周高婷，杜劍波

1.上海紀(jì)凱科技服務(wù)有限公司，上海 212000；2.上海完形健康管理咨詢有限公司，上海 212000

目前，土壤重金屬污染廣泛存在。我國(guó)土壤的重金屬總超標(biāo)率為16.1%，其中土壤鎘超標(biāo)率達(dá)7%[1]。土壤中鎘存在形式的不同會(huì)影響其植物有效性，植物有效性從大到小的順序依次為交換態(tài)、碳酸鹽結(jié)合態(tài)、鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)、有機(jī)結(jié)合態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)。施用無(wú)機(jī)礦物蒙脫石可以降低土壤中鎘的生物有效性，促進(jìn)水稻生長(zhǎng)[1]。施用硫酸鹽還原菌WH16-1 也可以降低土壤中鎘的生物有效性，從而增加水稻產(chǎn)量、減少水稻中鎘的含量[2]。

煙草是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，煙葉中鎘的含量嚴(yán)重影響著煙草的品質(zhì)。煙葉中鎘的含量與土壤中鎘的含量密切相關(guān)，我國(guó)煙葉主產(chǎn)區(qū)中煙葉的鎘含量遠(yuǎn)超過(guò)食品中的允許值——0.2 mg/kg[3]。本文利用土壤盆栽和大田實(shí)驗(yàn)探究了細(xì)菌WH16-1 對(duì)煙草產(chǎn)量、葉綠素和酶活的變化及煙草根莖葉中鎘含量的影響，驗(yàn)證了其對(duì)鎘污染土壤的修復(fù)效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用菌株為WH16-1。細(xì)菌培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[2]在LB 培養(yǎng)基中進(jìn)行。煙草品種為云煙-87，由湖北省煙草公司恩施州公司提供。煙草幼苗于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前30 d 左右播種培育，待幼苗長(zhǎng)到15 cm 左右，選擇健康、長(zhǎng)勢(shì)均一的煙苗進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 煙草盆栽實(shí)驗(yàn)

采用恩施市望城坡農(nóng)田土，土壤自然風(fēng)干，去除大塊石頭及雜草。在每個(gè)盆中裝入15 kg 風(fēng)干土壤，在盆底部墊上盆墊。按15 %含水率加水，并在每個(gè)盆中裝入數(shù)量相同、大小均一的小石頭，以便透氣。實(shí)驗(yàn)設(shè)6 個(gè)處理，分別是：對(duì)照S（不加鎘和菌）、對(duì)照S+2Cd（加2 mg/kg Cd2+不加菌）、對(duì)照S+6Cd（加6 mg/kg Cd2+不加菌）、實(shí)驗(yàn)組S+WH16-1（不加Cd2+加菌）、實(shí)驗(yàn)組S+2Cd+WH16-1（加2 mg/kg Cd2+加菌）、實(shí)驗(yàn)組S+6Cd+WH16-1（加6 mg/kg Cd2+加菌）。每種處理選取6 盆，共計(jì)36 盆。按照煙草盆栽實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別加入硝酸鎘溶液或等量的去離子水對(duì)土壤進(jìn)行處理，邊拌入鎘溶液邊攪拌土壤，使其混合均勻。采用深施覆土的方式按40 g/盆添加復(fù)合肥（復(fù)合肥N2O∶P2O5∶K2O =10∶10∶20）并拌勻。1 d后，加菌處理組加入500 mL/盆菌液，不加菌液的處理組加入等量0.9%氯化鈉溶液；3 d 后，在每盆土壤的相同深度處種植一株健康狀況、大小、葉片個(gè)數(shù)基本相同的云煙-87 煙苗。在盆栽過(guò)程中要保證土壤具有一定的濕度，定期補(bǔ)充水分并松土。按照煙草的正常生長(zhǎng)條件進(jìn)行管理。在煙草成熟期（120 d）取煙草樣品，同時(shí)取盆中距離地表15 cm 左右的煙草根際附近的土樣，土樣經(jīng)風(fēng)干研磨后過(guò)孔徑為0.25 mm 篩，植物樣品按照煙草常用的工藝進(jìn)行殺青、烘干，及至含水率低于5 %。

1.3 煙草大田實(shí)驗(yàn)

煙草大田實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)三個(gè)處理：不加鎘加菌的處理S、S+2Cd（加2 mg/kg Cd2+不加菌）及S+2Cd+WH16-1（加2 mg/kg Cd2+不加菌）。實(shí)驗(yàn)田選在恩施望城坡，采用“X”法采集5 個(gè)地點(diǎn)的土樣，以井窯式種植煙草。田地起隴覆膜平衡好后，使用打孔機(jī)在隴上均勻打孔，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將硝酸鎘溶液和菌劑WH16-1 分別施入孔內(nèi)并與周圍土壤拌勻，不加硝酸鎘和菌液的處理中加入等量的去離子水，每個(gè)孔加入500 mL 水，按40 g/株添加復(fù)合肥（復(fù)合肥N2O∶P2O5∶K2O =10∶10∶20），拌勻后覆蓋土壤，防止曬干，并做好標(biāo)記。每個(gè)處理選取34 株煙苗，不同處理之間隔兩株作為保護(hù)，每?jī)芍觊g的行間距為80 cm，株間距為30 cm。按田間煙草正常生長(zhǎng)管理模式進(jìn)行管理，在煙草成熟期（90 d）取煙樣及土樣。

