楊秀茳，李 東，孫廷麗，劉麗瑜，鄧小鋒，劉永龍*

1.廣東迪美生物技術(shù)有限公司,廣東省防霉抗菌工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510535；2.廣東省科學(xué)院微生物研究所，廣東省微生物分析檢測(cè)中心，華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070

洗滌劑生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，一般在非潔凈環(huán)境下進(jìn)行生產(chǎn)，容易在生產(chǎn)過(guò)程中引入微生物，從而形成產(chǎn)品污染風(fēng)險(xiǎn)。廣東省3—5月份氣溫回暖，空氣濕度大，非常適宜微生物的生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)品污染的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)增加。因此，加強(qiáng)對(duì)生產(chǎn)環(huán)境、原材料和生產(chǎn)設(shè)備的清潔并進(jìn)行微生物控制以減少產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中的污染是洗滌劑生產(chǎn)過(guò)程中非常重要的環(huán)節(jié)。為獲取微生物分布的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)、幫助工廠識(shí)別微生物風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)并評(píng)價(jià)防腐體系的有效性，本文對(duì)廣東省某洗滌劑廠3—5月的生產(chǎn)環(huán)境和生產(chǎn)過(guò)程中的微生物風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了采樣分析，對(duì)污染風(fēng)險(xiǎn)菌進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定并對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行了防腐功效測(cè)試。通過(guò)調(diào)查研究，可以掌握生產(chǎn)環(huán)境中的微生物分布狀況，幫助工廠識(shí)別污染風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)和潛在污染源，避免因大面積污染引起的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)損失，同時(shí)為污染產(chǎn)品的溯源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

微生物培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）、沙氏瓊脂培養(yǎng)基（SDA），購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)菌株：銅綠假單胞菌（Pseudomonas aerugimosa）ATCC 9027、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC 8739、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538、 洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacian）ATCC 25416、日溝維腸桿菌（Enterobacter gergoviae）ATCC 33028、白假絲酵母（Candida albicans）ATCC 10231、黑曲霉（Aspergillus niger）ATCC 16404、平滑正青霉（Eupenicillium levitum）ATCC 10464，購(gòu)于廣東省微生物菌種保藏中心；DNA 快速提取試劑盒（D7113-01），購(gòu)于Magen 公司；防腐劑CJ-2，由廣東迪美生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 儀器

環(huán)凱HKM-II 型空氣浮游菌采樣器（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；滅菌鍋（LDZF-75KB-Ⅱ）；生化培養(yǎng)箱（SHP-250）；超凈工作臺(tái)（HDL APPARATUS）；基因擴(kuò)增儀（ETC 811）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生產(chǎn)環(huán)境采樣方法

3—5月份按每月一次的頻率分別對(duì)某洗滌劑廠的空氣、水樣、原材料、設(shè)備表面和包裝材料進(jìn)行采樣檢測(cè)。生產(chǎn)環(huán)境的空氣參照《GB 16293-2010 醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）浮游菌的測(cè)試方法》中的標(biāo)準(zhǔn)；生產(chǎn)用水參照《GB/T 5750.2-2006 生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法水樣的采集和保存》中的標(biāo)準(zhǔn)；設(shè)備表面和包裝材料采樣方法參照《GB 15979-2002 一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中的E2，采樣面積5.0 cm×5.0 cm；采樣結(jié)束后按照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）測(cè)定所采樣品的菌落總數(shù)[1-4]。

1.3.2 生產(chǎn)過(guò)程取樣方法

用無(wú)菌取樣瓶對(duì)生產(chǎn)過(guò)程的每一關(guān)鍵步驟重復(fù)取樣3 次，于當(dāng)天、第1 天和第5 天按照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）進(jìn)行菌落總數(shù)的檢測(cè)[4]。

1.3.3 菌種鑒定與最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

將采集到的樣品中分離得到的單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)后，按照DNA 提取試劑盒的說(shuō)明書提取污染菌總DNA，利用細(xì)菌的通用引物16sRNAF:5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’, 16sRNAR: 5’-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為: 預(yù)熱95℃，4 min，變性94 ℃，50 s，退火54 ℃，40 s，延伸72 ℃，1 min30 s，循環(huán)30 次，最后延伸72 ℃，10 min。對(duì)擴(kuò)增序列進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果通過(guò)BLAST 比對(duì)分析。同時(shí)參照《消毒技術(shù)規(guī)范》2.1.8.3 的瓊脂稀釋法對(duì)該洗滌劑廠所用防腐劑CJ-2 進(jìn)行最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定[5]。

