程盟玲，何 鵬

(蕪湖市食品藥品檢驗(yàn)中心，蕪湖 241000)

坤寧顆粒是由益母草、當(dāng)歸、赤芍、丹參、枳殼等 11 味中藥加一定的賦形劑，經(jīng)提取、濃縮、干燥后制成的具有活血行氣、止血調(diào)經(jīng)功效的中藥顆粒劑[1]。對(duì)于婦女氣滯血瘀，出現(xiàn)月經(jīng)過(guò)多、經(jīng)期延長(zhǎng)等臨床癥狀者，坤寧顆粒能明顯縮短出血時(shí)間，具有很好的促凝作用，集調(diào)經(jīng)和止血于一體，既治標(biāo)又治本，達(dá)到止血調(diào)經(jīng)的效果。研究表明，坤寧顆粒中有四百多種成分，而其發(fā)揮抗凝血活性的 Q-Marker以及治療異常子宮出血的物質(zhì)基礎(chǔ)可能就是芍藥苷、丹酚酸B、新橙皮苷及柚皮苷等成分[2]。丹酚酸B來(lái)自丹參，芍藥苷來(lái)自赤芍，新橙皮苷與柚皮苷均出自枳殼。枳殼作為臣藥，用量較大，而目前該顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為YBZ10452005-2015Z，主要控制組方中赤芍的芍藥苷含量，輔以橙皮苷、鹽酸水蘇堿等成分對(duì)枳殼、益母草等藥味進(jìn)行定性鑒別，均沒(méi)有對(duì)枳殼的有效成分如橙皮苷、柚皮苷等進(jìn)行含量監(jiān)測(cè)[3]。為了對(duì)坤寧顆粒的質(zhì)量進(jìn)行更好的監(jiān)測(cè)，本文建立HPLC方法，以柚皮苷計(jì)測(cè)定枳殼的含量，判斷坤寧顆粒中枳殼藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣。該方法操作簡(jiǎn)單易學(xué)，速度快，重現(xiàn)性好，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。

1 儀器與試劑

高效液相色譜儀：島津LC-20AT；PDA檢測(cè)器：島津SPD-M40；分析天平：梅特勒-托利多XP205、梅特勒-托利多ME36S；水為超純水；乙腈為色譜純，甲醇以及磷酸為分析純；柚皮苷對(duì)照品：中檢院，110722-202116，含量以93.5%計(jì)；坤寧顆粒樣品：藥房購(gòu)買(mǎi)，生產(chǎn)廠(chǎng)家為合肥立方制藥股份有限公司，每袋裝 15 g，批號(hào)220109、220701、2208011、2209009。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：島津SHIMSEN Ankylo C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃；波長(zhǎng)：283 nm；以乙腈-0.1%磷酸溶液(0～25 min：16∶84；25～27 min：16～35∶84～65；27～32 min：36∶65)為流動(dòng)相；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取柚皮苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加80%甲醇制成 25.67 μg/mL 的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取研細(xì)后的樣品粉末 1 g，置錐形瓶中，精密加入80%甲醇 50 mL，稱(chēng)重，超聲(功率 200 W，頻率 30 kHz)30 min，冷卻后稱(chēng)重，用80%甲醇補(bǔ)足減少的質(zhì)量，過(guò)濾，取過(guò)濾液，即得。

2.4 試驗(yàn)與結(jié)果

2.4.1 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)(220109)坤寧顆粒，按“2.3”制備6份供試品溶液，按“2.1”分別測(cè)定，計(jì)算柚皮苷的含量，RSD=0.9%，該方法重復(fù)性良好，符合檢測(cè)需求。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 精密度試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.1”連續(xù)測(cè)定6 次，記錄柚皮苷峰面積值，RSD=0.3%，儀器精密度較好，符合檢測(cè)需求。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 對(duì)照品溶液的精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4.3 線(xiàn)性

取柚皮苷對(duì)照品，精密稱(chēng)取 10.98 mg，置 100 mL 容量瓶中，加80%甲醇溶解至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液，按照表3方法制成6種質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液；取上述6種對(duì)照品溶液，按“2.1”分別測(cè)定，以質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，柚皮苷在5.13～102.66 μg/mL 范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系[4]?；貧w方程為Y=15223.662X+2947.521，R2=1.000。結(jié)果見(jiàn)表3、圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)數(shù)據(jù)

2.4.4 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量(批號(hào)220109，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1.52 mg/g)的坤寧顆粒，研細(xì)，取樣品 1 g，對(duì)照品 3 mg，精密稱(chēng)定，置同一具塞錐形瓶中，按“2.3”平行制備6份加標(biāo)溶液，按“2.1”分別測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果RSD=1.3%，本方法具有良好的回收率，符合檢測(cè)需求。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回收試驗(yàn)結(jié)果

計(jì)算公式：

(1)

