析，不同次生共生菌感染狀態(tài)下紅色型豌豆蚜有性世代性比，各交配組合的總卵數、受精成功率、孵化歷期及孵化率使用廣義線性模型進行分析，多重比較采用Tukey-Kramer test法進行，性蚜交配后壽命的比較使用Kaplan meier法進行，受精成功率和孵化率的數據在分析前先進行反正弦變化。繪圖軟件是Graphpad prism V9.5，表格使用Word V2019制作。

2 結果與分析

2.1 不同次生共生菌感染下的性別分化

次生共生菌種類對紅色型豌豆蚜有性世代性比影響顯著（Plt;0.001），通過Tukey-Kramer test法對各克隆性比進行分析后的結果如圖1所示，未感染次生共生菌的N克?。∟（U））性比最高，達到0.945，當感染次生共生菌后，其余克隆性比均顯著降低，同時感染Hamiltonella和Regiella的N克?。∟（H+R））的性比為0.689，單獨感染Regiella的N克?。∟（R））的性比為0.651，重新感染Hamiltonella和Regiella的N克?。∟（new H+R））的性比為0.677，三者間無顯著性差異。單獨感染Hamiltonella的N克隆（N（H））性比最低，僅為0.340。

2.2 不同感染克隆性蚜的交配后壽命

分別對各克隆性雌蚜和雄蚜的平均交配后壽命使用Kaplan meier法分析后的結果如圖2A和2B所示，在性雌蚜交配后壽命上，對照組（N（U）in CK）的壽命為13.600 d，與其他交配組合的未感染克隆相比無顯著性差異。當感染次生共生菌后，各克隆壽命均顯著降低。單獨感染Regiella的N克隆N（R）降至11.300 d，同時感染Hamiltonella和Regiella的N克隆N（H+R）、單獨感染Hamiltonella的N克隆N（H）及重新感染Hamiltonella和Regiella的N克隆N（new H+R）的交配后壽命間無顯著性差異，但它們均顯著低于單獨感染Regiella的N克隆N（R）。在雄蚜交配后壽命上，各交配組合的未感染克隆間無顯著性差異。和性雌蚜一樣，感染后的壽命也顯著降低，感染Hamiltonella的三個克?。∟（H+R），N（H）和N（new H+R））間無顯著性差異，均顯著低于于單獨感染Regiella的克?。∟（R））10.000 d。

2.3 不同交配組合的單雌產卵數和受精成功率

不同感染類型之間單雌產卵數具有顯著性差異（Plt;0.001）。性雌蚜感染次生共生菌后對產卵數影響顯著（Plt;0.001），由Tukey-Kramer test法分析結果可知，對照（CK）的總卵數為（12.500粒），顯著高于A1（10.500粒）、A2（10.200粒）、A3（9.900粒）和A4（9.600粒），后4者間無顯著性差異。無論雄蚜是否感染，對性雌蚜的產卵數均無顯著影響（圖3A）。另一方面，各感染類型的受精率之間也有顯著性差異（Plt;0.001），無論性雌蚜是否感染次生共生菌，受精率均無顯著變化，但是，當雄蚜感染后，受精率受到顯著影響（Plt;0.001），通過Tukey-Kramer test法分析后發(fā)現，對照組（CK）的受精率為91.899%，顯著高于B1（79.235%）、B2（77.701%）、B3（76.519%）和B4（79.235%），后4者間無顯著性差異（圖3B）。

2.4 不同交配組合受精卵的孵化歷期和孵化率

各交配組合間受精卵的孵化歷期無顯著性差異，平均孵化歷期為8.7 d。但是，性蚜感染類型對受精卵的孵化率具有顯著影響（Plt;0.001），性雌蚜感染次生共生菌后受精卵的孵化率發(fā)生顯著變化（Plt;0.001），且次生共生菌種類對孵化率也有顯著影響（Plt;0.05），各組合受精卵的孵化率如圖4所示。使用Tukey-Kramer test法進行分析后發(fā)現，對照（CK）的受精卵孵化率（52.907%）最低，感染Regiella的3個組合（A1，A2，A4）的受精卵的孵化率之間無顯著性差異，但是，單獨感染Regiella的A2的孵化率（80.144%）顯著高于單獨感染Hamiltonella的A3的孵化率（68.780%）。雄蚜是否感染次生共生菌對于受精卵的孵化率無顯著影響。