1.3.4 生產(chǎn)成品的防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)

選擇兩個(gè)香型的5 個(gè)成品進(jìn)行防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)，試驗(yàn)方法參考美國(guó)材料實(shí)驗(yàn)協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)ASTM E640的防腐功效測(cè)試方法[6]。在測(cè)試過(guò)程中，每個(gè)成品分為三份：一份接種標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌（大腸埃希氏菌ATCC 8739、金黃色葡萄球菌ATCC 6538、銅綠假單胞菌ATCC 9027、洋蔥伯克霍爾德氏菌ATCC 25416、日溝維腸桿菌ATCC 33028），一份接種標(biāo)準(zhǔn)真菌（白假絲酵母ATCC 10231、黑曲霉ATCC 16404、平滑正青霉ATCC 10464），一份接種污染優(yōu)勢(shì)菌。

2 結(jié)果與討論

2.1 生產(chǎn)環(huán)境的采樣結(jié)果

2.1.1 空氣采樣結(jié)果

對(duì)該洗滌劑廠的12 個(gè)生產(chǎn)區(qū)域空氣中的浮游菌含量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。檢測(cè)結(jié)果顯示，12個(gè)采樣位點(diǎn)的空氣中均檢測(cè)到了浮游菌，特別是在乳化間和生產(chǎn)車間，分別在4月份和5月份檢測(cè)到了較多的浮游菌，分別為2 010 CFU/m3和2 030 CFU/m3，其余位點(diǎn)檢測(cè)到的浮游菌總數(shù)均＜1 000 CFU/m3。參考《化妝品生產(chǎn)企業(yè)衛(wèi)生規(guī)范》對(duì)生產(chǎn)過(guò)程中的空氣質(zhì)量進(jìn)行評(píng)判，結(jié)果表明，制水間、打料間、灌裝間和儲(chǔ)罐區(qū)的空氣質(zhì)量均合格，乳化間和生產(chǎn)車間的空氣質(zhì)量分別在4月份和5月份檢測(cè)為不合格，存在微生物污染風(fēng)險(xiǎn)。建議對(duì)兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)的空氣進(jìn)行紫外燈照射或噴灑霧化消毒劑消毒，并監(jiān)測(cè)消毒效果[7]。

表1 空氣中的浮游菌總數(shù)單位：CFU/m3

2.1.2 水樣采樣結(jié)果

對(duì)該洗滌劑廠的生產(chǎn)用水、過(guò)濾膜后水、水儲(chǔ)缸水和打料水進(jìn)行采樣檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，3月份有5 個(gè)水樣的微生物菌落檢出量在102～103CFU/mL 之間，4月份有2 個(gè)水樣的微生物菌落檢出量在104～105CFU/mL 之間，5月份有3 個(gè)水樣的微生物菌落檢出量在104～105CFU/mL 之間。參考《化妝品生產(chǎn)企業(yè)衛(wèi)生規(guī)范》，生產(chǎn)用水的水質(zhì)應(yīng)達(dá)到《國(guó)家生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB5749-2006）的要求（pH 除外），即菌落總數(shù)應(yīng)小于100 CFU/mL，3 個(gè)月份的水樣均存在超標(biāo)現(xiàn)象，3月份的超標(biāo)率較高，達(dá)62%，4月份和5月份超標(biāo)率較低，分別為25%和38%。從檢測(cè)結(jié)果可知，該洗滌劑廠的生產(chǎn)用水存在較大的污染風(fēng)險(xiǎn)，建議加強(qiáng)對(duì)水質(zhì)衛(wèi)生的監(jiān)管，交替使用二氧化氯和次氯酸鈉進(jìn)行定期消毒并監(jiān)測(cè)消毒效果。