1.4 分析方法與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

在煙草成熟期（盆栽120 d，大田90 d）測(cè)量株高、株莖、葉片數(shù)并記錄。煙草取樣后，將其分成根、莖、葉并清洗晾干，在110 ℃殺青30 min 后以70 ℃烘干至恒重，測(cè)量煙草的干重并進(jìn)行比較。

盆栽土壤中鎘、速效磷、堿解氮、有機(jī)質(zhì)含量及土壤pH 分別為：2±0.57 mg/kg、3.65±0.24 mg/kg、310.99±10.48 mg/kg、20.66±2.57 g/kg 和7.88±0.13。大田土壤中的上述物質(zhì)分別為：3±0.18 mg/kg、2.43±0.14 mg/kg、47.80 ±8.08mg/kg、20.86 ±0.71g/kg 和8.02±0.13。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用spss17.0 進(jìn)行顯著性分析，其中方差分析采用One-Way、ANOVA、Duncan 檢測(cè)法對(duì)各處理間數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，顯著性水平為P＜0.05，顯著性差異用不同的小寫(xiě)英文字母進(jìn)行標(biāo)示。圖表用Origin 8.0 繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 施加微生物菌劑對(duì)土壤中各形態(tài)鎘含量分布的影響

在盆栽煙草種植后120 d，土壤中各形態(tài)鎘含量的分布如圖1（A）所示。處理組S+WH16-1 與S相比，可交換態(tài)鎘及碳酸鹽結(jié)合態(tài)鎘的含量分別顯著降低了20.42 %、12.73 %（P＜0.05），鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)鎘的含量基本無(wú)變化，有機(jī)結(jié)合態(tài)鎘及殘?jiān)鼞B(tài)鎘分別顯著增加了38.88 %和32.34 %（P＜0.05）。處理組S+2Cd+WH16-1 與S+2Cd 相比，土壤中可交換態(tài)鎘顯著降低10.40%（P＜0.05），碳酸鹽結(jié)合態(tài)鎘降低7.81 %，鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)鎘、有機(jī)結(jié)合態(tài)鎘、殘?jiān)鼞B(tài)鎘分別增加19.60 %、22.76 %、27.20 %。其中，鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)鎘、殘?jiān)鼞B(tài)鎘含量的降低達(dá)到顯著水平（P＜0.05），這種修復(fù)效果與許多研究報(bào)道的結(jié)果相一致，證明通過(guò)添加修復(fù)劑改變土壤中重金屬的化學(xué)形態(tài)，可以改善土壤的理化性質(zhì)，減少對(duì)植物的毒害。

圖1 細(xì)菌對(duì)盆栽（A）及大田（B）土壤中Cd 的形態(tài)的分布影響

處理組S+6Cd+WH16-1 與S+6Cd 相比，施加菌劑WH16-1 使土壤中可交換態(tài)鎘降低1.14 %，碳酸鹽結(jié)合態(tài)鎘顯著降低7.55 %（P＜0.05），鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)鎘、有機(jī)結(jié)合態(tài)鎘、殘?jiān)鼞B(tài)鎘分別增加3.02%、28.20 %、19.20 %。結(jié)果表明，菌劑WH16-1 對(duì)高濃度鎘污染土壤的修復(fù)效果不如對(duì)低濃度鎘污染土壤的。細(xì)菌WH16-1 對(duì)Cd 的最大抗性為9 mg/L，高濃度鎘抑制了其生長(zhǎng)。因此，該細(xì)菌產(chǎn)生的H2S 少，不利于CdS 的生成。而該細(xì)菌及其分泌物的表面官能團(tuán)少，也不利于其與Cd 發(fā)生絡(luò)合固定。

2.2 施加微生物菌劑對(duì)植物農(nóng)藝性狀的影響

盆栽煙草和大田煙草的株高及生物量結(jié)果如圖2 所示。對(duì)比圖2（A）和圖2（C）中對(duì)照組S 與加菌組S+WH16-1 發(fā)現(xiàn)，加菌后株高顯著增加14.77 %（P＜0.05），生物量增加11.99 %；處理組S+2Cd+WH16-1 與S+2Cd 相比，加菌組的株高及生物量分別顯著增加12.13 %、14.77 %（P＜0.05）；處理組S+6Cd+WH16-1 與S+6Cd 相比，加菌組株高及生物量分別增加10.83 %、4.44 %。

圖2 菌劑WH16-1 對(duì)煙草成熟期株高及生物量的影響

從圖2（B）和圖2（D）中可以看出，不加菌不加鎘處理的對(duì)照組（S）的生物量及株高均不如實(shí)驗(yàn)組。處理組S+2Cd 與加菌處理組S+2Cd+WH16-1 相比，加菌后煙草株高增加3.92 %，生物量顯著增加9.23%（P＜0.05）。