3 討論

在野外采集的豌豆蚜初始N克隆，同時感染Hamiltonella和Regiella，其性比偏雌，約為0.65。在蚜蟲種群中，雄性個體數量過多會因為爭奪配偶而引發(fā)局部配偶競爭（LMC）并干擾性雌蚜蛻皮和產卵，從而導致受精卵數減少^[27-28]。因此，性比偏雌有利于增加來年春季蚜蟲種群數量，確保種群的長期延續(xù)。當除去次生共生菌后，未感染的N克隆性比提升至約1。重新感染Hamiltonella和Regiella或單獨感染Regiella后，新感染克隆性比與初始N克隆之間均無明顯差異。另外，當N克隆只感染Hamiltonella時，其性比變得極端偏雌。這表明次生共生菌在豌豆蚜性比調控中扮演了重要的角色。由于感染次生共生菌Spiroplasma的豌豆蚜雄蚜若蟲在幼齡階段死亡率很高^[1]，有學者認為Spiroplasma通過殺雄作用^[29]改變了豌豆蚜性比，但是本研究實驗過程中并未發(fā)現大量性蚜若蟲死亡的現象。所以，Hamiltonella和Regiella對豌豆蚜性比調控的作用機制與Spiroplasma不同，除Spiroplasma之外，光周期也能影響蚜蟲性比，Erlykova發(fā)現相同克隆的豌豆蚜在不同光周期下性比具有顯著差異^[30]，許多蚜蟲性母體內保幼激素滴度降低時會產生雄蚜^[31]。據此推測，Hamiltonella和Regiella可能通過與環(huán)境光周期的相互作用，調節(jié)性母體內保幼激素的水平，從而影響豌豆蚜的性比。在未來的工作中，將對各感染克隆在不同光周期下的保幼激素滴度和性比進行調查研究。

本研究發(fā)現，無論是感染Hamiltonella還是Regiella，性蚜壽命均有不同程度的下降?，F有研究表明，Hamiltonella通過產生毒素來降低蚜蟲體內寄生蜂卵和幼蟲的存活率^[32-33]，從而提高蚜蟲抗性。然而，在未被寄生的情況下，Hamiltonella會降低蚜蟲的適合度^[34]，因此，該毒素也可能對性蚜壽命產生負面影響。同樣，Regiella也能降低寄生蜂幼蟲在豌豆蚜體內的存活率，但是其作用機制與Hamiltonella不同^[35]，此外，Regiella對豌豆蚜壽命的影響還與豌豆蚜基因型有關^[36]，因此，Regiella對性蚜壽命的影響程度可能與Hamiltonella不同。豌豆蚜的性雌蚜即使未交配也能產卵，由于性雌蚜感染次生共生菌后壽命顯著降低，其產卵數也隨之減少。然而，無論雄蚜是否感染，均未引起性雌蚜產卵數的變化。由此推測，有性世代的產卵數主要與性雌蚜活性有關。值得注意的是，在對照組（CK）中，受精成功率達到92%。這一結果表明未感染的雄蚜的生理狀態(tài)基本能夠滿足壽命較長的未感染性雌蚜的受精需求，由于感染次生共生菌后性雌蚜壽命顯著降低，因此可以推斷未感染雄蚜也能夠滿足感染克隆性雌蚜的受精需求。另一方面，在B1，B2，B3和B4中，由于雄蚜全部感染，其壽命顯著縮短導致活力降低，最終受精成功率也隨之減少。因此，豌豆蚜的受精成功率可能由雄蚜活力決定。近親交配對豌豆蚜后代適合度具有負面影響^{[19，37]}。盡管性母感染次生共生菌會降低同克隆雄蚜的壽命，但在野外環(huán)境中，這對于性雌蚜與非親緣雄蚜的進一步交配具有積極的促進作用，能間接提高豌豆蚜遺傳多樣性。