表2 生產(chǎn)用水中的微生物檢測(cè)結(jié)果單位：CFU/mL

2.1.3 設(shè)備表面采樣結(jié)果

對(duì)生產(chǎn)設(shè)備的打料缸、配料罐、灌裝線和儲(chǔ)罐的表面進(jìn)行采樣檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。檢測(cè)結(jié)果顯示，10個(gè)采樣位點(diǎn)連續(xù)3 個(gè)月未檢出微生物，說(shuō)明該洗滌劑廠生產(chǎn)設(shè)備表面的衛(wèi)生狀況良好，污染風(fēng)險(xiǎn)低。

表3 生產(chǎn)設(shè)備表面微生物總數(shù) 單位：CFU/樣本

2.1.4 原材料與包裝瓶采樣結(jié)果

檢測(cè)了3 個(gè)批次的生產(chǎn)原材料和包裝瓶，見(jiàn)表4。檢測(cè)結(jié)果顯示，15 個(gè)采樣位點(diǎn)均未檢出微生物，說(shuō)明該洗滌劑廠原材料和包裝瓶的衛(wèi)生狀況良好，污染風(fēng)險(xiǎn)低。

表4 生產(chǎn)原材料和包裝瓶微生物總數(shù)單位：CFU·g-1（原材料）或CFU/樣本（包裝瓶）

2.2 生產(chǎn)過(guò)程取樣結(jié)果

為找到生產(chǎn)過(guò)程中容易引入污染的步驟，從源頭控制產(chǎn)品質(zhì)量以避免出現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)兩種香型的洗滌劑生產(chǎn)過(guò)程中的每個(gè)步驟分別進(jìn)行了3 次取樣檢測(cè)，分析生產(chǎn)過(guò)程中的污染風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)及易感微生物，微生物檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5 和表6。

通過(guò)表5 和表6 的數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)兩種香型的洗滌劑產(chǎn)品在加入活性物和助劑的步驟中檢測(cè)到微生物，且在放置1 d 和5 d 后的復(fù)檢中，微生物呈現(xiàn)迅速繁殖的趨勢(shì)。這說(shuō)明在產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中，特別是在上述步驟中存在較高的微生物污染風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，結(jié)果也提示，在非無(wú)菌生產(chǎn)的條件下，兩種香型的配方體系都易受到微生物的影響，因此在生產(chǎn)當(dāng)天需采取有效的防腐措施，以預(yù)防微生物在產(chǎn)品中增殖。結(jié)合空氣中偶有微生物超標(biāo)和芽孢檢出、水樣檢測(cè)中頻繁有菌的情況，分析該污染風(fēng)險(xiǎn)可能來(lái)源于生產(chǎn)用水、生產(chǎn)罐、生產(chǎn)器具、中轉(zhuǎn)器具、環(huán)境或操作因素，需要加強(qiáng)對(duì)生產(chǎn)用水和生產(chǎn)環(huán)境的消毒控制，同時(shí)加強(qiáng)對(duì)生產(chǎn)過(guò)程中微生物風(fēng)險(xiǎn)的控制。

2.3 防腐劑及防腐體系的有效性驗(yàn)證

對(duì)取樣檢出的微生物進(jìn)行了菌種鑒定和MIC測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表7。研究發(fā)現(xiàn)，從風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)共檢出25 株細(xì)菌，其中肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌為優(yōu)勢(shì)菌種，分別有9 株和7 株，其余菌種包括煙草腸桿菌3株、無(wú)丙二酸檸檬酸桿菌3 株以及粘質(zhì)沙雷氏菌、食二氮植物桿菌和銅綠假單胞菌各1 株。有趣的是，所有檢測(cè)到的菌株對(duì)洗滌劑廠所用防腐劑CJ-2 的平均MIC 值均＜0.01%。這一結(jié)果表明，該防腐劑在該洗滌劑中表現(xiàn)出高效抑菌活性，且遠(yuǎn)低于建議使用量的0.05%～0.1%。因此可以得出結(jié)論，環(huán)境中的微生物對(duì)該防腐劑在該洗滌劑中未表現(xiàn)出耐藥性，顯示出了該防腐劑在維持產(chǎn)品品質(zhì)和生產(chǎn)環(huán)境衛(wèi)生方面的有效性。