2.3 施加微生物菌劑對(duì)植物體內(nèi)鎘含量的影響

在盆栽和大田煙草成熟期（90 d 和120 d）分別取煙草樣品，其不同部位的鎘含量如圖3，只加鎘處理組中煙草根、莖、葉及總鎘的含量相對(duì)于不加鎘的空白對(duì)照組均有所增加。

圖3 菌劑WH16-1 對(duì)煙草各部位鎘含量的影響

從圖3（A）中可以，看出120 d 時(shí)，不加鎘的對(duì)照組S 中煙草根、莖、葉中的鎘含量分別為114 μg/kg、81 μg/kg、75 μg/kg，處理組S+WH16-1 中各部位的鎘含量分別為100 μg/kg、76 μg/kg、48 μg/kg，相對(duì)于不加菌的對(duì)照組分別降低12.28 %、6.17 %、18.52 %；處理組S+2Cd 中各部位的鎘含量分別為331 μg/kg、118 μg/kg、102 μg/kg，處理組S+2Cd+WH16-1 中各部位的鎘含量分別為167 μg/kg、86 μg/kg、48 μg/kg，相對(duì)于只加鎘的對(duì)照組分別顯著減少49.54 %、27.12 %、52.94 %；處理組S+6Cd 中各部位的鎘含量分別為710 μg/kg、202 μg/kg、150 μg/kg，處理組S+6Cd+WH16-1 中各部位的鎘含量分別為603 μg/kg、185 μg/kg、85 μg/kg，相對(duì)于只加鎘的對(duì)照組依次減少16.07 %、8.42 %、43.33 %。加菌處理后葉片中的鎘含量均降到煙葉中鎘含量的允許標(biāo)準(zhǔn)（0.2 mg/kg）以下，且均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

據(jù)3（B）可知，土壤中外源添加鎘后，植株各部位對(duì)鎘的吸收均有所增加。

上述結(jié)果表明，土壤中的鎘污染越嚴(yán)重，煙草對(duì)鎘的吸收越多；煙草中的鎘含量為根＞莖＞葉；添加菌劑WH16-1 可以減少煙草對(duì)鎘的吸收。

2.4 施加微生物菌劑對(duì)煙草植物體內(nèi)酶活的影響

盆栽煙草120 d 葉片酶活測(cè)定結(jié)果如圖4（A）所示。對(duì)照組S 與加菌組S+WH16-1 相比，添加菌劑WH16-1 葉片中的葉綠素（Chl）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）分別增加6.94 %、25 %、23.96 %，戊二醛（MDA）含量顯著降低44.52%（P＜0.05）。處理組S+2Cd+WH16-1 與S+2Cd 相比，添加菌劑WH16-1 后過(guò)氧化氫酶顯著增加42.86 %（P＜0.05），葉綠素和超氧化物歧化酶略增加6.45 %和8.75 %，戊二醛僅降低2.35 %。處理組S+6Cd+WH16-1 與S+6Cd 相比，超氧化物歧化酶顯著增加78.98 %（P＜0.05），葉綠素和過(guò)氧化氫酶略增加19.61 %和4.55 %，丙二醛降低4.65 %（P＜0.05）。

圖4 煙草成熟期植物葉部酶活的比較（A，盆栽；B，大田）

對(duì)比圖4（B）中處理組S+2Cd+WH16-1 與S+2Cd 發(fā)現(xiàn)，施加菌劑WH16-1 后，葉片中葉綠素含量顯著增加32 %（P＜0.05），過(guò)氧化氫酶活性增加1.86%，丙二醛含量降低19.46 %。

相比于對(duì)照組，加入菌劑WH16-1 后，煙草中丙二醛含量降低，說(shuō)明煙草細(xì)胞膜受到傷害少。超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶都是幫助植物抵抗膜脂過(guò)氧化的重要保護(hù)酶，它們組成了一個(gè)有效的活性氧自由基清除系統(tǒng)，能夠快速清除活性氧，降低植物在逆境條件下的受損程度。菌劑WH16-1 的加入改變了土壤中鎘的化學(xué)形態(tài)，減少了能夠被植物直接利用的鎘的濃度，煙草受低有效態(tài)鎘的影響，清除活性氧的酶系統(tǒng)活性增強(qiáng)，有關(guān)酶濃度變大，用以清除鎘脅迫下煙草植株內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)多的活性氧，減少細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化使MAD 濃度降低，緩解了Cd 脅迫對(duì)煙草的毒害作用。此外，菌劑WH16-1 的加入使煙草中的葉綠素含量升高，不僅有利于煙草的光合作用，也提升了其生物量。

3 結(jié)論

在鎘污染土壤中施加硫酸鹽還原菌WH16-1不僅降低了土壤中交換態(tài)鎘和碳酸鹽結(jié)合態(tài)鎘的含量，增加了鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)鎘、有機(jī)結(jié)合態(tài)鎘和殘?jiān)鼞B(tài)鎘的含量，還有效固定了土壤中的鎘，降低土壤中鎘的生物有效性；同時(shí)，增加了煙草的生物量，減少了其根莖葉對(duì)鎘的吸收，降低了煙葉中的鎘含量。