蚜蟲共生菌很難通過雄蚜傳遞給子代^[38]，因此B1，B2，B3和B4的受精卵未感染次生共生菌，而A1，A2，A3和A4的受精卵通過母系垂直傳播完整地得到了性雌蚜的共生菌系統。蚜蟲卵的孵化歷期與寄主植物在春季的出芽時間相關聯^[39]，本研究中，不同感染個體均來自同一初始克隆，具有相同遺傳背景，各交配組合的受精卵孵化歷期間無顯著性差異，這表明豌豆蚜卵的孵化歷期不受次生共生菌影響，這與前文^[39]結論相符。在本研究中，未感染卵的孵化率低于感染卵，并且不同類型感染卵之間的孵化率也有差異。部分真菌對昆蟲和螨類卵的孵化具有負面影響^[40-42]，受精卵在被產下到孵化的時間段內，可能會受到周圍環(huán)境中真菌的侵染，調查時發(fā)現蚜蟲卵周圍有菌絲分布，但具體類別尚不明確。由于Regiella和Hamiltonella能夠增強蚜蟲抵御真菌侵染的能力^[43]，它們在提高卵抗真菌感染能力上可能發(fā)揮了積極作用，使得感染卵的孵化率高于未感染卵，但由于2種次生共生菌的抗真菌機制可能存在差異，致使不同類型感染卵防御侵染的效果有所不同。在以后的工作中，將對受精卵周圍的真菌進行分類鑒定，并通過人工接種感染的方式進一步確定Regiella和Hamiltonella的抗真菌能力。

當宿主同時感染多種次生共生菌時，不同組合的共生菌之間可能產生互利或競爭效應，進而對宿主產生協同、相加或者拮抗的效果^[44]。例如：同時感染Hamiltonella和Serratia的豌豆蚜對阿爾蚜繭蜂的抗性更強^[45]，但是，同時感染Hamiltonella和Arsenophonus的棉蚜（Aphis gossypii）對煙蚜繭蜂的抗性卻很差^[46]，同時感染Rickettsiella和Hamiltonella時比單獨感染Rickettsiella時更容易被瓢蟲捕食^[47]。本研究結果表明，單獨感染Hamiltonella或Regiella時，對有性世代多項生物學參數具有顯著影響，但是，同時感染Hamiltonella和Regiella時，并未發(fā)現明顯的相加效應，據此推測，Hamiltonella和Regiella在豌豆蚜體內作用機制可能會互相干涉，由于它們需要維持自身的機制，從而導致兩者間的競爭，為了在競爭中占據優(yōu)勢，各自會付出額外的成本。換言之，共生菌需要在共生過程中給不同時期的宿主提供多種潛在的利益，幫助宿主提高適合度，以增強宿主對自身的依賴性，最終與宿主形成利益共同體。有研究發(fā)現，不同Spiroplasma菌株間的殺雄效果具有顯著性差異^[10]，而且Hamiltonella的“毒性”有減弱的趨勢^[34]，這可能是共生菌和宿主一方進化或者雙方協同進化的結果。在未來的研究中，將調查其它Hamiltonella和Regiella的菌株對不同寄主種群豌豆蚜生物學特性的影響。

4 結論

次生共生菌Hamiltonella或Regiella感染紅色型豌豆蚜后，雖然會對宿主壽命造成負面影響，但它們均能通過調節(jié)性比、提高受精卵孵化率的方式增強宿主的適合度。當同時感染Hamiltonella和Regiella時，兩者對豌豆蚜有性世代生長和繁殖的影響程度可能由它們之間的相互作用所決定。

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（責任編輯 閔芝智）