表7 微生物種群鑒定及平均MIC 值

為驗(yàn)證防腐體系對(duì)微生物，尤其是環(huán)境中的風(fēng)險(xiǎn)微生物的有效性，我們進(jìn)行了防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)，選擇香型Ⅰ洗滌劑的3 個(gè)產(chǎn)品和香型Ⅱ洗滌劑的2 個(gè)產(chǎn)品進(jìn)行測(cè)試，具體結(jié)果見(jiàn)表8。試驗(yàn)結(jié)果表明，這5個(gè)產(chǎn)品在面對(duì)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌、標(biāo)準(zhǔn)真菌和優(yōu)勢(shì)菌（肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌）的挑戰(zhàn)中，均通過(guò)了測(cè)試。在添加菌液3 d 后，微生物數(shù)量迅速下降至未檢出水平，并在接下來(lái)的28 d 內(nèi)持續(xù)保持未檢出狀態(tài)。這說(shuō)明目前工廠采用的防腐體系能夠有效地抵御微生物的侵襲，雖然在生產(chǎn)過(guò)程中可能會(huì)引入少量微生物，但通過(guò)在生產(chǎn)當(dāng)天立即添加殺菌劑和防腐劑，可以有效殺滅引入的微生物。因此，正確使用防腐劑及防腐體系可以有效控制并降低產(chǎn)品產(chǎn)生繼發(fā)性污染的風(fēng)險(xiǎn)。

表8 兩種香型生產(chǎn)成品挑戰(zhàn)試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

該洗滌劑廠對(duì)生產(chǎn)設(shè)備、原材料和包裝材料的微生物污染控制得較好，在微生物檢測(cè)中均未檢出，對(duì)產(chǎn)品的污染風(fēng)險(xiǎn)較低；對(duì)空氣和生產(chǎn)用水的微生物污染控制較差，空氣檢測(cè)在4月份和5月份存在超標(biāo)現(xiàn)象，對(duì)產(chǎn)品存在潛在威脅。水樣中檢測(cè)出較多的微生物，3 個(gè)月份的抽檢中均存在超標(biāo)現(xiàn)象，檢出量在102～105CFU/mL 之間。水是生產(chǎn)洗滌劑的重要原材料，也是微生物生存繁殖的必要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，生產(chǎn)用水中的微生物會(huì)直接進(jìn)入產(chǎn)品且在營(yíng)養(yǎng)豐富的產(chǎn)品中快速繁殖，對(duì)產(chǎn)品有直接污染的風(fēng)險(xiǎn)。因此，要加強(qiáng)對(duì)生產(chǎn)用水的微生物控制。對(duì)生產(chǎn)過(guò)程中每一關(guān)鍵步驟的取樣檢測(cè)結(jié)果顯示，生產(chǎn)過(guò)程中的風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)在于加入活性物和助劑的步驟，應(yīng)重點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行控制。從風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)分離鑒定的菌種主要是腸桿菌科的菌種，其中優(yōu)勢(shì)菌為肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌，兩者均為條件致病菌，多引發(fā)醫(yī)源性感染，臨床上對(duì)抗生素的耐藥性日趨嚴(yán)重[8-13]。文獻(xiàn)資料顯示，日化用品中也常有肺炎克雷伯氏菌檢出[14-16]，陰溝腸桿菌則較少檢出[17]，兩種菌株均未見(jiàn)對(duì)日化常用防腐劑產(chǎn)生耐藥性的報(bào)道。檢出菌種對(duì)該洗滌劑廠所用防腐劑CJ-2 的MIC 值均＜0.01%，低于實(shí)際添加量。對(duì)5 個(gè)生產(chǎn)成品進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)菌株和優(yōu)勢(shì)風(fēng)險(xiǎn)菌株的防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)，結(jié)果均通過(guò)了挑戰(zhàn)，結(jié)合生產(chǎn)過(guò)程的結(jié)果進(jìn)行分析，說(shuō)明所添加防腐劑的防腐性能良好，可有效防御微生物污染。因此，建議工廠定期開(kāi)展微生物檢測(cè)工作，合理有效地采取消毒預(yù)防措施并添加防腐劑，建立有效的防腐體系，全方位控制微生物污染，以減少微生物污染帶來(lái)的危害和損失。