2.4.5 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

陰性對(duì)照液的制備：取坤寧顆粒組方除枳殼外其他藥味，按照坤寧顆粒工藝方法，制成陰性樣品，取該樣品1 g，按“2.3”制備陰性對(duì)照液。

取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照液和“2.1”項(xiàng)下1號(hào)供試品溶液，按“2.1”分別測(cè)定[5]。結(jié)果表明，在同一保留時(shí)間，供試品與對(duì)照品色譜均出現(xiàn)色譜峰，在相應(yīng)位置上，陰性對(duì)照色譜未出現(xiàn)色譜峰。表明其他藥味中的成分對(duì)測(cè)定柚皮苷無(wú)干擾作用。色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 HPLC色譜圖

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取坤寧顆粒樣品，按“2.3”制成1份供試品溶液，分別測(cè)定并記錄 0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 時(shí)供試品中的柚皮苷峰面積值，結(jié)果RSD=0.3%，表面供試品溶液中的柚皮苷含量在 24 h 內(nèi)無(wú)明顯變化，具有良好的穩(wěn)定性，可以滿(mǎn)足測(cè)定要求。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同時(shí)間測(cè)定供試品中柚皮苷的峰面積

2.4.7 定量限考察

取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，用80%甲醇逐級(jí)稀釋?zhuān)瞥傻蜐舛鹊娜芤?，按?.1”測(cè)定，直至待測(cè)成分的儀器信噪比(S/N)約為10∶1，取此時(shí)對(duì)照品溶液的濃度為定量限[6]。結(jié)果柚皮苷的定量限為 3.72 μg/mL。

2.5 樣品含量測(cè)定

取不同批號(hào)(批號(hào)220701、2208011、2209009)的坤寧顆粒，每批樣品分別按“2.3”平行制備2份供試品溶液，按“2.1”測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果(mg/g)

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇

本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖墙⒈O(jiān)測(cè)坤寧顆粒中枳殼含量的方法，通過(guò)查閱文獻(xiàn)可知，枳殼中含有較多的黃酮類(lèi)物質(zhì)，包括橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、木犀草素等多種成分[7]，其中橙皮苷與柚皮苷作為枳殼的有效成分及活性物質(zhì)，一定程度上反應(yīng)了枳殼的質(zhì)量?jī)?yōu)劣[8]，均可作為本研究的指標(biāo)成分，前期實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)樣品經(jīng)甲醇提取后橙皮苷、木犀草素等含量較少，柚皮苷則較多，所以選擇柚皮苷作為坤寧顆粒中枳殼的指標(biāo)成分進(jìn)行測(cè)定。

3.2 色譜條件選擇

波長(zhǎng)：預(yù)實(shí)驗(yàn)中，采用PDA檢測(cè)器對(duì)柚皮苷對(duì)照品進(jìn)行光譜掃描，通過(guò)光譜圖顯示的最大吸收，同時(shí)參考《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版中枳殼以及其他含枳殼的中成藥含量測(cè)定的方法，將波長(zhǎng)定為 283 nm。

流動(dòng)相：預(yù)實(shí)驗(yàn)中，選擇甲醇作為有機(jī)相，水、3%冰醋酸溶液作為水相，考察不同比例下樣品主峰的分離度，峰形與分離度均無(wú)法達(dá)到要求。后將有機(jī)相換成乙腈，水相換成不同濃度的磷酸溶液，峰形有了較大改善，等度時(shí)分離度依然無(wú)法達(dá)到要求。采用乙腈-磷酸系統(tǒng)梯度洗脫時(shí)，磷酸溶液濃度過(guò)高或者過(guò)低，均會(huì)導(dǎo)致色譜峰前拖嚴(yán)重。最終采用乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫的方式，此時(shí)峰形與分離效果均達(dá)到最佳狀態(tài)。

色譜儀：分別使用安捷倫1260、賽默飛3000進(jìn)行進(jìn)樣分析，結(jié)果不同儀器色譜峰分離度均不小于1.5，峰形良好，符合測(cè)定要求。

3.3 提取條件選擇

提取溶劑：預(yù)實(shí)驗(yàn)中考察了使用乙醇、稀乙醇、甲醇、80%甲醇以及50%甲醇等溶劑的提取效果。使用乙醇與稀乙醇提取時(shí)，提取液 24 h 內(nèi)不穩(wěn)定，產(chǎn)生渾濁。使用甲醇提取時(shí)，不同濃度下柚皮苷提取量差別不大，80%甲醇提取量略多于其他，所以選擇80%甲醇作為最終的提取溶劑。

提取方法及時(shí)間：預(yù)實(shí)驗(yàn)中考察了靜置過(guò)夜、振搖、加熱回流以及超聲提取等多種提取方法。靜置過(guò)夜與振搖同其他兩種方法相比提取效果較差，而加熱回流與超聲的提取效果相似，超聲提取簡(jiǎn)單快捷，容易操作，所以選擇超聲提取。比較超聲提取 30 min、45 min 及 60 min，柚皮苷提取量相當(dāng)，無(wú)明顯變化，所以選擇超聲提取 30 min。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本方法中建立的HPLC法操作簡(jiǎn)便，經(jīng)方法學(xué)考察，重復(fù)性和分離度符合要求，準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性良好，符合檢測(cè)需求，為進(jìn)一步完善坤寧顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了借鑒。